معلومة

ما الذي يسبب انحراف الممرات في تجربة الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي؟


في الرحلان الكهربائي للهلام ، ما الذي يسبب تأثيرات مثل هذه (انظر العمود 11 في الأول ، والعمود 6 في الثاني)؟

(كانت هذه الصور عينات أخذتها من نشاط عبر الإنترنت قمنا به للفصل الدراسي)


هذه هي مواد هلامية متسلسلة (في الحالات هنا حتى المواد المشعة) - يتم تشغيلها لفترة أطول بكثير من المواد الهلامية من مادة الاغاروز العادية وهي مصنوعة من بولي أكريلاميد. من واقع خبرتي ، فإن السبب الأكثر احتمالًا لانحراف الممرات (ليس فقط العصابات) هي العينات ، التي لا تزال تحتوي على الكثير من الأملاح من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن أن يحدث هذا أيضًا لعدد قليل من النطاقات كما هو موضح هنا. بشكل عام ، لا تزال هذه المواد الهلامية لطيفة جدًا ونظيفة ، لقد رأيت أسوأ من ذلك بكثير.

الأسباب الأخرى التي تتسبب في عدم تساوي المواد الهلامية هي الحالات التي لا يتم فيها خلط مادة الأكريلاميد جيدًا بما فيه الكفاية (مما يتسبب في اختلاف تركيز الهلام وبالتالي تسبب ظروف تشغيل مختلفة) ، والاحترار غير المتكافئ (على الرغم من أن هذا كان يمنع عادةً بواسطة نظام تسخين الهلام) والمواد الهلامية المتسربة حيث لم يكن المجال الكهربائي متساويًا تمامًا.


اقتراح @ Chris ممكن جدًا ، حيث يظهر ارتفاع الملح بشكل مميز في نهاية الجل. لكن هناك مشتبه بهم إضافيون. هذا يبدو وكأنه مجرد هلام الاغاروز ، صحيح؟ لقد رأيت بعض الأشياء التي تتسبب في ذلك ، بما في ذلك عدم استواء الجل ، وتحول الجل أثناء تشغيله ، ونسبة عدم انتظام الاغاروز وارتفاع درجة الحرارة نحو النهاية. إذا قمت بذلك مرة أخرى راقب التيار الكهربائي الخاص بك خلال الساعة الثانية أو نحو ذلك.

لكن أولاً ، حاول إجراء تنظيف سريع لـ PCR على عمود (تأكد من الحصول على واحد لا يفقد الأجزاء الصغيرة) أو بدلاً من ذلك ، فإن استخراج الفينول متبوعًا بترسيب ETOH سينقي رد فعلك ؛ وستكون القوة معك.


أساسيات الرحلان الكهربائي للهلام

الغرض من الرحلان الكهربائي للهلام أو & # 8220 تشغيل هلام & # 8221 هو تصور ما إذا كان استخراج الحمض النووي الخاص بك و / أو تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحق يعمل بالفعل أم لا. على الرغم من أنه من المفترض أن يؤدي PCR إلى تضخيم منتج نقي واحد فقط ، إلا أن الحقيقة هي أنك ستنتهي بمزيج من البادئات (البرايمر التي ترتبط ببعضها البعض بدلاً من حبلا القالب) وشظايا غير صحيحة بالإضافة إلى المنتج الذي تريده. يستخدم الرحلان الكهربائي للهلام لفرز شظايا الحمض النووي حسب الحجم (عدد أزواج القاعدة). من خلال مقارنة منتجات PCR بـ & # 8220ladder & # 8221 أو مجموعة من أطوال زوج القاعدة القياسي المعروف ، يمكنك تقدير طول الأجزاء من PCR الخاص بك والبحث عن منتج يتوافق مع حجم المنتج الذي كنت تحاول تضخيمه.

ماذا تحتاج
للقيام بالرحلان الكهربائي للهلام ، سوف تحتاج إلى العناصر التالية:

  1. جهاز جل: هذه قطعة متخصصة من المعدات لصب الجل والقيام بالرحلان الكهربي.
  2. منتج PCR: هذا هو خليط أجزاء الحمض النووي التي تريد فرزها.
  3. سلم الحمض النووي: محلول من جزيئات الحمض النووي متفاوتة الطول يستخدم كمرجع للحجم.
  4. العازلة: تستخدم لتكوين الجل ، وتحافظ على الرقم الهيدروجيني ، وتحتوي على الأيونات اللازمة لحمل الشحنة الكهربائية.
  5. هلام الاغاروز: هو نوع من الجيلاتين من الأعشاب البحرية يفصل أجزاء الحمض النووي.
  6. صبغة التحميل: تُضاف هذه الصبغة إلى عينة الحمض النووي لتسهيل التعامل معها.
  7. صبغة الحمض النووي: ترتبط هذه الصبغة بالحمض النووي بحيث يمكن رؤية العصابات في الضوء العابر. تشمل الأمثلة SYBR Green و SYBR Safe و Ethidium Bromide و Fast Blast.
  8. ضوء Transilluminator: ينتج هذا الجهاز ضوءًا فوق البنفسجي أو أزرق أو أبيض مما يجعل بقعة الحمض النووي (DNA) تتوهج. تتطابق مصادر الضوء المختلفة مع البقع المختلفة.

كيف يعمل؟
تحمل جزيئات الحمض النووي شحنة سالبة شاملة. نظرًا لأن الأضداد تجتذب ، فإن الحمض النووي ينجذب إلى الشحنات الموجبة ، وفي هذه الحالة ، القطب (+) في منصة الهلام. للوصول إلى القطب الكهربائي (+) ، يجب أن ينتقل الحمض النووي عبر صفيحة من هلام الاغاروز. القطع الصغيرة قادرة على الانتقال عبر الجل أسرع من القطع الطويلة. تتحرك أجزاء من نفس الطول بنفس السرعة وتشكل شرائط واضحة في الهلام.

عند الانتهاء من تشغيل الجل ، يتم نقعه في بقعة DNA ، وهي مادة كيميائية تقوم بأمرين: 1) الارتباط بالحمض النووي المزدوج الشريطة و 2) التوهج تحت الضوء فوق البنفسجي أو الأزرق أو الأبيض.
يجب أن تبدو صورة الهلام الناتجة كما يلي:

لاحظ أن هناك 6 ممرات على هذا الجل. يحتوي الممران 1 و 6 على سلم يستخدم كمرجع للقياس. يوجد منتج DNA أو PCR في الممرات 2-5 مع وجود نطاقات ناتجة في الممرات 2-4. لاحظ أيضًا أن تدفق الكهرباء من السالب إلى الموجب.


عصابات مشرقة للغاية في آبار هلام الاغاروز PCR - العصابات الساطعة والحادة في بئر هلام PCR (27 فبراير 2005)

بعد تشغيل الجل عند 80 فولت لمدة 40 دقيقة ، أرى ذلك عصابات حادة ومشرقة حقًا في الآبار من هلام PCR الخاص بي. هناك مسحة تتبع ذلك الشريط اللامع من البئر على طول الطريق إلى نهاية الممر. في بعض الممرات المحملة بنفس العينات ، أرى نطاق الاهتمام بالوزن الجزيئي الدقيق الذي أريده ، لكن ما زلت أرى هذه النطاقات الحادة في الآبار حتى في هذه الممرات أيضًا. أنا لا أرى هذه الفرقة في العلامة محملة بشكل جيد. هل يمكن لأي شخص أن يقدم أي اقتراح حول كيفية التغلب على هذه المشكلة؟ في تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بي أستخدم مستويات عالية من المغنيسيوم + 2. هل هذا هو السبب؟

ماذا تدل هذه العصابات؟ هل التركيزات العالية أو المنخفضة لأي مادة كيميائية يمكن أن تسبب هذا؟ هل يجب أن أضيف أي شيء في مزيج PCR.

أستخدم الاستلام التالي لـ PCR:

المخزن المؤقت للتضخيم 10x (النيتروجين) 2 ميكرول
MgSo4 (2.5 ملي انيتروجين) 3 ميكرول
10 مللي متر dNTP 1 ميكرول
برايمر إف 1 ميكرول
برايمر آر 1 ميكرول
كدنا 1.5 ميكرول
Taq pfx (50mM invitrogen) 0.4 ميكرول
ddH20 10.1 مايكرول

من فضلك أعطني أي نوع من النصائح.
شكرا لك مقدما.

هو قالب (كدنا) الخاص بك من البلازميد؟ في كثير من الأحيان ، إذا تم استخدام الكثير من البلازميد ، فإنه يتسبب في حدوث عصابة على مستوى عالٍ ، ولكن لم يسبق رؤيتها في البئر. ما هو التركيز الكثير من النماذج ليس بالأمر الجيد أبدًا.

هل ترى الفرقة في سيطرتك السلبية؟
على الأرجح أنها تلوث.

المستويات العالية من المغنيسيوم عادة ما تسبب تضخيم غير محدد. ولكن إذا كنت & # 39 لا تحصل على الكثير من الفرق الموسيقية التي تعني FA الحلو ، فلا تقلق بشأن ذلك.
لن & # 39t أعتقد أنه من شأنه أن يسبب ما تراه.

شكرا على الرد. أنا لا أستخدم البلازميدات. الحمض النووي الريبي الخاص بي من عينات أنسجة الرئة. لا أعتقد أنها مشكلة تلوث. لأن المشكلة تحدث من حين لآخر وليس في كل مرة أقوم بتشغيل الجل. عندما تسير الأمور بشكل صحيح ، لا أحصل على خلفية مع مجموعات الاهتمام الموجودة بالضبط في نفس الموضع الذي أريده. لا نطاقات إضافية على الإطلاق. لكن هذه المشكلة تظهر في أوقات أخرى. هذا يعني أن الفرص هي 50:50. على حد علمي ، أنا متسق مع الكواشف والبروتوكول الذي أستخدمه لجميع التجارب الجيدة والسيئة. لا يمكنني فهم سبب المشكلة. كيف يمكن أن يعلق منتج PCR في البئر؟ ما زلت أحصل على فرقتي التي تهمني عندما يكون المنتج عالقًا في البئر ، لكن ليس بهذه الشدة كما كنت سأحصل على خلاف ذلك. هذا يعني أن منتجي عالق أيضًا في البئر. ما الذي يمكن أن يوقف تدفق منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل عبر الجل؟ وأيضًا أرى هذه المشكلة في الضوابط السلبية أيضًا.

لقد نسيت أن أذكر أنني أقوم بالفعل بعمل RT-PCR ومن ثم فإن القالب الخاص بي هو cDNA. هل يمكن أن يكون هناك أي خطأ في cDNAs الخاص بي؟

أعتقد أن نقطة vetticus & # 39s هي أنه قد يكون لديك الكثير من المواد الأولية لـ RT-PCR. أظن أن الفرقة التي تراها في البئر أو بالقرب منها قد تم نقلها في الواقع من قالب DNA لرد فعلك. يمكنك محاولة تمييع قالب الحمض النووي ومعرفة ما سيحدث بعد ذلك.

الاحتمال الآخر هو أن عينتك علقت في البئر ولم تهاجر على الإطلاق. حاول استخدام الجل الطازج والعازل الطازج.

أنظر فوق:
مُثبَّت: تلطيخ على مادة هلامية.

شكرا لكم جميعا على الردود الخاصة بك. تم حل مشكلتي بعد أن قمت بتغيير ملف Taq من Pfx (invitrogen) إلى Taq - Qiagen. أنا لا أعرف السبب وراء ذلك. هذا هو التغيير الوحيد الذي قمت به هذه المرة. لقد قمت بعمل PCR اليوم وكل شيء سار على ما يرام. لم أر أي بئر في الجل عالق مع منتج PCR. شكرا مرة اخرى.

هذا يبدو وكأنه حل غير مرجح إلى حد ما. مرة واحدة ، تلوث الجلسرين المستخدم في عازلة التحميل لدينا ونمت البكتيريا / العفن. شكل الحمض النووي في منتج PCR / البلازميد معقدات من البروتينات وغيرها من الخردة الميكروبيولوجية ، وتم تلطيخها على طول الطريق من الآبار.
في تجربتك الأخيرة ، هل استخدمت مخزن تحميل مؤقت جديد؟

عزيزي WB9547 ، نجد أن الكتاب & quotMolecular Systematics، 2nd Ed. & quot الذي تم تحريره بواسطة Hillis و Moritz و Mable ليكون مفيدًا حقًا لـ PCR والإجراءات ذات الصلة المستخدمة في مختبرنا. في الصفحة. 231 من هذا الكتاب ، تم ذكر المشكلة التي وصفتها مع الحلول المحتملة.

& quot المشكلة: العصابات اللامعة في بئر هلام الاغاروز عقب الرحلان الكهربائي [لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل].
العلاج المحتمل: تنتج هذه النطاقات عادةً عن التضخيم المفرط لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل أو عن التخفيف غير الكافي للمنتج قبل الرحلان الكهربي. هذه أيضًا نتيجة شائعة للتضخمات الناتجة عن الكثير من الحمض النووي الجيني. جرب تمييع النموذج من 100 إلى 1000 ضعف. & quot

مذكور أيضًا في هذه الصفحة نفسها اقتراح استخدام قالب أقل (الإصلاح نفسه) للقضاء على الحمض النووي وتقليص الاقتباس ومثل في الجل الخاص بك.

ومن المثير للاهتمام أننا نواجه مشكلة متقطعة مماثلة في مختبرنا ، عندما نرى أحيانًا الحمض النووي المتوهج اللامع في آبار هلام الاغاروز. نحن نستخدم Qiagen Taq ونحن سعداء عمومًا بنتائج PCR التي نحصل عليها ، لكننا لم نكتشف متى لا يزال هذا يحدث أحيانًا. ربما يساعدك التمرير أعلاه ، على الرغم من ذلك ، إذا كنت لا تزال تواجه المشكلة التي وصفتها بين الحين والآخر.


مشكلة تحميل الحمض النووي / هلام الاغاروز - (21 أبريل 2011)

لقد واجهت مشاكل عند تحميل الحمض النووي في آبار هلام طويل الاغاروز. لا يوجد سوى ما يكفي من المخزن المؤقت (TAE) أعلى الجل لتغطيته ، ولأغراض الجودة ، من المفترض أن يتم نقع الجل.
لذلك لدي عينات من الحمض النووي بصبغة تحميل ، وطرد مركزي لتجنب أي فقاعات ، ولا توجد فقاعات في الآبار. الحجم النهائي للعينة هو 18 ميكرولتر وهو ليس كثيرًا بالنسبة للآبار (أنا متأكد من أنها يمكن أن تحتوي على ضعف الكمية).
في بعض الأحيان عندما أقوم بتحميل العينة ، أخرج الماصة وبعد ثانية واحدة يخرج الحمض النووي من البئر كما لو أنه "امتص" وهذا يجعل الحمض النووي في البئر التالية ينسكب أيضًا & # 33

ليس لدي أي فكرة عما يحدث أو ما يمكن أن يكون سبب ذلك. هل يمكن أن يكون هناك ما يكفي من المخزن المؤقت أعلى الجل وأن الحركة التي تسببها الماصة تؤدي إلى الانسكاب؟

شكرا على أي مساعدة ، أفكار ، لعنات زائفة يمكن أن تقدمها & # 33

هل صنعت صبغة التحميل الخاصة بك؟ في بعض الأحيان لا يوجد ما يكفي أو لم تتم إضافة الجلسرين على الإطلاق إلى صبغة التحميل الخاصة بك مما يجعلها "تطفو".

لست متأكدًا من علاقة المخزن المؤقت بجودة الجل ، ولا أفهم سبب عدم غمر الجل.

قال Dr_Watson في الخميس 21 أبريل 15:45:43 2011:

واجهت مشاكل عند تحميل الحمض النووي في آبار هلام الاغاروز الطويل. لا يوجد سوى ما يكفي من المخزن المؤقت (TAE) أعلى الجل لتغطيته ، ولأغراض الجودة ، من المفترض أن يتم نقع الجل.
لذلك لدي عينات من الحمض النووي بصبغة تحميل ، وطرد مركزي لتجنب أي فقاعات ، ولا توجد فقاعات في الآبار. الحجم النهائي للعينة هو 18 ميكرولتر وهو ليس كثيرًا بالنسبة للآبار (أنا متأكد من أنها يمكن أن تحتوي على ضعف الكمية).
في بعض الأحيان عندما أقوم بتحميل العينة ، أخرج الماصة وبعد ثانية واحدة يخرج الحمض النووي من البئر كما لو أنه "امتص" وهذا يجعل الحمض النووي في البئر التالية ينسكب أيضًا & # 33

ليس لدي أي فكرة عما يحدث أو ما يمكن أن يكون سبب ذلك. هل يمكن أن يكون هناك ما يكفي من المخزن المؤقت أعلى الجل وأن الحركة التي تسببها الماصة تؤدي إلى الانسكاب؟

شكرا على أي مساعدة ، أفكار ، لعنات زائفة يمكن أن تقدمها & # 33


من الصعب معرفة ذلك دون رؤيتك تفعل ذلك.

يمكن أن يكون السبب على سبيل المثال هو أنك تضغط على الماصة أكثر من اللازم (ثم بعد ذلك "المحطة الأولى" ، مثل عندما تريد إفراغ الماصة تمامًا).

قد تكون المشكلة الأخرى أنك لا تضع الماصة في العمق الكافي .. قد يكون سببًا آخر هو أنك تضعها في أعماق كبيرة وتكسر الآبار.
أو أنك لا تستخدم صبغة تحميل كافية؟ راجع للشغل: لقد ذكرت أنك تقوم بالطرد المركزي للعينات مع صبغة التحميل ، ولكن عندما تستخدم الماصة لوضع عينتك في الجل ، هل تقوم الماصة بأعلى ولأسفل في الأنبوب قبل وضعها في البئر؟ (للتأكد من أن الصبغة تنتشر بشكل جيد في الأنبوب / حوض الحمض النووي؟


هل جربته باستخدام هلام مغطى أكثر (المزيد من المخزن المؤقت) وهل واجهتك المشكلة بعد ذلك؟ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد يكون السبب أنه لا يوجد ما يكفي من المخزن المؤقت وأن السائل يخرج للتو بسبب عدم وجود سوائل كافية تغطي البئر (وما تضعه فيه).

في بعض الأحيان يُعزى إلى بقايا الإيثانول في عينة الحمض النووي. ربما يجب أن تحاول تجفيف العينات مرة أخرى أو لفترة أطول.

هل صنعت صبغة التحميل الخاصة بك؟ في بعض الأحيان لا يوجد ما يكفي أو لم تتم إضافة الجلسرين على الإطلاق إلى صبغة التحميل الخاصة بك مما يجعلها "تطفو".

لست متأكدًا من علاقة المخزن المؤقت بجودة الجل ، ولا أفهم سبب عدم غمر الجل.

لم أقم بصنع صبغة التحميل ولكني أعرف ما بالداخل وهناك الجلسرين. يجب أن أضيف أنني استخدمت صبغة التحميل نفسها عدة مرات من قبل عند عمل مواد هلامية صغيرة منتظمة ، ولم أواجه أي مشكلة.
ليس لدي أي فكرة عن المخزن المؤقت ونوعية الجل ، ولكن هذا ما قاله رئيسي وبصراحة تامة لا يحب أن يتم استجوابه ، لذلك أفعل ذلك بهذه الطريقة. أعتقد أنه قال إنها إشارة إلى أن & # 39s أفضل أو شيء من هذا القبيل. على الرغم من أنني يجب أن أحاول نقعه تمامًا مرة واحدة فقط للتحقق.

يمكن أن يكون السبب على سبيل المثال هو أنك تضغط على الماصة أكثر من اللازم (ثم بعد ذلك "المحطة الأولى" ، مثل عندما تريد إفراغ الماصة تمامًا).

قد تكون المشكلة الأخرى أنك لا تضع الماصة في العمق الكافي .. قد يكون سببًا آخر هو أنك تضعها في أعماق كبيرة وتكسر الآبار.
أو أنك لا تستخدم صبغة تحميل كافية؟ راجع للشغل: ذكرت أنك تقوم بالطرد المركزي للعينات مع صبغة التحميل ، ولكن عندما تستخدم الماصة لوضع عينتك في الجل ، هل الماصة تصعد وتهبط في الأنبوب قبل وضعها في البئر؟ (للتأكد من أن الصبغة تنتشر بشكل جيد في الأنبوب / حوض الحمض النووي؟


هل جربته باستخدام هلام مغطى أكثر (المزيد من المخزن المؤقت) وهل واجهتك المشكلة بعد ذلك؟ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد يكون السبب أنه لا يوجد ما يكفي من المخزن المؤقت وأن السائل يخرج للتو بسبب عدم وجود سوائل كافية تغطي البئر (وما تضعه فيه).

حسنًا ، لقد فكرت بالفعل في ذلك (هذا بعيد كل البعد عن كونه أول جل يجب علي تحميله)
لذلك - لا أفرغ الماصة تمامًا (خائفًا من أي فقاعات قد تسبب مشكلة) ، مما يعني أنني لا أدفع أكثر بعد المحطة الأولى.
- أحاول ألا أعمق الماصة وإلا قد تثير نوع الحركة السائلة التي أرغب في تجنبها. لذلك وضعته في البئر ولكن في الجزء العلوي فقط لذلك لا تلمس العينة الموجودة في قاع البئر.
- صبغة التحميل من 6x إلى 15 ميكرولتر من الحمض النووي وأضيف 3 ميكرولتر من الصبغة. أقوم بخلط الصبغة مع الحمض النووي قبل الطرد المركزي ، والخلط بعد ذلك من شأنه أن يفسد الغرض (تجنب الفقاعات في العينة التي تحدث عندما تقوم بالمص لأعلى ولأسفل).

من المفترض أن نضع 100 مل فقط من المخزن المؤقت فوق الجل ، وأضيف أكثر من 200 مل أعتقد في المرة الأخيرة التي لم أواجه فيها أي مشاكل في التحميل عندما أضفت 300 مل من المخزن المؤقت. ولكن مرة أخرى عند تحميل عدة آبار على نفس الهلام مع عينات أعدت بنفس الطريقة ، وتحميلها بنفس الطريقة ، فإن بعضها سوف ينسكب البعض الآخر لن & # 39t ، على الرغم من أنه بمجرد أن يبدأ في إراقة جميع الأصدقاء حوله فقط تابع.

يجف مرة أخرى؟ لم يجفوا في المقام الأول. مجرد إعداد miniprep الأساسي باستخدام مجموعة حتى العمود. كما هو الحال دائمًا ، وكما قلت من قبل ، لم أواجه مشكلة مع المواد الهلامية الصغيرة.

قال Dr_Watson في الخميس 21 أبريل 16:38:14 2011:

- صبغة التحميل من 6x إلى 15 & # 181L من الحمض النووي وأضيف 3 & # 181L من الصبغة. أقوم بخلط الصبغة مع الحمض النووي قبل الطرد المركزي ، والخلط بعد ذلك من شأنه أن يفسد الغرض (تجنب الفقاعات في العينة التي تحدث عندما تقوم بالمص لأعلى ولأسفل).

إذا قمت بالطرد المركزي ، فستكون صبغة التحميل أكثر في الأسفل.
يمكنك بسهولة ماصة محتوى الأنبوب لأعلى ولأسفل دون التسبب في العديد من الفقاعات.
إذا لم تقم بذلك ، فمن المحتمل أن تضيع بعض الكمية (الجزء العلوي من الأنبوب) عند سحبها إلى الآبار.
يمكن أن تجعلك المعالجة الجيدة للماصة تخلطها دون التسبب في أي فقاعة & # 33

لا أعرف كيف تقوم بمص السائل من الأنبوب الخاص بك ، ضع إذا قمت بذلك عن طريق لصق الماصة في الأنبوب الموجود في الأسفل ، فسوف تقوم أولاً بامتصاص المحتوى الأثقل (مع الكثير من تحميل الحمض النووي) للأنبوب وليس كذلك ثقيل سيتم امتصاصه في النهاية وبالتالي سيتم وضعه في المرتبة الأولى في البئر.

إذا كان هناك سائل غير ثقيل جدًا في البئر وقمت بالضغط على الماصة لأسفل لتفريغ المواد الثقيلة ، يمكنك بالفعل فقد الحمض النووي الأقل ثقلًا .. لأنه يتم "دفعه" بواسطة المادة الأكثر ثقلاً.
+ ستفقد أيضًا جزءًا من صبغة التحميل لأن هذا موجود في الجزء العلوي من الماصة ولن يتم دفعه إلى البئر .. مما يتسبب في فقد الحمض النووي لـ (نظرًا لأن الحمض النووي يجب أن يكون ثقيلًا بدرجة كافية (مع الصبغة) ابق في البئر.)

أعلم أن هذا يبدو جنونيًا ولن يلعب سوى دور ثانوي ، لكنه يلعب دورًا.
أنا أتعامل هنا .. ولكن يمكن أن يلعب دورًا.


يعد خلط محتوى الأنبوب أمرًا ضروريًا للحصول على عينة حمض نووي مختلطة جيدة ..

راجع للشغل: أنت تقوم بالطرد المركزي للعينة ، لذلك يجب أن تكون قد رأيت هذا من قبل: أزرق داكن في أسفل الأنبوب وأكثر وضوحًا في الجزء العلوي؟

على أي حال: هذا هو الانتقاء وربما ليس مهمًا بالنسبة لك شرط أن لا أعرف كم من الوقت تقوم بتدوير عينتك. ولكن إذا قمت بعمل دوامة بهذه الطريقة ، فسترى ما وصفته عن اللون الأزرق الداكن في الأسفل والأكثر وضوحًا في الأعلى .. يجب عليك مزج العينات قبل وضعها على الجل. إذا لم يكن الأمر كذلك: فقد تفقد الحمض النووي + انظر إلى ما وصفته: ترك الصبغة الزرقاء الأكثر وضوحًا خارج الآبار لأن الصبغة الزرقاء الأغمق أثقلها يتم دفعها بعيدًا).

لأكون صادقًا معك دكتور واتسون ، لم أقوم مطلقًا بطرد عينات الحمض النووي الخاصة بي قبل التحميل على مادة هلامية.

في الماضي ، قمت بتشغيل PCR الخاص بي ، وأسقطت الصبغة على ورقة من البارافيلم ، ثم خلطت العينة على البارافيلم (إذا كانت هناك عينات قليلة) ، أو أسقطت الصبغة مباشرة في لوحة PCR ، ثم دفعتها لأسفل في العينة باستخدام متعدد القنوات وأمبير يتم تمريره لأعلى ولأسفل عدة مرات. الآن أستخدم GoGreen ، الذي يحتوي على صبغة ، بدلاً من المخزن المؤقت العادي 5X. ما عليك سوى سحب اللوحة من الدوار الحراري وتحميل الجل.

إذا كانت العينة تشكل "عمودًا" أثناء سحب الماصة ، فحاول رفع الماصة قليلاً وليس في البئر. إذا كنت & # 39 عميقة جدًا ، فأنت تدفع الماصة في اتجاه قاع البئر ، مما يؤدي إلى زيادة الضغط أثناء توزيع العينة التي يمكن أن تخرج من الطرف المحظور ، وتتسبب في خروج العينة أثناء الانسحاب. إذا كان هناك ما يكفي من الجلسرين في العينة ، فيمكنك إمساك الطرف فوق البئر وسوف ينزل مباشرة إلى أسفل. إذا طافت بعد التحميل ، تنطبق نصيحة Pito و Dr.H & # 39s. في بعض الأحيان ، قد يكون من المفيد التحليق لفترة أطول بالميكروثانية للتأكد من أن كل العينة قد تركت الحافة قبل الانسحاب. وإلا فقد تتخلف عن آخر عينة أثناء تحركك.

ليس مجنونًا على الإطلاق ، في هذه المرحلة ، أنا منفتح على أي اقتراحات
لذلك بعد الطرد المركزي ، لم يكن هناك مرحلتان ، وهو ما يعني كما قلت أن الصبغة في الأسفل وستحتاج إلى الخلط. لكن يمكنني أن أكون متأكدًا بنسبة 100٪ أنه مختلط جيدًا. ومع ذلك ، واجهت هذه المشكلة من قبل عند خلط الصبغة بالحمض النووي وبدون الطرد المركزي.

لم يكن لدي حتى قبل أسبوعين. ولأنه كان اقتراحًا تم تقديمه لحل مشكلة الانسكاب. من الواضح أنه لم يساعد كثيرًا.

لذا ، للاستئناف ، يجب أن أكون حريصًا بشأن خلط الصبغة جيدًا مع الحمض النووي ، والمصاصة وربما إضافة المزيد من المخزن المؤقت أعلى الجل.

سأقوم بفحصه الأسبوع المقبل وسأخبرك إذا كان مفيدًا.

أشكركم جميعًا على ردودكم وإذا فكرتم في أي شيء آخر ، فقط أخبروني

أتمنى لك عيد فصح سعيدًا ، أو بونيس باك أو أي عطلة نهاية أسبوع جيدة & # 33 & # 33

احتفظ بالمشط على مسافة 2-3 مم على الأقل من علبة الهلام. حتى لا ينتشر إلى الآبار الأخرى بسبب الفقاعات أو كسر البئر بسبب الانقلاب

شم رائحة الحمض النووي الخاص بك ومعرفة ما إذا كان هناك إيثانول فيه. وسيكون هذا أول توقعاتي.


أسامة بن لادن: علم نهايته

"الحمض النووي جزيء مشحون. وبالتالي ، فإن جزيئات الحمض النووي تتحرك عندما يتم تطبيق مجال كهربائي على سائل يتم إذابتها فيه. إذا كان السائل بسيطًا - مثل الماء الذي يحتوي على بعض الأملاح - فكل الحمض النووي تتحرك الجزيئات بنفس السرعة تقريبًا ، وفي ظل هذه الظروف ، من الصعب التمييز بين الفوارق الصغيرة في حركة أنواع مختلفة من الحمض النووي.

"إذا كان المحلول أقل سائلًا ، كما هو الحال في مادة هلامية ، وبدأت جزيئات الحمض النووي جميعًا في التحرك عبر المحلول من حجم صغير أولي - أي من نفس نقطة التحديق أساسًا - عندئذٍ يمكن للجزيئات أن تتحرك بشكل مختلف بشكل ملحوظ السرعات. عادة ما تتحرك جزيئات الحمض النووي الأصغر بسرعة أكبر من الجزيئات الأكبر. وبعد فترة ، يتم فصل الجزيئات حسب الحجم. إذا كانت الجزيئات تقع في أحجام قليلة غير ملحوظة ، فستظهر مجموعات (مستطيلات صغيرة) من الحمض النووي في الهلام. كل من تحتوي هذه العصابات على خيوط DNA ذات حجم معين ".

[ملاحظة المحررين: تستخدم بصمة الحمض النووي التحليل الكهربائي للهلام للتمييز بين عينات المادة الوراثية. يتم التعامل مع جزيئات الحمض النووي البشري بالإنزيمات التي تقطعها في نقاط مميزة معينة ، وبالتالي تقليل الحمض النووي إلى مجموعة من القطع ذات الحجم الأكثر سهولة. يتم تحميل شظايا الحمض النووي في مادة هلامية وتوضع في مجال كهربائي ، والذي يقوم بفرز شظايا الحمض النووي كهربائيا في نطاقات مختلفة. يمكن تلوين هذه العصابات بصبغة مشعة لجعلها مرئية لتقنيات التصوير.]

"بالنسبة للأفراد ، فإن مجموعات الحمض النووي التي يتم إنشاؤها من خلال هذه العملية سيكون لها نمط خاص بالفرد. يأتي جزء من هذا النمط من حجم جزء الحمض النووي منه يأتي من تسلسل الحمض النووي بحجم معين.


تقييد الهضم / الرحلان الكهربي ورقة عمل 1

ما سنفعله الآن هو إعطائك بعض النتائج التجريبية والسماح لك بتفسيرها ، لذلك دعنا ننتقل مباشرة. لقد أجريت عملية Restriction Digestion و Agarose Gel Electrophoresis على بلازميد قمت بتنقيته ، باستخدام 3 إنزيمات تقييدية مختلفة ، والهلام هو مبين أدناه. لسوء الحظ ، لقد نسيت تسمية الأنابيب الخاصة بك أو الاحتفاظ بسجلات جيدة ، والأشياء الوحيدة التي يمكنك تذكرها حول التجربة هي أن معاييرك موجودة في المسار 5 والتحكم غير المصقول في المسار 1 ، وأنك قمت بتحميل نفس الكمية تقريبًا من الإجمالي. الحمض النووي في ممرات العينة (1-4). مرحبًا ، على الأقل تذكرت ذلك كثيرًا!

2. كم مرة قام الإنزيم المستخدم في المسار 2 بهضم البلازميد؟ هل تبدو البيانات معقولة؟ ما هو العدد المحتمل للأزواج القاعدية التي يتعرف عليها هذا الإنزيم؟

3. عندما يظهر الحمض النووي على شكل شريط فوضوي ومستمر كما هو الحال في الجزء السفلي من المسار 3 ، بدلاً من ظهور نطاقات مستقلة وسرية ، يُعرف التأثير باسم التلطيخ. ما هي بعض التفسيرات المحتملة للتلطيخ الذي تم اكتشافه في المسار 3؟ يجب أن تكون قادرًا على ابتكار اثنين على الأقل.

4. كم مرة قام الإنزيم المستخدم في المسار 4 بهضم البلازميد؟ هل تبدو البيانات معقولة؟

إجابات على الأسئلة

2. كم مرة قام الإنزيم المستخدم في المسار 2 بهضم البلازميد؟ هل تبدو البيانات معقولة؟ ما هو العدد المحتمل للأزواج القاعدية التي يتعرف عليها هذا الإنزيم؟ & # 160 & # 160 الإنزيم يهضم البلازميد في مكانين. من المهم التفكير في حالة الحمض النووي قبل الهضم. كان الحمض النووي المستخدم في هذه التجربة عبارة عن بلازميد ، والبلازميدات دائرية. إذا قطعت دائرة مرة واحدة ، تحصل على جزء خطي واحد. يجب عليك قصها مرة ثانية للحصول على جزأين خطيين كما هو الحال في المسار 2. تبدو البيانات معقولة لأنك إذا جمعت الأحجام التقريبية للأجزاء الناتجة (حوالي 4 كيلو بايت و 2.5 كيلو بايت) ، فستحصل على الحجم الأصلي 6.5 كيلو بايت. أخيرًا ، من المحتمل أن يتعرف الإنزيم المستخدم على سلسلة من 6 قواعد. 6 قواطع ، إذا كنت تتذكر ، قم بقص متوسط ​​مرة واحدة كل 4096 قاعدة. هذا مجرد متوسط ​​، ومع ذلك ، في هذه الحالة حيث لدينا قطعة من الحمض النووي بطول 6500 نقطة أساس ، يكون القطع مرتين أمرًا معقولاً للغاية.

3. ما هي بعض التفسيرات المحتملة للتلطيخ الذي تم اكتشافه في المسار 3؟ & # 160 & # 160 بشكل عام ، يحدث التلطيخ عندما يكون لديك العديد من الأشرطة معًا قريبة الحجم بدرجة كافية بحيث لا يمكنك التمييز بين النطاقات المتجاورة (أي عدم الدقة). مع بداية علماء الأحياء الجزيئية ، فإن السبب الأكثر ترجيحًا للتلطيخ هو التلوث ببعض النيوكلياز الضال الذي حطّم الحمض النووي إلى عشرات أو مئات أو حتى آلاف القطع الصغيرة. خطأ آخر في البداية هو استخدام المخزن المؤقت الخطأ أو درجة الحرارة الخاطئة أو الظروف الخاطئة. يمكن لأي من هذه العناصر أو جميعها أن تجعل الإنزيم يتصرف بشكل سيء ، بما في ذلك قطع الحمض النووي الخاص بك في مواقع عشوائية متعددة. ومع ذلك ، كلما قمت بإجراء المزيد والمزيد من التجارب مثل هذا ، يصبح الخطأ الشخصي أقل أهمية وتحتاج إلى البدء في التفكير من حيث العلم. إذا تم إجراء هذه التجربة بدون خطأ كبير ، فإن التفسير المحتمل هو أنه تم استخدام قاطع من 4 قواعد. ينتج عن قطع ما معدله مرة واحدة كل 256 قاعدة في بلازميد 6.5 كيلو بايت ما يقرب من 25 جزءًا ، وكلها أصغر من الأصل. من غير المحتمل أن يرى المرء 25 شظية فردية بهذا الحجم الصغير ، وربما يكون نمط التلطيخ هو ما يمكن اكتشافه.

4. كم مرة قام الإنزيم المستخدم في المسار 4 بهضم البلازميد؟ هل تبدو البيانات معقولة؟ & # 160 & # 160 إذا قلت مرتين ، فأنت محق ، لكن دعنا نرى ما إذا كنت على صواب للأسباب الصحيحة. في السؤال 2 ، تمت الإشارة إلى أنه للحصول على جزأين من قطعة دائرية من الحمض النووي ، فإنك تحتاج إلى قطعتين. حتى الان جيدة جدا. وذكر أيضًا أن الحجم الإجمالي لشظايا الحمض النووي الناتجة يجب أن يصل إلى الحجم الأصلي. أه أوه - لا يفعلون ، أليس كذلك؟ بالنظر إلى الجل ، ترى نطاقًا واحدًا تقريبًا 6.5 كيلو بايت ونطاقًا كبيرًا بحوالي 3 كيلو بايت. هل 6.5 + 3 = 6.5؟ ليس في هذا الفصل.

العلم لا يكذب ، من الصعب أحيانًا تفسيره. لذا قم بتفكيكها. هل هناك أي شيء مهم حول 6.5 كيلوبايت؟ نعم ، إنه حجم البلازميد الأصلي. هذا ، بالإضافة إلى حقيقة أن هناك شريطًا في عنصر التحكم غير المقطوع (المسار 1) والذي ينتقل إلى نفس الموضع ، يجب أن يوحي لك بأنه لم يتم هضم كل الحمض النووي الخاص بك (حدث شائع). هذا يترك النطاق حول 3 كيلو بايت. هل يمكن أن يكون هذا النطاق 3.2 أو 3.3 كيلو بايت بدلاً من 3.0؟ بسهولة. ما لم نرسم منحنى قياسيًا ، فنحن نقترب على أي حال. هل هناك أي شيء مهم حول 3.3 كيلوبايت؟ نعم ، إنها تمثل نصف العينة الأصلية تقريبًا. إذا قطع الإنزيم البلازميد إلى قطعتين متساويتين تقريبًا الحجم ، فإن هذه القطع ستعمل بنفس الطريقة تقريبًا ، ومن المحتمل أن يتعذر تمييزها على مادة هلامية. يتم دعم ذلك أيضًا من خلال المعلومات حول هذه التجربة والتي تنص على أنه تم تحميل كميات متساوية تقريبًا من الحمض النووي في الممرات 1-4. لاحظ مدى قتامة النطاق 3 كيلو بايت في المسار 4 من النطاقات الموجودة في المسار 2. يوجد ضعف الحمض النووي في هذا النطاق مقارنة بأيٍ من النطاقين في المسار 2 ، وتدعم البيانات هذا الاستنتاج.


سؤال شائع: لماذا أرى مسحة الحمض النووي على هلام الاغاروز بعد هضم التقييد؟

هناك عدة أسباب محتملة وراء رؤية مسحة الحمض النووي على هلام الاغاروز بعد هضم التقييد. لمناقشة هذا الموضوع يرجى الرجوع إلى الفيديو أعلاه.

يمكن أن تنتج مسحة الحمض النووي على هلام الاغاروز بعد هضم التقييد من واحد أو أكثر مما يلي:
1. نوكلياز التلوث في تفاعل الهضم
2. مشاكل مع تشغيل المخزن المؤقت في هلام مربع أو
3. إنزيم التقييد له علاقة ارتباط عالية بالحمض النووي
قد يأتي مصدر تلوث نوكلياز من تحضير الحمض النووي أو محلول الهضم أو الماء المستخدم في خليط الهضم. مع الضوابط المناسبة ، يمكن فحص كل من هذه المكونات بشكل مستقل بعد الحضانة في درجة حرارة الهضم المحددة.
تشغيل المخازن المؤقتة التي تم الحفاظ عليها في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة من الوقت يمكن أن تنفجر في النهاية وتؤثر سلبًا على الرحلان الكهربي. إذا كان المخزن المؤقت الموجود في علبة الهلام يبدو غائمًا وأظهرت النتائج غير الطبيعية ، اشطف علبة الهلام واستخدم جيلًا جديدًا قبل تحميل الجهاز الهضمي للحصول على أفضل النتائج.
في حالة الاشتباه في ارتباط الحمض النووي ، فإن إضافة 0.1 - 0.5 ٪ من محلول SDS بعد الهضم سيساعد الإنزيم على الانفصال عن الحمض النووي ويسمح بعرض نمط النطاقات المناسب عند تشغيله على الجل.
يرجى الرجوع إلى إرشادات استخدام إنزيم التقييد أو دليل حل المشكلات المقدم للحصول على معلومات إضافية.


المواد والأساليب

السلالات البكتيرية والبلازميدات ووسط المزرعة

ال الإشريكية القولونية كانت السلالات المستخدمة في هذه الدراسة هي DH5αF ′ (قدمها سانتياغو رودريغيز دي قرطبة) ، و parE10 (قدمه إيان غرينج) و LZ38 (قدمته لين تسيشيدريش). يتم تفصيل الأنماط الجينية ذات الصلة أدناه:

DH5αF ′ F'/جير(نالص) recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 (صك - مك + ) glnV44 deoR Δ (lacZYA-argF)U169[F80dΔ (لاكز)M15]
parE10 W3110 F- باستثناء [parE10 recA]
LZ38 F-λ (P80 أحمر 114 xis-l cl857) زي -723:: Tn10 باركK84 ::كان
DH5αF ′ F'/جير(نالص) recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 (صك - مك + ) glnV44 deoR Δ (lacZYA-argF)U169[F80dΔ (لاكز)M15]
parE10 W3110 F- باستثناء [parE10 recA]
LZ38 F-λ (P80 أحمر 114 xis-l cl857) زي -723:: Tn10 باركK84 ::كان
DH5αF ′ F'/جير(نالص) recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 (صك - مك + ) glnV44 deoR Δ (lacZYA-argF)U169[F80dΔ (لاكز)M15]
parE10 W3110 F- باستثناء [parE10 recA]
LZ38 F-λ (P80 أحمر 114 xis-l cl857) زي -723:: Tn10 باركK84 ::كان
DH5αF ′ F'/جير(نالص) recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 (صك - مك + ) glnV44 deoR Δ (lacZYA-argF)U169[F80dΔ (لاكز)M15]
parE10 W3110 F- باستثناء [parE10 recA]
LZ38 F-λ (P80 أحمر 114 xis-l cl857) زي -723:: Tn10 باركK84 ::كان

تم تحويل الخلايا المختصة بأشكال أحادية (4383 نقطة أساس) أو أشكال قاتمة (8766 نقطة أساس) من pBR18 ، وهو مشتق من pBR322 حيث تم استبدال محفز مقاومة التتراسيكلين بالرابط المتعدد لـ pUC18 (12). نمت خلايا DH5αF ′ و LZ38 في وسط LB عند 37 درجة مئوية بينما نمت خلايا parE10 عند 30 درجة مئوية. في جميع الحالات ، تمت إضافة 75 ميكروغرام / مل الأمبيسلين إلى وسط LB. تم إجراء عزل DNA البلازميد كما هو موضح في مكان آخر (25 ، 26).

علاجات الخلايا والحمض النووي

استخدمنا النورفلوكساسين لتثبيط الحمض النووي من النوع البري gyrase و topoisomerase IV (Topo IV) في الجسم الحي كما هو موضح في مكان آخر (27 ، 28). سمحت لنا المسوخات المقاومة للأدوية بتثبيط DNA gyrase أو Topo IV بشكل انتقائي. عولجت الخلايا بـ 15 أو 156 ميكرومتر من النورفلوكساسين لمدة 15-30 دقيقة قبل الحصاد مباشرة. في جميع الحالات ، تم تحضير عينات الحمض النووي التي تم تحليلها من مجمعات معزولة منفصلة من الحمض النووي الفائق الملف المختلط في المختبر بأشكال مقطوعة من جزيئات معقودة أو معقودة.

للحث على فواصل مفردة تقطعت بهم السبل ، تم هضم الحمض النووي مع ملحوظةBsmI (نيو إنجلاند بيولابس) لمدة ساعة عند 8 وحدات / ميكروغرام من الحمض النووي عند 50 درجة مئوية. تم حظر التفاعلات باستخدام 100 ميكروغرام / مل من بروتيناز K (Roche) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (29).

2D الاغاروز الكهربائي للهلام والنقل الجنوبي

كان البعد الأول في هلام الاغاروز 0.4٪ في محلول TBE (89 ملي تريس-بورات ، 2 ملي مولار حمض إيثيلين ديامينيتتراسيتيك (EDTA)) عند 1.0 فولت / سم عند درجة حرارة الغرفة لمدة 25-30 ساعة. كان البعد الثاني في هلام الاغاروز 0.8-1.2٪ في محلول TBE الذي تم تشغيله بشكل عمودي على البعد الأول. تم صب الاغاروز المذاب حول ممر الاغاروز المستأصل من البعد الأول وكان الرحلان الكهربي عند 5-6.6 فولت / سم في غرفة باردة 4 درجات مئوية لمدة 8-22 ساعة. Southern transfer was performed as described before ( 30).

Non-radioactive hybridization

DNA probes were labeled with digoxigenin using the DIG-High Prime kit (Roche). Membranes were prehybridized in a 20 ml prehybridization solution (2× SSPE (Saline Sodium-Phosphate-EDTA), 0.5% Blotto, 1% SDS, 10% dextran sulfate and 0.5 mg/ml sonicated and denatured salmon sperm DNA) at 65ºC for 4–6 h. Labeled DNA was added and hybridization lasted for 12–16 h. Hybridized membranes were sequentially washed with 2× SSC (Saline Sodium-Citrate) and 0.1% SDS at room temperature for 5 min twice and with 0.1× SSC and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) at 68ºC for 15 min twice as well. Detection was performed with an antidigoxigenin-AP conjugate antibody (Roche) and CDP-Star (Perkin Elmer) according to the instructions provided by the manufacturer.


What causes skewed lanes in a DNA gel electrophoresis experiment? - مادة الاحياء

Identification of putative DNA binding sites is typically accomplished by means of footprinting analyses. Binding of the regulator protein to its consensus binding site protects the DNA from nuclease digestion. The DNA duplex is then denatured and the fragments resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Comparison of the unprotected and protected DNA fragments will reveal the "footprint" or DNA region that was protected from nuclease digestion by the presence of the bound regulator protein(s). Identification of the DNA binding protein itself can be accomplished by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). In a typical gel shift assay, a radiolabeled DNA oligonucleotide containing the putative consensus binding site is mixed with the purified protein. Following the binding step, the sample is subjected to native or nondenaturing gel electrophoresis. The naked DNA will migrate in the gel according to its native molecular weight however, binding of the regulator protein to the DNA causes a shift in the detected band due to the higher molecular weight of the DNA:protein complex. Radioactive bands can be detected by X-ray film or phosphorimaging technology. In this experiment we will radiolabel 2 oligonucleotides, each of which carries a distinct consensus binding site for two different transcription factors - AP2 and SP1. HeLa nuclear extract contains multiple transcription factors, including AP2 and SP1, and will provide the source of DNA binding proteins. Following incubation of the HeLa extract with the radiolabeled oligos we will perform nondenaturing gel electrophoresis to confirm binding. The specificity of the transcription factors for their putative binding sites will be established by competition experiments with unlabeled DNA oligos.

Lehninger, 5th edition: Ch 28

Protocol for Experiment 26

Must complete prior to Day 1 of lab:

The Certificate of Completion must be submitted at the start of lab on Day 1 in order to participate in experimental work.


Detection of Variation among the Student Chromosome Population through Simulated PCR Reactions

Oligonucleotides are the “eyes” of the reaction. These are short segments of DNA that “find” the specific region of DNA you are interested in amplifying and anneal to it on the basis of G-C and A-T interactions via hydrogen bonding. Remember that there are >3 billion nucleotides in nearly every single cell in your body, and generally we are only interested in

1000 of those nucleotides for analysis. That means that the oligonucleotides (or “primers”) need to seek out the specific 0.00003% of the genome we are targeting. In this case, as in “real life” DNA fingerprinting, we are interested in making more copies of a segment of DNA that varies on each chromosome, and not in making more copies of DNA that is the same on each chromosome. This is accomplished by designing “primers” that stick to the DNA that immediately flank the VNTR region. Basically, we want to “bookend” the VNTR region with two primers. One primer will anneal to the top strand of DNA (sequence provided in the Appendix) while the other will anneal to the bottom strand of DNA (sequence of the strand not shown in the Appendix). An example utilizing chromosome 1 is presented in Figure 1, showing both strands of DNA. Note that directionality is incorporated into the primer with an asterisk and that for formatting and space reasons, the actual simulated chromosomes ( Appendix) show only the single top strand sequence, while the second strand can be assumed. Directionality will be important in both proper formulation of the primer and grading of primer design. The underlined region depicts the start of the VNTR, or the sequence we want to bookend with our primers. Primers will be designed that are exactly 10 nucleotides long and, thus, should adhere to the portions of DNA shown in bold and stimulate the generation of DNA directionally as indicated with arrows. This is achieved by ensuring that the asterisk is placed on the side of the primer that will not be a DNA synthesis point (the 5′ end) but will instead allow new DNA to be generated on the downstream end of the primer.

Using the segment in Figure 1, a correct set of primers can be designed for this sequence. The first is *-gtggtctact, which would adhere to the first bold region and directionally prime toward the VNTR as indicated with an arrow. This primer would allow for, and become part of, a newly synthesized strand of DNA complementary to the top strand shown in Figure 1. The second necessary primer is *caaattttat, which would anneal to the second bold section and would prime and become a part of the newly synthesized bottom strand of DNA being generated toward the VNTR. This particular priming scenario (when utilized with PCR) would result in the generation of newly synthesized DNA that is 110 total nucleotides in length (denoted between the asterisks above). It is important to note that the exact same primer set would generate DNA on both versions of chromosome number 1 but the total length would vary. Thus, a student who had obtained two copies of a single version of the chromosome would generate only a single 110-nucleotide DNA fragment. If a student had obtained two variations of chromosome 1, then two sizes of newly synthesized DNA would be generated via PCR and, thus, two different-sized DNA bands would ultimately be visualized (see Figure 2).


شاهد الفيديو: شرح عملي للgel electrophoresis بالعربي (ديسمبر 2021).