معلومة

هل عملية التجفيف تستخدم مرتين في تحضير الشرائح الدائمة؟


لقد تلقيت تعليمي "إعداد الشرائح الدائمة" من قبل أحد أساتذتي في سياق التقنيات البيولوجية. أعطاني الخطوات التالية لإعداد شريحة دائمة: إجمالاً ، هناك سبع خطوات في ذلك ، لكن الالتباس يكمن في حقيقة أن الخطوة التي ينطوي عليها الجفاف يتم استخدامها مرتين. لم أفهم أنه إذا كانت العينات قد جفت مرة واحدة ، فلماذا هناك حاجة لتجفيفها مرة أخرى؟ أليس أنه بعد خطوة التجفيف ، يتم ترطيب العينة في عملية التلوين ، ثم ستكون هناك حاجة مرة أخرى لعملية الجفاف؟


تحضير العينات بالمجهر الإلكتروني

تعتبر المجاهر الإلكترونية أدوات قوية جدًا لتصور العينات البيولوجية. إنها تمكن العلماء من مشاهدة الخلايا والأنسجة والكائنات الدقيقة بتفصيل كبير جدًا. ومع ذلك ، لا يمكن مشاهدة هذه العينات البيولوجية على المجاهر الإلكترونية أثناء الحياة. بدلاً من ذلك ، يجب أن تخضع العينات لخطوات تحضير معقدة لمساعدتها على تحمل البيئة داخل المجهر. عملية التحضير تقتل الأنسجة ويمكن أن تسبب أيضًا تغيرات في مظهر العينة.

بالنسبة للعلماء الذين يرغبون في مشاهدة العينات البيولوجية ، فإن هذا يمثل تحديًا - كيف يمكن حفظ العينة بحيث تبدو بقدر الإمكان كما لو كانت في الكائن الحي ، مع الاستمرار في تحمل التصور في المجهر الإلكتروني.


ربما تكون على دراية بكيفية فك الحبل عند قطعه. يحدث الشيء نفسه ، على المستوى المجهري ، لقطعة صغيرة من الأنسجة تسمى الخزعة. تبدأ سلاسل جزيئات البروتين في التدهور على الفور تقريبًا بعد إزالة الأنسجة. نسمي هذا التحلل الذاتي للأنسجة. فكر مرة أخرى في قطع الحبل. أحد الأشياء التي يمكن القيام بها لمنعها من الانهيار هو الاحتفاظ بمطابقة مضاءة حتى الأطراف البالية بحيث تذوب الألياف معًا. لإيقاف التحلل الذاتي للأنسجة ، يتم وضع الخزعة في معالج الأنسجة الذي يستخدم الفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ لربط الأطراف السائبة لسلاسل جزيء البروتين ، وبالتالي منع المزيد من التحلل. تُعرف هذه العملية باسم تثبيت الأنسجة. بعد أن يزيل الطبيب قطعة النسيج ، فإن أول شيء يفعله هو وضعها في وعاء يحتوي على 10٪ من الفورمالين المحايد.

عندما تصل العينة الجراحية إلى معمل التشريح المرضي ، يتم أخذها إلى أ محطة الربح. هذا هو المكان الذي يتم فيه فحص المرض بدقة وقياسه ووصفه بطريقة أخرى. تسجيل صوتي معروف ب الإملاء الإجمالي، يتم كتابته ثم كتابته لاحقًا في تقرير المريض والمحلف الدائم. يتم بعد ذلك تأمين الخزعة في شريط نسيج بلاستيكي يتم وضعه في مغطس من الفورمالين.


استخدام الكحول

بالنسبة للهواة الذي يريد تحضير شريحة بين الحين والآخر ، فإن الاحتفاظ بمجموعة كاملة من المثبتات الكيميائية المختلفة ربما يكون مبالغة (وليس صحيًا أيضًا). أحتفظ بزجاجة صغيرة من الكحول المحمر بنسبة 96٪ على الرف الخاص بي ، حيث أسقط العينات ، وعادة ما تكون حشرات صغيرة ، عند وصولها. سوف يقومون بالتخزين إلى أجل غير مسمى تقريبًا في هذا الحل. عند عمل شرائح دائمة ، أقوم بنقلها مباشرة إلى وسط تركيب Euparal.

الكحول النقي (الإيثانول) مناسب أيضًا لتثبيت وتخزين عينات النباتات ، بدون محتويات الخلايا. يميل الكحول إلى تقليص السيتوبلازم ، لكنه لا يؤثر على جدران الخلايا. يعمل الكحول أيضًا على تقوية المادة النباتية ، مما يجعل من السهل قطعها باستخدام مبضع (والذي غالبًا ما يزيل محتويات الخلية على أي حال).


هل عملية التجفيف تستخدم مرتين في تحضير الشرائح الدائمة؟ - مادة الاحياء

تركيب الوسائط: نظرة عامة

شامالا رافيكومار 1 ، آر سوريخا 1 ، روبان ثافراجاه 2
1 قسم أمراض الفم والوجه والفكين ، كلية نافودايا لطب الأسنان ، رايشور ، كارناتاكا ، الهند
2 قسم أمراض الفم والوجه والفكين ، كلية ومستشفى راجاس لطب الأسنان ، تشيناي ، الهند

تاريخ النشر على شبكة الإنترنت10-مارس -2014

عنوان المراسلة:
شامالا رافيكومار
قسم أمراض الفم ، كلية نافودايا لطب الأسنان ، رايشور ، كارناتاكا
الهند

مصدر الدعم: لا أحد، تضارب المصالح: لا أحد

DOI: 10.4103/2277-8632.128479

يجب تركيب المقاطع النسيجية ، التي يجب فحصها لأي فترة زمنية أو تخزينها ، أسفل قسيمة غطاء. هناك أنواع مختلفة من وسائط التثبيت المتاحة تجاريًا ويتم إعدادها أيضًا في المختبر الخاص بتركيب أقسام الأنسجة. تتصلب بعض أنواع وسائط التركيب لتثبيت الغطاء بإحكام في مكانه وتستخدم الأنواع الأخرى مذيبات مختلفة مثل الماء والجلسرين والزيلين لأن البقع الموجودة في تحضير العينة حساسة لمذيب معين. من أجل منع الانزلاق المناعي ، يحتوي عدد قليل من وسائط التركيب على كواشف مضادة للتلوث. نظرًا لأنه يتم التركيز بشكل أقل في الأدبيات على الوسائط المتصاعدة ، فقد تم إجراء محاولة للمراجعة والمغامرة وتلخيص أنواع مختلفة من الوسائط المتصاعدة واستخداماتها في تلطيخ الأنسجة والكيماويات المناعية الروتينية.

الكلمات الدالة: antifade ، ساترة ، وسائل الإعلام المتصاعدة


كيف تستشهد بهذا المقال:
Ravikumar S ، Surekha R ، Thavarajah R. تركيب الوسائط: نظرة عامة. J NTR Univ Health Sci 20143 ، ملحق S1: 1-8

كيفية الاستشهاد بعنوان URL هذا:
Ravikumar S ، Surekha R ، Thavarajah R. تركيب الوسائط: نظرة عامة. J NTR Univ Health Sci [مسلسل على الإنترنت] 2014 [تم الاستشهاد به في 2021 28 يونيو] 3 ، ملحق S1: 1-8. متاح من: https://www.jdrntruhs.org/text.asp؟2014/3/5/1/128479

في مختبر علم الأنسجة أو علم الأمراض ، يعتبر التركيب هو الإجراء الأخير في السلسلة الذي ينتهي بتحضير نسيج دائم على الطاولة ، بعد معالجة الأنسجة وتلطيخها بفترة طويلة. بمعنى ، (1) التثبيت ، (2) تضمين البارافين ، (3) التقسيم ، (4) تلطيخ ، (5) التجفيف ، و (6) عمليات المقاصة. [1]

وسيط التركيب هو الحل الذي يتم فيه دمج العينة ، بشكل عام تحت غطاء زجاجي. قد تكون سائلة أو صمغية أو صمغية أو قابلة للذوبان في الماء أو كحول أو مذيبات أخرى وتكون مختومة من الغلاف الجوي الخارجي بوسائط رنين غير قابلة للذوبان. [2] الغرض الرئيسي من الوسائط المتصاعدة هو الحماية المادية للعينة من عينة الروابط المتوسطة المتصاعدة والشريحة والغطاء مع فيلم شفاف متين. الوسيط مهم لتشكيل الصورة لأنه يؤثر على تسليم العينة. [3]

يجب أن يكون لوسائط التركيب بشكل مثالي معامل انكسار (RI) أقرب ما يمكن إلى البروتين الثابت (النسيج) (حوالي 1.53). عندما يمر الضوء من وسيط إلى آخر ، فإنه يغير سرعته وينحني. مثال على ذلك هو الانحناء الظاهر للعصا عند وضعها في الماء. ينتقل الضوء بشكل أسرع في الفراغ وفي جميع الوسائط الأخرى ينتقل الضوء بشكل أبطأ. RI للوسيط هو نسبة سرعة الضوء في الفراغ إلى سرعة الضوء في الوسط (دائمًا & gt1). [4]

وسيجعل الوسط المتصاعد مع RI قريبًا من النسيج الثابت بالتالي شفافًا ، مع ظهور عناصر الأنسجة الملطخة فقط. هذا هو المكان الذي يأتي فيه مصطلح "المقاصة" من الزيلين ، على سبيل المثال ، له RI قريب جدًا من النسيج الثابت ، وبالتالي ، يؤدي إلى قدر معين من الشفافية. [4]

وسيط التثبيت مع RI بعيد جدًا عن جانبي 1.53 سيوفر وضوحًا وتباينًا ضعيفًا. يمكن إثبات ذلك عمليًا من خلال عرض قسم الأنسجة بدون وسيط متصاعد نظرًا لأن الهواء له RI 1.0. [4] يجب اختيار وسيط تركيب لا يتلاشى مع البقع المعينة المستخدمة على سبيل المثال ، يجب تركيب أصباغ الأنيلين الأساسية في حوامل لا تحتوي على حمض. يجب أن تُركب الاستعدادات التي تُظهر تفاعل اللون الأزرق البروسي في وسائط غير مختزلة. [5]

  1. يجب أن يكون RI أقرب ما يكون إلى الزجاج ، أي 1.5.
  2. يجب أن يكون عديم اللون وشفاف.
  3. لا ينبغي أن يتسبب في انتشار البقع أو تلاشيها.
  4. يجب أن يكون جافًا إلى قوام غير لاصق ويتصلب بسرعة نسبيًا.
  5. لا ينبغي أن يتقلص من حافة غطاء الزجاج.
  6. يجب أن تكون قادرة على التخلل بشكل كامل وملء فجوات الأنسجة.
  7. لا ينبغي أن يكون لها أي تأثير سلبي على مكونات الأنسجة.
  8. يجب أن يكون مقاومًا للتلوث (خاصة نمو الكائنات الحية الدقيقة).
  9. يجب أن يحمي القسم من التلف الفيزيائي والنشاط الكيميائي (الأكسدة والتغيرات في درجة الحموضة).
  10. يجب أن تكون قابلة للامتزاج تمامًا مع عامل تجفيف أو عامل تنظيف.
  11. يجب أن يتم ضبطه دون التبلور أو التكسير أو الانكماش (أو تشويه المادة التي يتم تركيبها بطريقة أخرى) وعدم التفاعل مع البقع ومنتجات التفاعل أو ترشيحها أو تحريضها على التلاشي (بما في ذلك تلك الناتجة عن الإجراءات الكيميائية النسيجية الإنزيمية والتهجين والكيمياء المناعية).
  12. أخيرًا ، بمجرد ضبطه ، يجب أن يظل الحامل ثابتًا (من حيث الميزات المذكورة أعلاه). [6] ، [7]

وسائط راتنجية / غير مائية / لاصقة

هذه راتنجات طبيعية أو اصطناعية مذابة في البنزين أو التولوين أو الزيلين وتستخدم عندما يكون التثبيت الدائم مطلوبًا وتستخدم بشكل متكرر في إجراءات التلوين الروتينية H و E. [6]

بشكل عام ، تتصلب المواد اللاصقة من خلال تبخر المذيبات وبالتالي إصلاح الغطاء المصاحب للشريحة. خلال هذه العملية ، يتغير RI للوسيط ، مبتعدًا عن ذلك الخاص بالمذيب وباتجاه المركب الجاف. لذلك لا يمكن معرفة RI الدقيق للوسيط المطبق. ومع ذلك ، نظرًا لأن RI للحوامل الكارهة للماء (اللاصقة) تقترب عادةً من بروتينات الأنسجة (الثابتة) وتوفر التصاقًا ثابتًا للغطاء ، فإن هذه الحوامل هي النوع الأكثر استخدامًا. [7]

وسائط راتنجية طبيعية

  • بلسم كندا (RI = 1.52-1.54)
  • الفينول بلسم (نوع من بلسم كندا)
  • بلسم دمار (RI = 1.52-1.54)
  • Euparal (RI = 1.48). [2]

بلسم كندا هو نوع من الأوليورين يتم الحصول عليه من لحاء التنوب أبييسبلسميا (من عائلة Pinaceae) ، موطنها أمريكا الشمالية. الراتنج المجفف قابل للذوبان بحرية في الزيلين والمذيبات العضوية الأخرى. يعتبر البلسم الكندي هو العنصر الأساسي في علم الأنسجة وأيضًا للتصنيف ، سواء كان ذلك في علم الحيوان أو النبات ، وهو راتينج طبيعي نادر ومكلف للغاية. [1] ، [7]

تم وصف بلسم كندا لأول مرة من قبل أندرو بريتشارد كوسيلة تركيب مناسبة في ثلاثينيات القرن التاسع عشر. إنه الحامل الأكثر استخدامًا نظرًا لجودته الأرشيفية المثبتة ، مع سجل حافل يصل إلى 150 عامًا ولا يتبلور أو يمتص الرطوبة. صرح Mount and Pitkin أن بلسم كندا هو العنصر الوحيد الذي لا يتدهور عند الاحتفاظ به لسنوات في مختلف المناخات. يذكر نويز عدة ملايين من السنين كطول عمر بلسم كندا ، مقارنته بالعنبر الطبيعي المتحجر. يذكر ووكر وكروسبي أن بلسم كندا موصى به بشكل خاص لأنه RI (1.53) قريب جدًا من الزجاج. [2]

رولينز تعتبر البلسم الكندي يستخدم على نطاق واسع في وقت واحد لأنه شديد التوهج الذاتي. المذيبات الضارة التي تشكل خطرًا على الصحة مثل الزيلين قد تحد من استخدامها كمواد تثبيت واستخدام مذيبات غير سامة بدلاً من مادة الزيلين مثل الهستوماونت قد تحل مشكلة السلامة ، ولكنها قد تسبب مشكلة أخرى مثل التصلب البطيء والتغميق المبكر. أبلغ مؤلفون آخرون عن مشكلة مثل "الجنون". تشمل العيوب الأخرى أنه يصفر مع تقدم العمر بطيء جدًا في التصلب ومع مرور الوقت يصبح حامضيًا بشكل متزايد ، يتم الحفاظ على الأصباغ الكاتيونية بشكل سيئ ويتم تبييض المنتج الأزرق البروسي لتفاعل بيرلز. [2] ، [7]

هو جبل شبه اصطناعي. يتكون من خليط من الأوكاليبتول ، سانداراك (راتينج من الشجرة ، تتراكلينينارتيكولاتا يزرع في شمال غرب إفريقيا) ، بارالدهيد و camsal (كافور و فينيل ساليسيلات). تعتبر مادة حافظة دائمة جيدة ، أثبتت فعاليتها بمرور الوقت ، ذات جودة متسقة ، آمنة ، سريعة وسهلة الاستخدام ، جيدة بصريًا مع RI منخفضة وتجف بسرعة. لا يستخدم المذيبات المسببة للسرطان والزيلين وبالتالي فهو أفضل من بلسم كندا ويستخدم كبديل للبلسم. قد يحدث بعض التلاشي في المقاطع الملطخة بالهيموكسيلين في هذه الحالة ، يُنصح باستخدام شكل Euparal المحتوي على النحاس الأخضر (أو "Vert"). [2] ، [5] ، [7]

تشبه بلسم كندا ونادراً ما تستخدم كمثبت بسبب الأوساخ والشوائب الموجودة عادةً وصعوبة ترشيح الحامل الجاهز. [5]

وسائط راتنجية اصطناعية

يتوفر عدد كبير من الراتنجات الاصطناعية سواء المصنوعة في المختبر أو المعدة تجاريًا. الأكثر شيوعًا هي البوليسترين ، مثل جبل Kirkpatrick & Lendrum وملدّن Gurr's Distrene Xylene (DePex).

  1. DPX (DePeX [Distrene 80: بوليسترين تجاري ، مادة ملدنة ، على سبيل المثال ، ثنائي بيوتيل الفثالات والزيلين]) (RI = 1.52)
  2. هيستوماونت (RI = 1.49-1.50)
  3. سند التغطية (RI = I.53)
  4. وسيط تركيب Gurr المحايد (RI = 1.51)
  5. هيستوكلاد (RI = 1.54)
  6. Permount (RI = 1.526)
  7. Pro-texx (RI = 1.495)
  8. راتنج تكنكون (RI = 1.62)
  9. الأشعة فوق البنفسجية الخاملة (RI = 1.517)
  10. XAM (RI = 1.52). [6] ، [7]

هو وسط محايد عديم اللون يتم فيه الحفاظ على معظم البقع القياسية بشكل جيد. يتم تحضيره عن طريق إذابة البلاستيك الشائع ، البوليسترين ، في مذيب هيدروكربوني مناسب (زيلين عادة). اقترح جور أنه يخضع لدرجة كبيرة من الانكماش عند التجفيف ويجب تطبيقه بحرية على الشريحة. وضعوا بسرعة وفي القيام بذلك في كثير من الأحيان يتراجعون من حافة ساترة. يمكن منع ذلك عن طريق إضافة مادة ملدنة ، والتي يعتقد أنها تقاوم التأثير من خلال تشكيل شبكة مع البلاستيك المبلمر. الأكثر شيوعا الروتينية جبل. تتمتع بميزة أكبر على البلسم حيث يمكن تنظيف الشرائح من الفائض الزائد ببساطة عن طريق تجريدها بعد القطع حول حافة ساترة. [2] ، [5] ، [7]

وسيط تركيب Gurr المحايد (RI 1.51)

عبارة عن خليط من الكومارون والراتنجات الأخرى كمحلول 76٪ في السينول. هذا المركب هو محلول لزج إلى حد ما.

هيستوكلاد آدم هو محلول 60٪ من الراتينج الصناعي في التولوين.

بيرمونت هو محلول 60٪ من بوليمر النفثالين في التولوين.

تكسكس من ليرنر لابوراتوريز 171 صناعة بيتبرج هي وسط متصاعد من الأس الهيدروجيني المحايد مع مادة مضافة مضادة للأكسدة للحفاظ على جودة البقع. قابل للذوبان في كل من التولوين والزيلين.

المتصاعد من شركة Technicon Corporation عبارة عن محلول 60٪ من بوليمر الكومارون-إيندين في البنزين والزيلين بأجزاء متساوية. يميل إلى تكوين فقاعات عند التصلب بسبب التقلب الشديد للبنزين.

وسيط تركيب حاصل على براءة اختراع غير فلورسنت من Gurr. [6]

يمكن تركيب أجزاء من الأنسجة المضمنة في مركبات بلاستيكية (مثل راتنجات الايبوكسي) بنجاح في الراتنج السائل من نفس النوع. يجب أن تكون الأقسام جافة تمامًا قبل وضع الحامل ، والذي من الأفضل ضبطه باستخدام نفس الشروط المحددة لكتل ​​الأنسجة. [7]

راتنجات حساسة للضوء

تتميز راتنجات البلمرة الخفيفة بميزة أوقات الإعداد القصيرة جدًا ، والتي تتطلب في حدود 10-30 ثانية من التعرض للأشعة فوق البنفسجية لتتصلب تمامًا. ومع ذلك ، بمجرد الشفاء ، لا يمكن حل المركب أو إزالة الغطاء (كما قد يكون ضروريًا للراحة). الراتنجات الحساسة للضوء القائمة على الأكريليك مناسبة أيضًا للفحص المجهري الفلوري. [7]

وسائط تركيب مائية

يتم استخدام وسط التركيب المائي لتركيب المقاطع من الماء المقطر عندما يتم إزالة البقع أو إزالتها بالكحول والزيلين كما هو الحال مع معظم بقع الدهون (طرق السودان). هذه الوسائط من ثلاثة أنواع: الشراب ، ووسط الجيلاتين ، ووسط الصمغ العربي. [5]

تميل بعض البقع المتغيرة اللون إلى الانتشار من الأقسام إلى وسائط متصاعدة بعد فترة وجيزة من التركيب: يمكن منع ذلك باستخدام شراب الفركتوز. تميل بقع الغوم ، على سبيل المثال ، ميثيل عنيف إلى الانتشار في الوسط بعد التركيب. يمكن تجنب ذلك باستخدام وسيط Highman. تتطلب وسائط التركيب المائية إضافة عوامل جراثيم مثل الفينول أو بلورة الثيمول أو ميرثيولات الصوديوم لمنع نمو الفطريات. [5] ، [6]

  1. الماء (RI = 1.333).
  2. هلام الجلسرين (RI = 1.47).
  3. الجلسرين - الجلسرين (RI = 1.47).
  4. وسط Apathy (RI = 1.52).
  5. وسط فارانت (RI = 1.43).
  6. وسط هايمان (RI = 1.52).
  7. شراب الفركتوز (RI = 1.47).
  8. كحول بولي فينيل.

على الرغم من انخفاض RI ، (1.333) ، يعمل الماء كمثبت مؤقت مناسب لبعض العينات الكاملة لفحص بعض الكائنات الحية الدقيقة الحية (التركيب الملحي) وخاصة عند فحص الأقسام أثناء إجراءات التلوين. [7]

يعتبر هذا عادةً الحامل القياسي للبقع الدهنية. يذاب الجيلاتين في الماء المقطر في دورق مخروطي في حمام مائي ويضاف الجلسرين والفينول ويخلط جيدا ويخزن. [5]

هذا المركب المائي المستخدم بشكل شائع هو خليط من الجلسرين والجيلاتين وله RI 1.47. يجب أن يكون صعبًا جدًا ولكن بالنسبة لأقسام الحفظ على المدى الطويل ، من الأفضل حلقها وإغلاقها. تركيبات مختلفة قيد الاستخدام. [7]

كما هو الحال مع المذيبات الأخرى ، يتم استخدامه لأنه رخيص الثمن وآمن وسريع الاستخدام مع القليل من التحضير. سيؤدي رنين الغطاء بختم مسعور إلى إطالة عمر المقاطع المركبة ، على الرغم من أن الأصباغ الكاتيونية ستنتشر في الوسط بمرور الوقت. يستخدم الجلسرين المخزن بالفوسفات (RI = 1.47) بشكل شائع لتركيب أقسام من أجل التألق المناعي ويمكن إضافة الجلسرين إلى عوامل أخرى لتأخير التجفيف والتكسير. [7]

وسط Apathy (RI = 1.52)

إنها واحدة من أكثر المواد المائية فائدة في الفحص المجهري الفلوري ، كونها غير فلورية تقريبًا.

تذوب المكونات بمساعدة الحرارة اللطيفة.

وسط فارانت (RI = 1.43)

قم بإذابة الصمغ العربي في الماء المقطر بحرارة لطيفة ، أضف الجلسرين وثالث أكسيد الزرنيخ. كما يوصى باستخدامه لإزالة بقع الدهون. [5]

وسط هايمان (RI = 1.52)

يوصى باستخدامه مع الأصباغ المتغيرة اللون وخاصة ميثيل البنفسج. [6]

وسط رنين / وسائط مانعة للتسرب

السائل ، الجلسرين ، وجبل الكلورال اللثة يحتاج إلى حلق حول حافة ساترة لإغلاق المركب ومنع الهروب ، والخسارة من خلال التبخر أو الأكسدة من خلال ملامسة الهواء. يجب إزالة الرواسب الزائدة من الحافة المستديرة بالمشرط قبل الرنين. إذا كان الحامل عرضة للانكماش ، فقد لا يوقف الرنين دخول الهواء حيث قد يفشل أي ضغط يتم تطبيقه على الحلقة أو الغطاء. عادةً لا تحتاج مواد إزالة الراتينج إلى رنين لأن المذيب الموجود في الراتينج يحتاج إلى التبخر من أجل التصلب. رغم ذلك ، يقترح جراي أن يتم حلق بلسم كندا لمنعه من التغميق من أكسدة الغلاف الجوي. يمكن استخدام الفازلين الصلب أو شمع البارافين أو شمع العسل أو الفالاب أو طلاء الأظافر كوسائط رنين أو مانع للتسرب. [1] ، [3]

رنين ساترة

نشأ مصطلح "رنين" لأنه تم استخدام أغطية دائرية في البداية وطُبق الغلاف على شكل دائرة أو "حلقة". هناك حاجة إلى مكواة رنين لنشر النوع الصلب من الوسط حول الغطاء. يتم استخدام قطعة نحاسية على شكل حرف T ، يبلغ سمكها حوالي ثُمن البوصة مع الجزء السفلي من القطعة المستقيمة المضمنة في سدادة مطاطية أو مقبض خشبي. أثناء الاستخدام ، يتم تسخين القطعة المتقاطعة في شعلة موقد بنسن ، وتلامسها على سطح عامل الرنين ثم يتم تطبيقها على حواف الغطاء. يمكن تطبيق طلاء الأظافر بفرشاة بلطف. مع ممارسة الرنين قد يتم ببساطة وبسرعة وبصورة نظيفة. [1] ، [5]

  1. يتم تطبيق شمع البارافين بحديد رنين وهو مرض كعامل رنين مؤقت.
  2. خليط راتنج Du noyer الشمع-القولون:

يتم تحضيره عن طريق تسخين 10 أجزاء من شمع البارافين في طبق التبخير وتذويب 40 جزءًا من راتنج الكولوفونيوم. إنه جبل دائم.

يمكن استخدام طلاء الأظافر باللون أو بدونه كوسائط رنين. يمكن أن يستمر تحضير سائل مختوم جيدًا بطلاء الأظافر بضعة أشهر.

يمكن استخدام الأسمنت القائم على الأسفلت كوسائط رنين مباشرة من الأنابيب القابلة للطي مما يجعلها وسيلة تثبيت دائمة. [1] ، [2] ، [5]

تستخدم المعامل المختلفة المواد اللاصقة الاصطناعية في لصق المقاطع والعينات الصغيرة على الشرائح المجهرية. يعتبر RI والاستمرارية مهمين أيضًا كما هو الحال أيضًا مع الأس الهيدروجيني والمكونات الكيميائية للغراء أو المادة التي قد تؤدي إلى تآكل العينة أو حتى تدميرها. الوسائط اللاصقة المستخدمة حاليًا هي راتنجات الإيبوكسي أرالدايت ، السيلوفاز ، راتنجات اللدائن الحرارية الكريستالية ، إلخ. [2]

المواد المتصاعدة للتلوين الكيميائي المناعي (التألق المناعي ووضع العلامات الأنزيمية)

يتم تحديد اختيار وسيط التركيب بعد التلوين الكيميائي المناعي إلى حد كبير بواسطة الملصق (وفي حالة الملصقات الأنزيمية ، الكروموجين) المستخدم لتصور المستضد. يعد وسط التركيب المائي مناسبًا بشكل عام لجميع تركيبات الملصقات / الكروموجين الأنزيمية والملصقات الفلورية. يتم تثبيت العينات المركبة في هذه الوسائط مباشرة من الطور المائي (بدون جفاف أو إزالة). [4]

قد يتأثر انبعاث الفلوريسين أيزوثيوسيانات من الجسم المضاد المسمى في المستحضرات المجهرية بخصائص وسيط التركيب ، على وجه الخصوص ، الأس الهيدروجيني وقوته الأيونية ولزوجته ووجود عوامل التبريد (الكرز ، 1970). يكون الانبعاث الفلوري أكبر في القلوية منه في درجة الحموضة الحمضية (هيراموتو ، بيرنيكي ، يوراند وهاملين ، 1964). وسيط شبه دائم يحتوي على كحول بولي ينيل من الدرجة 51-05 وصف إلفانول 1 وجلسرين بواسطة رودريغيز ودينهاردت في عام 1960. [9]

يجب ألا تحتوي وسائط التركيب المائية للملصقات الفلورية للبروتينات النباتية (فيكويريثرين ، فيكوسيانين) على الجلسرين لأن هذا يروي شدة التلوين. وبالمثل ، يؤدي التعرض لضوء الإثارة لمعظم ملصقات الفلورسنت إلى تقليل تلطيخها ، وهي عملية تُعرف باسم تبييض الصور. [4]

عادةً ما تحتوي وسائط التركيب الفلورية على عوامل مضادة للتلوث تعمل على إبطاء التبييض الضوئي لمثل هذه الملصقات ، مثل 1.4-ديازابيسيكلو [2.2.2] أوكتان (DABCO) والبارافينيلين ديامين ، والتي تعمل كمنظفات الجذور الحرة. [4]

يمكن استخدام الوسائط الراتنجية فقط للملصقات الأنزيمية حيث يكون الراسب المتشكل بين الإنزيم والكروموجين غير قابل للذوبان في الكحول المستخدم أثناء تجفيف الأنسجة. [4]

كل من جودة وشدة إشارة التألق في معظم المستحضرات ذات العلامات المناعية بعد التركيب المائي مثل المحاليل القائمة على كحول البولي فينيل (على سبيل المثال ، Mowiol) تتضاءل ببطء مع مرور الوقت ، وأخيرًا ، تصبح العينات غير مناسبة للفحص. لتجنب هذا ، إيسبادا وآخرون آل. وصف إجراء تركيب غير مائي بسيط للغاية وسريع للخلايا وأقسام الأنسجة المستزرعة ، مما يحافظ على إشارة الفلورسنت بطريقة ممتازة بعد الكشف المناعي. بعد وضع العلامات الفلورية ، يتم تجفيف المستحضرات في الإيثانول ، وتنظيفها في زيلين وتركيبها في DePeX. باستخدام وسيط التركيب غير المائي هذا ، تظل إشارة الفلوريسنت عالية ومستقرة ، مما يسمح بالحفاظ المناسب والدائم على المستحضرات المجهرية الموصوفة والمضادة للبقع. [10]

استخدم فرانكلين وفيليون تقنية جديدة لتأخير تلاشي التألق. تم استخدام مضادات الأكسدة بيتا مركابتوإيثانول (BME) بالاقتران مع المركب الدائم DePeX (DePeX-BME) يتلاشى الفلورسنت المتأخر للميثراميسين والبرتقال أكريدين و Hoechst 33258 كريات الدم الحمراء للدجاج الملون ، كل بدرجات متفاوتة. كان التألق الأولي لجميع الأصباغ التي تم فحصها أكثر كثافة مع DePeX-BME منه مع DePeX وحده. أظهرت العينات المركبة في DePeX-BME تألقًا قويًا وتشكلًا ممتازًا. وخلصوا أيضًا إلى أنه إذا ظلوا في الظلام ، فيمكن تخزينهم إلى أجل غير مسمى دون تلف. أدى تأخير تلاشي التألق باستخدام DePeX-BME إلى تسهيل تحديد كمية حمض الديوكسي ريبونوكلييك باستخدام القياس الخلوي الفلوري. [11]

تصاعد الوسائط ويتلاشى

يعد تلاشي الصور أحد العوامل الرئيسية في صعوبات التشخيص وتخزين الشرائح لفترة طويلة مع عدد قليل من المثبتات. تميل وسائط التركيب المختلفة إلى التلاشي بمرور الوقت. استخدم همفري وبيتمان تقنية قياس ضوئي خلوي بسيطة لتقدير تلاشي البقع للأنسجة الأساسية المضمنة بصبغة الأنيلين والمثبتة في ستة حوامل مختلفة شائعة الاستخدام. تم الكشف عن خبو كبير مع جميع الحوامل الستة ، على الرغم من اختلاف المعدلات. ولوحظ أقل معدل بهتان بزيت الغمر وأعلى معدل بهتان مع بلسم كندا. [12]

أجرى Schmolke الدراسة للعثور على الوسيط الأنسب للتركيب الدائم لأجزاء Araldite المدمجة من قشرة دماغ الأرانب الملطخة باللون الأزرق التولويدين والبيرونين G. من بين أربعة وسائط تركيب اصطناعية تم اختبارها ، منع DePeX فقط من تلاشي الأقسام خلال الشهر الأول. كان متوسط ​​الكثافة البصرية للأقسام بعد عام واحد أعلى في المستحضرات المركبة مع DePeX مقارنة بالأقسام المعالجة بتقنيات التركيب الأخرى التي تم اختبارها في الدراسة. [13]

إن منع بهت شدة التألق الناجم عن ضوء الإثارة مهم جدًا للحصول على صور ثابتة ودقيقة. تتوفر عدة أنواع من وسائط التثبيت (جيل ، 1979 جونسون وآخرون آل. 1981-1982 جيلوه وسيدات 1982 هاريس 1986 كرنيك وآخرون آل. 1989 لونجين وآخرون آل.1993) ، مثل ص- فينيلنديامين (جونسون وآخرون آل. 1981 ، 1982 بلات ومايكل 1983) ، ن-بروبيل غالات (جيلوه وسيدات 1982) و1-4 دابكو (جونسون وآخرون آل. 1982 لانجانجر وآخرون آل. 1983). [14]

تتوفر أيضًا مجموعات مقاومة للبهتان الجاهزة للاستخدام تجاريًا ، مثل مجموعة Slow Fade Light Antifade Kit (مجسات جزيئية Eugene ، OR) ، Perma-Fluor (Lipshaw / Immunon Pittsburgh ، PA) ، FluoroGuard Antifade Reagent (Bio-Rad Laboratories Hercules ، CA) ومجموعة ProLong Antifade (المجسات الجزيئية). [14]

أونو وآخرون آل. مقارنة العديد من الوسائط التجارية والمحلية المضادة للتآكل ، باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤر مقترن بجهاز كمبيوتر. قاموا بقياس تلاشي التألق كميًا لصياغة معادلة ، وتقييم القدرة على التلاشي للعديد من الوسائط المضادة للبهتان واستعادة الصور الباهتة إلى المستوى الأصلي وفقًا لهذه المعادلة. أظهر ProLong أعلى عامل مضاد للبهتان (أ) القيمة. إنه أ ظلت القيمة عالية حتى في ظل الإثارة القوية. ومع ذلك ، فإن ProLong لديه كثافة أولية منخفضة من التألق (م1) القيمة. من ناحية أخرى ، أظهر FluoroGuard ثاني أعلى مستوى أ قيمة ومرتفعة نسبيًا م1 قيمة. [14]

ستودت وآخرون آل. إثبات أن محلولًا يحتوي على 97٪ من ثيوإيثانول (TDE) يعطي تطابقًا مثاليًا مع ن = 1.515 RI للزجاج وزيت الغمر. يمكن دمج العينات البيولوجية الثابتة بسهولة في حلول 97٪ من TDE ، مما يعطي RI موحدًا من العدسة عميقًا جدًا في العينة. [15]

الجمع بين ساترة وجبل

توفر العديد من الشركات المصنعة وسيطًا ذا طبيعة شبيهة بالورنيش ، والذي يمكن استخدامه لتغليف سطح المقطع ، عن طريق الغمس أو السكب أو الرش. هذا النوع من الوسائط يغني عن استخدام ساترة. بالنسبة للفحص المجهري منخفض الطاقة ، قد يثبت التركيب والغطاء المدمجان أنهما مرضيان تمامًا على الرغم من توفير حماية قليلة للقسم للتآكل. [8]

تصاعد المقاطع

هناك العديد من الطرق لتركيب الغطاء على الشرائح ، ولكن مهما كانت الطريقة التي يعمل بها أحدهم فهي جيدة طالما لم يتم تشكيل فقاعات هواء.

  1. يتم تحديد حجم مناسب من ساترة للتركيب ووضعها على ورق النشاف.
  2. يتم وضع قطرة واحدة أو قطرتين من المثبت على المقطع الذي يحتوي على الشريحة ويفضل أن يكون في المنتصف لتجنب محاصرة فقاعات الهواء.
  3. يتم قلب الشريحة بسرعة فوق الغطاء ، ويتم وضع أحد طرفيه على ورق النشاف ويتم خفض الطرف الآخر ببطء حتى يلامس المركب الغطاء.
  4. ينتشر mountant تحت ساترة والشرائح ومع ساترة المرفقة ، مقلوب بسرعة وتوجيه ساترة في مكانها بإبرة تشريح.

بدلاً من ذلك ، أضف الحامل على الشريحة كما هو موضح ،

وضع أحد طرفي ساترة على الشريحة وبمساعدة إبرة تشريح ببطء خفض ساترة في الموضع.

  1. إضافة جبل على ساترة في المركز.
  2. قم بإحضار الشريحة لأسفل (عكس) إلى ساترة واترك التوتر السطحي يسحب الغطاء.

استخدم فقط ما يكفي من mountant لملء المساحة على ساترة / شريحة وليس فائض وهذا التقييم يأتي مع الخبرة.

  • سيتسبب القليل جدًا من الوسائط المتصاعدة في حدوث فقاعة هواء عند حواف الغطاء ، وسيتم إغراء المرء بالضغط لأسفل على الغطاء لضمان إحكام الغلق. يمكن لهذا الضغط أن يسحق أو يشوه الهياكل ثلاثية الأبعاد في العينة.
  • سيؤدي وجود الكثير من الوسائط المتصاعدة إلى فوضى وتحريك العينات حولها ويمكن أن يجعل من المستحيل تصوير العينة في & # 215100 نظرًا لمسافة العمل القصيرة جدًا للعدسة الموضوعية عالية التكبير بالزيت.

فقاعات الهواء: إذا كانت هناك فقاعة هواء فردية واحدة ، فيمكن إزالتها بضغط لطيف ولكن إذا كان هناك العديد منها ، فبدلاً من المطاردة بإبرة تشريح وإضاعة الوقت ، ضع الشريحة مرة أخرى في مادة الزيلين بحيث يتم فصل الغطاء وإعادة الجزء بدون فقاعات هواء. [5]

أي جبل هو الأفضل؟

يقول جوتيريز أنه "لا توجد وسائط متصاعدة مرضية تمامًا". معظم العمال الذين يرغبون في أن تكون حوامل الشرائح الخاصة بهم دائمة قد أعدوا حواملهم الخاصة وأطلقوا عليها "أسماء حيوانات أليفة" ولا يكلفون أنفسهم عناء نشر الوصفة.

تم تصنيع العديد من العلامات التجارية للرفوف في وصفات سرية تم تغيير أسمائها أو وصفاتها ونسخها من قبل آخرين. قد يواجه الحافظ مشكلة عدم معرفة ما يتكون الحامل المتدهور حتى لو كان اسم المركب مكتوبًا على الشريحة لأنه قد لا يكون الوصفة المنشورة. [2]

لاستنتاج العديد من الشركات المصنعة التجارية لديها وسائط تركيب مختلفة ووسائط تركيب خالية من الفلورسنت في كل من الأشكال المائية والراتنج. تلعب RI أيضًا دورًا متساويًا في اختيار الحامل الجيد. ومن ثم ينبغي على المرء أن يختار وسائط التثبيت التي تناسب عرض الأقسام المطلوبة والحفاظ عليها لمزيد من البحث.


هل عملية التجفيف تستخدم مرتين في تحضير الشرائح الدائمة؟ - مادة الاحياء

لقد طلبت ترجمة آلية لمحتوى محدد من قواعد البيانات الخاصة بنا. يتم توفير هذه الوظيفة لراحتك فقط ولا يُقصد بها بأي حال من الأحوال أن تحل محل الترجمة البشرية. لا تقدم BioOne ولا مالكو وناشر المحتوى ، وهم يتنصلون صراحةً من مسؤوليتهم ، أي تعهدات أو ضمانات صريحة أو ضمنية من أي نوع ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، الإقرارات والضمانات فيما يتعلق بوظيفة ميزة الترجمة أو دقة أو اكتمال الترجمات.

لا يتم الاحتفاظ بالترجمات في نظامنا. يخضع استخدامك لهذه الميزة والترجمات لجميع قيود الاستخدام الواردة في شروط وأحكام استخدام موقع BioOne.

تقنية Méndez-Herrera: تقنية تطهير جديدة مقترحة للمراحل غير الناضجة والتركيبات الداخلية للحشرات البالغة

N. Acevedo-Reyes، 1 D. H. Zetina، 1 E. Blanco-Rodríguez، 1، * J. A. López-Buenfil، 1 R. Martínez-Rosas 1

1 Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF)، Servicio Nacional de Sanidad، Inocuidad y Calida


6 خطوات لمعالجة الأنسجة لعلم الأنسجة

1. أخرج قلمك الرصاص

بعد التثبيت ، يتم نقل الأنسجة إلى شريط الأنسجة. تأتي هذه بأحجام مختلفة وتحمل الأنسجة وتحميها أثناء خضوعها للمعالجة.

بمجرد الوصول إلى مرحلة التضمين ، يتم قطع غطاء الكاسيت ويشكل الجزء الرئيسي من الكاسيت قاعدة لكتلة شمع البارافين. يمكن تسمية الكاسيت يدويًا (بقلم رصاص!) أو قد يحتوي معمل الأنسجة الخاص بك على آلة وسم شرائط الكاسيت.

هناك ثلاث خطوات رئيسية في معالجة الأنسجة ، وهي: "الجفاف" و "التطهير" و "التسلل". تتضمن كل خطوة من خطوات طريقة المعالجة نشر المحلول في الأنسجة وتشتت المحلول السابق في السلسلة.

2. كل متعة كاروسيل

في معظم المعاهد الحديثة ومختبرات الأنسجة ، سيتم إجراء المعالجة في آلات معالجة الأنسجة المخصصة. التصميم الأقدم للآلة عبارة عن دائري يحتوي على قفص حيث يتم وضع أشرطة الأنسجة. يحتوي هذا الكاروسيل على عدد من الأكواب الزجاجية التي تحتوي على مذيبات ومحاليل تضمن تجفيف الأنسجة وتنظيفها استعدادًا لتضمين شمع البارافين. The carousel vertically agitates the cage in each solution before moving on to the next solution in the dehydration/clearing method.

The modern processors have a chamber in which the specimens are held and the different solutions are pumped in and out of the chamber. In general, the whole process takes around six hours and is usually set up to run overnight.

3. First, Remove the Water

First, the tissue needs to be dehydrated to remove the water, which is present either free or bound to the tissue. Paraffin wax is hydrophobic, therefore, most of the water in the tissue must be removed before it can be infiltrated with wax. This process is carried out by immersing tissue in a series of ethanol solutions of increasing concentrations until 100%, water-free alcohol is reached. A series of increasing concentrations is used to ensure that the water in the tissue is gradually replaced by the alcohol and to avoid excessive distortion of the tissue.

Various components of the cell are also removed by this process. At the lower end of the ethanol concentrations, water-soluble proteins are removed, whilst towards the 100% ethanol step, certain lipids may be dissolved.

4. Ethanol and Wax Don’t Mix

Although the tissue reaches the final stage of dehydration in 100% ethanol, it’s not possible to proceed straight to wax embedding, as ethanol and wax don’t mix!

This is where ‘clearing’ comes in. The term ‘clearing’ refers to the property of the solvents used – they have a relatively high refractive index and when tissue is immersed in it, it becomes transparent and clear.

5. It’s Becoming Clearer…

The solvent used for this intermediate stage is usually xylene. The ‘clearing agent’ needs to be miscible with both ethanol and paraffin wax. Following dehydration, the tissue is immersed in one to three different xylene immersions. In these stages, the ethanol is gradually replaced with xylene and when the tissue is embedded, the xylene will be replaced by the molten paraffin wax.

Shrinkage of tissue can occur at these final stages as the xylene also removes fat residues left in the samples.

6. At Last – A Block!

The final stages are called ‘infiltration’ and ‘blocking out’. Infiltration is when the final xylene is replaced with molten wax, which infiltrates the tissue. Again, this is typically three different wax immersions to ensure that none of the clearing agent remains in the tissue.

After the final infiltration, the tissue cassettes are transferred to an embedding station. This machine has reservoirs of molten wax, hotplates, and a cold plate for setting the blocks. The infiltrated tissue is removed from the cassette and orientated within a suitably sized metal mold. The mold is filled with molten wax, the main part of the labeled cassette is placed on top and this is also filled with wax. The whole mold is transferred to the cold plate to finally set.

That ends the journey from tissue to wax block, which is, I guess, the start of another journey of sectioning, making slides, and immunohistochemistry!

Finally, below is a table that highlights the typical main stages of tissue processing for histology.

الجدول 1. Main stages of tissue processing for histology.

معالجةحلزمن
تجفيف70% alcohol60 mins
تجفيف90% alcohol45 mins
تجفيفAbsolute alcohol45 mins
تجفيفAbsolute alcohol45 mins
تجفيفAbsolute alcohol60 mins
ClearingXylene60 mins
ClearingXylene60 mins
ClearingXylene60 mins
InfiltrationParaffin wax30 mins
InfiltrationParaffin wax60 mins
InfiltrationParaffin wax90 mins
Blocking OutParaffin waxn/a

Do you have any questions about tissue processing for histology? Leave a comment below!

Originally published December 10, 2013. Reviewed and updated on November 10, 2020.


Webinar transcript

Immunocytochemistry or ICC is a technique that uses antibodies to visualize the localization of particular proteins within single cells. This video outlines slide preparation from suspension cells followed by fixation, permeabilization, blocking and antibody incubation. Assemble the cytospin equipment before removing the cells from the incubator.

The cytospin deposits thin layer preparations of suspension cells onto slides. Lay the cells and set it running. The cell density, loading volume and spin speed should be optimized for each cell type. For example, larger cells require a slower speed. Unload the slides carefully and place them in a slide tray to dry . before transferring them onto a slide rack.

Ideally, the cell should be fixed immediately. Therefore, place the rack of slides into a pot of fixative and incubate for 5-10 minutes. Next, wash the slides by transferring them sequentially into two pots of Phosphate Buffered Saline, PBS.

Once fixed they can be stored for a short period of time in the fridge but keep them moist. The type of fixative used, and the fixation time will require optimization. The most commonly used fixatives are paraformaldehyde and methanol. However, it is advisable to check the date sheets of the primary antibodies you intend to use for guidance.

Remove the slides from the rack and tap off excess PBS. Draw a hydrophobic barrier around the cells using a PAP pen. This will keep reagents pooled in a small droplet over the cells. It is important to ensure the cells do not dry out during this process. Carefully prepare the permeabilization buffer onto the cells and incubate for five minutes.

The permeabilization step allows antibodies to access intracellular epitopes and will need optimizing depending on the cell type, antigen and intended antibody.

There are a number of different permeabilization agents that can be used. For example, Triton X-100 and for very gentle permeabilization, Tween-20. You do not need to permeabilize if the cells were previously fixed in methanol.

Once the cells are permeabilized, tap excess buffer off the slides and wash in Phosphate Buffered Saline plus Tween-20, PBST, on a shaker for five minutes. Repeat with fresh PBST for a total of three wash steps. Once the washes are complete leave the slides in your wash buffer to avoid them drying out.

While your slides are washing, dampen some paper towel and use it to line a slide tray. This will help to keep your slides moist during the next step. Remove excess buffer from your slides and re-draw your PAP pen circles as they may have partially washed off.

To prevent non-specific antibody binding, the cells need to be blocked. In this case, the cells are blocked in 10% serum and one percent Bovine Serum Albumin, BSA, for one hour at room temperature. The type of blocking buffer and incubation time should be optimized for your experiment.

Note if the cells have been fixed in paraformaldehyde it is common practice to wash with glycine before blocking to quench any remaining fixative. Ideally the species of serum in the blocking buffer should match the species the secondary antibody was raised in to avoid any cross-reactivity.

Whilst the cells are in blocking buffer, prepare the primary antibodies. After blocking, the cells need to be washed three times for five minutes in PBST as before. Remove any excess wash buffer and re-draw the PAP pen circles as they may have partially washed off.

Place your slides in the line slide tray and add your primary antibody solution. Do this one slide at a time to avoid drying. Place a lid on your tray and carefully transfer it to a fridge to incubate overnight.

Wash the slides three times for five minutes in PBST to remove any unbound primary antibody. If the primary antibodies weren't directly conjugated, incubate the cells for one hour at room temperature with secondary antibodies. Nuclear stains such as Hoechst can be included at this point too. Then wash the slides three times again in PBST.

Tap excess buffer off your first slide and place on a slide tray. It is best to deal with one slide at a time to avoid drying. Add a droplet of compatible mounting medium onto the cells ensuring no air bubbles are created.

Using a pair of forceps lower the cover slip down onto the mounting medium allowing the liquid to spread out gradually. Avoid putting any pressure on your slides as this may damage your cells. The slides are now ready for imaging using a confocal microscope or can be stored in the fridge for a short period of time.


Cell Staining Protocol for Microscopy

Microscopy refers to the practice that involves the use of a microscope for the purposes of observing small scale structures that cannot be viewed using the naked eye and often cell staining is necessary as s tructures are difficult to discern due to insufficient contrast.

Cell staining is a technique used for the main purpose of increasing contrast through changing the color of some of the parts of the structure being observed thus allowing for a clearer view. There are a variety of stains that can be used in microscopy.

First of all, staining can be in-vivo or in-vitro. The difference between these is that whereas In-vivo staining refers to the staining of a biological matter while it is still alive, i n-vitro staining refers to a staining technique where the biological matter is non-living.

The following are common stains explaining techniques, preparations and procedures for each:

Haematoxylin and Eosin Staining

These are two stains used in the examination of thin slices of biological tissue. Contrast is created by the stains where Haematoxylin turns the nuclei blue while eosin turns the cytoplasm as well as other parts pink or red.

1- Measure 10 grams of haematoxylin crystals 500 ml of water (70- 80 degrees centigrade) and mix to dilute completely

2- In a separate flask, measure 20 grams of alum and mix with 500 ml of hot tap water (70- 80 degrees)

3- Mix the two mixtures together (1 and 2)

Whereas alum is the mordant, thymol prevents fungal growth.

5- The mixture is then kept in a translucent flask away from direct sunlight for one week. This is covered with a paper towel that allows for air circulation (early maturation). The solution is then put in to a dark flask and topped tightly after one week, and stored in a dark place for 3 weeks. (Late maturation)

1- Measure 10 grams of eosin crystals and add to mix in 1000ml of hot tap water (70- 80 degrees). This should be mixed to dilute and stored in a dark flask. This can be used directly.

1- A rehydrated section is stained in a solution of haematoxylin for 20 to 40 minutes

2- The section is then washed in tap water for about 3 minutes until it turns blue,

3- The section is the differentiated in 70percent ethanol that contains 1 percent of HCL for about 5 seconds to remove excess dye and allow the nuclear to emerge,

This is then washed in tap water,

5- Stain with eosin for 10 minutes,

6- Then wash for about 1 to 5 minutes in tap water,

7- Dehydration, clear and mount on a rack

Haematoxylin-Eosin Stain Kaposi's Sarcoma lesion - Cambridge University Press http://www.cambridge.org

Papanicolaou Staining

This is also referred to as pap-staining or pap smear. It is used for the purposes of examining cell samples that have been obtained from body fluids.

The technique involves the combination of chemicals that include:

ا Light green SF yellowish,

ACCUMATE differentiating solution is made ready for use. A substitute of Scott's Tap water is prepared through mixing a part of Scott's Tap water substitute concentrate with 9 parts of deionized water. This is then followed by filtering papanicolaou staining system reagents before use.

1- Fix the slides in acetic fixative for 15 minutes,

2- Absolute alcohol for two minutes,

3- 70 percent of alcohol for 2 minutes,

4- in 50 percent for 2 minutes

5- Tap water for 2 minutes,

6- deep in haematoxylin for 4 minutes,

7- Briefly rinse in tap water,

8- Differentiate in acid alcohol for about 5 seconds,

10- Dehydrate using absolute alcohol two times,

11- Stain in orange G for ten seconds,

12- Rinse in absolute alcohol two times

13- Stain in E.A 50 for two minutes,

14- Stain in absolute alcohol two time,

15- Clear in xylene three times,

16- Mount the slide on xylene three times,

أ) Presence of a psammoma body in absence of atypical cells in cervicovaginal smear (Papanicolaou stain, 200×) ب) Serous ovarian cystoadenofibroma with parietal psammoma bodies (Hematoxylin and Eosin, 100×).

Pusiol وآخرون. CytoJournal 2008 5:7

Acid and Basic Fuchsin وصمة

Acid fuchsin is a magenta red acid dye that is largely used for plasma staining whereas basic fuchsin is a magenta basic dye largely used to stain the nucleus.

The technique is also referred to as acid fast staining. The acid fast bacteria have a waxy substance ( mycolic acid) on their cell wall that makes them impermeable to staining procedures.

The term acid fast is used since they resist decolourization with acid alcohol. Carbol fuchsin , the primary stain contains phenol, which helps solubilize the cell wall whereas heat is used to increase the penetration of the stain.

On using alcohol to decolorize, cells will be decolorized except for acid fast ones. Methylene blue is used as the counterstain to any cell that was decolorized. At the end of the procedure, acid fast cells remain red/pink while non-acid fast cells retain a blue color.

Preparation of carbol fuchsin by mixing two solutions:

Solution 1- 0.2 grams of basic fuchsin and 10 ml of 95 percent ethanol,

Solution 2- 5 grams phenol and 90 ml of distilled water,

1- Swab pulp larvae together so as to allow the pulp to spread over the slide and allow to dry

2- Heat fix by flaming over a burner several times,

3- Flood using 0.2 percent of carbol fuchsin for about 30 seconds,

4- Wash off the stain and then air dry/gently blot dry before examination

A photomicrograph of المتفطرة اللطخة (pink) and Micrococcus luteus (blue) 1000x magnification. المتفطرة اللطخة is acid-fast, retaining the carbol fuchsin dye, thus appearing pink. Micrococcus luteus is not acid-fast, loses the carbol fuchsin during decolorization, and is counter-stained with methylene blue.

Image from: http://inst.bact.wisc.edu

Wright's Stain

This is a Romanowsky type of metachromatic stain that is prepared by mixing specially treated methylene blue dye with eosin.

The acidic portion of the stain unites with the basic components of the cells such as hemoglobin, and thus they are referred to as eosinophilic and are stained pink or red.

The acidic components of the cell, such as the nucleic acids on the other hand take the basic dye and stain blue or purple.

PH has to be controlled using a buffer of 6.4 to 6.7 to avoid poor staining.

ا M easure 1.0 grams of wright's stain powder and 400 ml of methanol (methyl alcohol),

ا A dd a few glass beads to assist in dissolving and add the ethanol to the stain,

ا M ix well at intervals until the powder has completely dissolved (do this by warming in 37 C water bath to aid in the dissolving),

ا L abel the bottles and mark it as flammable and toxic,

ا T ightly atop and store at room temperature in the dark

1- Prepare a fill of the sample and allow drying on a slide,

2- Prepare three containers, and fill one with one step Wright’s Stain and the other two with distilled water,

3- Keep the stain tightly covered when not in use to avoid evaporation (always replace the stain once it becomes insufficient)

4- Always replace distilled water once iridescent scum start forming on the surface, or when it starts turning blue,

5- Dip the slide in the stain for 15 to 20 seconds,

6- Dip the slide in distilled water in the second container for 15- 45 seconds,

7- Dip the slide in container 3 for 25 seconds using quick dips,

8- Wipe the back of the slide,

9- Dry the slide on a vertical position, on the absorbent surface and avoid blotting the smear,

10- Apply oil to examine microscopically,

These steps should be repeated two times for marrow smears.

1- Prepare the sample and allow to air dry,

2- Place the slide on a rack,

3- Apply the one step wright's stain using dropper bottles,

4- Wait for about 15-30 seconds and add similar volumes of distilled water,

5- Pour stain and water mixture off the slide,

6- Dip the slide in distilled water for about 25 seconds using quick dips,

7- Wipe the back side of the slide,

8- Dry the slide in a vertical position on the absorbent side and avoid blotting the smear,

These steps should be repeated twice for bone marrow samples.

Image from: http://www.vetmed.vt.edu

Gram Staining

This is one of the most common staining techniques.

It is largely used to differentiate bacteria species as either gram positive or gram negative. This is achieved through the chemical properties of bacterial cell walls, where different colors are displayed after staining.

This technique is based on the fact that the gram positive cell wall has a strong attraction for crystal violet following the addition of iodine as compared to the cell wall of gram negative.

Iodine is the mordant, and forms a complex with crystal violet, which is easily washed off from the gram negative cell wall using ethyl alcohol.

Cell staining in Microscopy is useful and necessary to highlight those structual elements of your sample/specimen to be properly observed. There are others that MicroscopeMaster may cover in the future so bookmark this page and revisit to see further staining information.

Learn more about Cell Culture, Cell Division, Cell Differentiation as well as Tissue Culture Types and Techniques. And take a look at the reasons to consider purchasing a Microscope Staining Kit.

Mallory F.B. A.M, M.D. S.D. Pathological Technique. Philadelphia & London. W.B. Sunders Company. Copyright, 1938, by W.B. Sunders Company. Reprinted June, 1942 and September, 1944. Pgs. 70 and 9

Johnson PL, Klein MN: Application of Papanicolaou stain to paraffin sections. Stain Technol 31:223, 1956

Delisle, G., and L. Tomalty. 2002. Mycobacterium tuberculosis. MicrobeLibrary, American Society for Microbiology, Washington, DC.

MicroscopeMaster.com is a participant in the Amazon Services LLC Associates Program, an affiliate advertising program designed to provide a means to earn fees by linking to Amazon.com and affiliated sites.

The material on this page is not medical advice and is not to be used for diagnosis or treatment. Although care has been taken when preparing this page, its accuracy cannot be guaranteed. Scientific understanding changes over time.

** Be sure to take the utmost precaution and care when performing a microscope experiment. MicroscopeMaster is not liable for your results or any personal issues resulting from performing the experiment. The MicroscopeMaster website is for educational purposes only.


الاستنتاجات

The isolation of RNA from FFPE tissue is feasible. Unfortunately, current practices in the biomedical community vary and lack the standardization required for sensitive molecular interrogation. Fundamentally, tissue must be handled in a standardized fashion, similar to how blood and other body fluids are used in routine clinical assays. Analysis of tissue has been called cellular chemistry, and a specimen must meet a specification for the analysis to be consistent and reliable. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue is not currently handled in a fashion consistent with the protocols for analytes used in molecular analysis. Educating the community, including pathologists, clinicians and researchers, is essential for bringing RNA-based assays into the clinical setting (Table 1). Cooperation is needed to advance the design of protocols to maximize both research and patient benefit.


شاهد الفيديو: حذف الشريحة (كانون الثاني 2022).