معلومة

4.12: الأيض الوسيط - علم الأحياء


المصدر المباشر للطاقة لمعظم الخلايا هو الجلوكوز. يمكن استخدام الكربوهيدرات والدهون والبروتينات الأخرى في خلايا معينة أو في أوقات معينة كمصدر لـ ATP. إن تعقيد الآلية التي تستخدم بها الخلايا الجلوكوز قد يجعلك تأمل بشدة ألا تكون هناك حاجة إلى نظام مشابه لكل نوع من أنواع الوقود. وبالفعل ليس كذلك.

واحدة من المزايا الرائعة لأكسدة الجلوكوز خطوة بخطوة إلى ثاني أكسيد الكربون2 و ح2O هو أن العديد من المركبات الوسيطة التي تشكلت في العملية تربط استقلاب الجلوكوز بعملية التمثيل الغذائي لجزيئات الطعام الأخرى.

على سبيل المثال ، عند استخدام الدهون كوقود ، يتم تحويل جزء الجلسرين من الجزيء إلى PGAL ويدخل في مسار تحلل السكر في تلك المرحلة. يتم تحويل الأحماض الدهنية إلى جزيئات من أسيتيل CoA وتدخل المسار التنفسي لتتأكسد في الميتوكوندريا. يمكن أيضًا أن تعمل الأحماض الأمينية التي يتم تحريرها عن طريق التحلل المائي للبروتينات كوقود.

  • أولاً ، يتم إزالة النيتروجين ، وهي عملية تسمى نزع الأمين.
  • ثم تدخل الأجزاء المتبقية المسار التنفسي في عدة نقاط.

على سبيل المثال ،

  • يتم تحويل الأحماض الأمينية Gly و Ser و Ala و Cys إلى حمض البيروفيك وتدخل الميتوكوندريا ليتم تنفسها.
  • تعمل acetyl-CoA والعديد من المركبات الوسيطة في دورة حامض الستريك كنقاط دخول لشظايا الأحماض الأمينية الأخرى (الموضحة باللون الأزرق).

وبالتالي تسمح هذه الروابط بالتنفس للدهون والبروتينات الزائدة في النظام الغذائي. ليست هناك حاجة إلى آلية خاصة للتنفس الخلوي من قبل تلك الحيوانات التي تعتمد إلى حد كبير على الدهون المبتلعة (مثل العديد من الطيور) أو البروتينات (مثل الحيوانات آكلة اللحوم) لإمدادها بالطاقة.

يتم تحويل الكثير من البروتين الذي نستهلكه في النهاية إلى جلوكوز (عملية تسمى استحداث السكر) لتوفير الوقود للدماغ والأنسجة الأخرى. على الرغم من أن جميع أطعمتنا قابلة للتحويل إلى حد ما ، إلا أنها ليست كذلك تمامًا. بمعنى آخر ، لا يوجد طعام واحد يمكنه توفير جميع احتياجاتنا الابتنائية. يمكننا بالفعل تصنيع العديد من الدهون من الجلوكوز ، ولكن لا يمكن تصنيع بعض الدهون غير المشبعة ويجب تناولها مباشرة في نظامنا الغذائي. هذه هي حمض اللينوليك وحمض اللينولينيك وحمض الأراكيدونيك. كلها غير مشبعة. وهذا هو ، روابط مزدوجة. على الرغم من أنه يمكننا تصنيع 11 من الأحماض الأمينية من سلائف الكربوهيدرات ، يجب أن نحصل على 9 أحماض أمينية أخرى ("الأحماض الأمينية الأساسية") مباشرة.

تعمل العديد من النقاط التي تربط استقلاب الكربوهيدرات بهدم الدهون والبروتينات كصمامات ثنائية الاتجاه (يُشار إليها في الشكل بواسطة الأسهم ذات الرأسين). أنها توفر نقاط دخول ليس فقط لتقويض (التنفس الخلوي) من الأحماض الدهنية ، الجلسرين ، والأحماض الأمينية ، ولكن لتركيبها (الابتنائية) كذلك. وبالتالي يمكن أن يؤدي الانهيار التقويضي للنشويات (من خلال acetyl-CoA و PGAL) إلى تخليق الدهون.

يمثل الفركتوز مشكلة خاصة

يتم إنتاج الفركتوز عن طريق هضم السكروز ثنائي السكاريد (سكر المائدة الشائع) في السكريات الأحادية الجلوكوز والفركتوز. يشترك كل من الجلوكوز والفركتوز في نفس الصيغة التجريبية (C6ح12ا6) ونفس محتوى السعرات الحرارية (686 كيلو كالوري / مول). لكن الجسم يعاملهم بشكل مختلف تمامًا.

يتم امتصاص الجلوكوز واستقلابه من قبل جميع الخلايا لتوليد ATP عن طريق تحلل السكر والتنفس الخلوي ، ويتم تحويل الجلوكوز الزائد بشكل تفضيلي إلى جليكوجين بدلاً من الدهون. يتم تناول الفركتوز فقط عن طريق خلايا الكبد ، ويتم تحويل الفركتوز الزائد إلى الدهون (الأحماض الدهنية والجلسرين). في الولايات المتحدة ، يتم الآن تحلية معظم المشروبات الغازية والأطعمة الجاهزة بشراب الذرة عالي الفركتوز (60٪ فركتوز ، 40٪ جلوكوز). قد يكون الاستهلاك المفرط لهذه المنتجات مرتبطًا بالانتشار المتزايد في الولايات المتحدة للسمنة ومرض السكري من النوع 2.


هل سيكون التمثيل الغذائي الوسيط مجالًا ساخنًا للبيولوجيا مرة أخرى؟

عدد 3 ديسمبر من علم تميزت بقسم خاص عن التمثيل الغذائي ، برئاسة مقالة تمهيدية بعنوان & # 8220 التمثيل الغذائي ليس مملاً & # 8221.

بالعودة إلى العشرينيات وحتى الخمسينيات من القرن الماضي ، كان التمثيل الغذائي الوسيط مجالًا ساخنًا في علم الأحياء. توج هذا بمنح جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب في عام 1953 لهانس كريبس & # 8220 لاكتشافه لدورة حامض الستريك & # 8221 و Fritz Lipmann & # 8220 لاكتشافه الإنزيم A وأهميته في التمثيل الغذائي الوسيط & # 8221.

كما يعلم معظمكم ، في نفس العام ، 1953 ، نشر واتسون وكريك بنية الحمض النووي ، والتي فازت بجائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب في عام 1962. بدأ هذا العصر العظيم للبيولوجيا الجزيئية. نتيجة للنجاح الباهر للبيولوجيا الجزيئية ، تراجعت دراسة الأيض الوسيط في الخلفية. تتطلب الإجابة على معظم الأسئلة في علم الأحياء المتقدم اهتمامًا ضئيلًا أو معدومًا لعملية التمثيل الغذائي الوسيط. ومع ذلك ، كما نوقش في مقالة المراجعة بواسطة Steven L. McKnight المدرجة في القسم الخاص ، فإن التمثيل الغذائي يأتي في مقدمة الطب الحيوي مرة أخرى. تظهر الآن مشكلات البحث التي تتطلب النظر في البيولوجيا الجزيئية والتمثيل الغذائي على أنها تحديات مهمة ومثيرة للاهتمام.

لطالما كانت اعتبارات الأيض الوسيط مهمة في دراسة ما يعرف بأمراض التمثيل الغذائي ، وخاصة مرض السكري من النوع 2 والسمنة والحالات ذات الصلة مثل عسر شحميات الدم. ومع ذلك ، كما هو مفصل في مقال McKnight وفي مقال بقلم Arnold J. Levine وآنا إم. إنتاج "oncometabolites" التي تدعم نمو الخلايا السرطانية.

في مقال على هذه المدونة بتاريخ 31 ديسمبر 2009 ، ناقشنا البحث في استقلاب السرطان الذي يقف وراء المنصة التكنولوجية لشركة Agios Pharmaceuticals (كامبريدج ، ماساتشوستس). في هذه المقالة ، سلطنا الضوء على اكتشاف أن الطفرات في إنزيم استقلابي ، نازع هيدروجين الإيزوسيترات العصاري الخلوي (IDH1) هي عامل مسبب لمجموعة فرعية رئيسية من سرطانات الدماغ البشري. يحفز الشكل البري من IDH1 NADP + المؤكسد المعتمد على نزع الكربوكسيل من isocitrate إلى α-ketoglutarate. ومع ذلك ، فإن الأشكال المتحولة لـ IDH1 تحفز الاختزال المعتمد على NADPH لـ α-ketoglutarate إلى R (-) - 2-hydroxyglutarate (2HG). يبدو أن 2HG عبارة عن مركب oncometabolite يشارك في تطور الأورام الدبقية منخفضة الدرجة إلى ورم أرومي دبقي ثانوي مميت. توصل باحثو Agios ومعاونوهم الأكاديميون لاحقًا إلى حدوث طفرات في إنزيمات isocitrate dehydrogenase وإنتاج مركب oncometabolite 2HG في التسبب في ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML).

تمت مناقشة تأثير Warburg أيضًا في مقالتنا ، حيث تقوم الخلايا السرطانية بإجراء تحلل السكر الهوائي (تحويل الجلوكوز إلى لاكتات ، مع إنتاج جزيئين من ATP حتى في وجود الأكسجين). في المقابل ، تستقلب معظم خلايا الثدييات الطبيعية الجلوكوز إلى ثاني أكسيد الكربون والماء عن طريق تحلل السكر المقترن بدورة حمض الستريك في الميتوكوندريا ، مما ينتج عنه 36 جزيء من ATP. أظهر لويس كانتلي ، المؤسس العلمي لشركة Agios ورائد نقل الإشارات ، أن هناك علاقة بين نقل الإشارات بوساطة عامل النمو والتحلل الهوائي للجلوكوز في الخلايا السرطانية. على وجه الخصوص ، وجد الدكتور كانتلي وزملاؤه أن بيروفات كيناز M2 (PKM2) هو رابط بين نقل الإشارة والتحلل الهوائي. يرتبط PKM2 ببروتينات التأشير التيروزينية الفسفورية ، مما يؤدي إلى تحويل المستقلبات الحالة للجلوكوز من إنتاج الطاقة عبر الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا إلى العمليات الابتنائية اللازمة للانتشار السريع للخلايا السرطانية.

تناقش أوراق McKnight و Levine و Puzio-Kuter أيضًا تأثير Warburg في الخلايا السرطانية ، ودور الطفرات في العديد من الإنزيمات الأيضية التي تساهم في الأنماط الظاهرية الخبيثة. تشير مقالة McKnight إلى أنه بالإضافة إلى الطفرات السائدة في نازعات هيدروجين الأيزوسيترات ، ترتبط الطفرات المتنحية النادرة في فومارات هيدراتاز ونزعة هيدروجين السكسينات أيضًا بالسرطان. تؤدي الطفرات في جينات هذه الإنزيمات ، إلى جانب فقدان الأليل من النوع البري ، إلى ارتفاع مستويات الفومارات والسكسينات داخل الخلايا على التوالي. يبدو أن هذه تعمل كمستقلبات يمكن أن تحفز تنشيط مسار استجابة نقص الأكسجة ، مما يؤدي إلى تحريض تحلل السكر الهوائي (تأثير واربورغ) وتكوين الأوعية.

تناقش ورقة Levine و Puzio-Kuter أيضًا دور الجينات المسرطنة والجينات الكابتة للورم ومساراتها في تنظيم التمثيل الغذائي وخاصة في إحداث تأثير واربورغ. على سبيل المثال ، يمنع تنظيم p53 تأثير Warburg ويعزز التمثيل الغذائي التأكسدي للميتوكوندريا. وبالتالي فإن فقدان وظيفة p53 الملحوظ في معظم السرطانات البشرية يميل إلى تعزيز تحلل السكر الهوائي. تشمل مسارات الإشارات الأخرى التي تورطت في التغيرات المرتبطة بالسرطان في التمثيل الغذائي مساري Akt و mTOR ، والتي تتغير كثيرًا بسبب الطفرات في الجينات الرئيسية (على سبيل المثال ، الطفرات في PTEN وتضخيم مستقبلات عامل النمو مثل Her2 و EGFR) في السرطان . يؤدي تحرير هذه المسارات إلى تنشيط مسار الاستجابة لنقص الأكسجة ، وبالتالي إطلاق تأثير واربورغ.

يقترح Levine و Puzio-Kuter أن البحث الذي يهدف إلى فهم أعمق لكيفية تنظيم مسارات الإشارات المرتبطة بالسرطان لمسارات التمثيل الغذائي البيوكيميائية وتحفيز تأثير واربورغ ، ودور تأثير واربورغ في التسبب في الإصابة بالسرطان ، قد يؤدي إلى استراتيجيات جديدة لاكتشاف الأدوية في علم الأورام.

يتضمن القسم الخاص بالتمثيل الغذائي أيضًا مقالًا عن الالتهام الذاتي ، وهي عملية تقوم من خلالها الخلايا بتفكيك المكونات الخلوية من أجل القضاء على الجزيئات الحيوية والعضيات التالفة أو لتوفير ركائز لعملية التمثيل الغذائي في حالة الجوع. على الرغم من أن الالتهام الذاتي يعزز صحة الخلايا ويمكن أن يمنع الأمراض التنكسية ، إلا أنه يمكنه أيضًا تمكين الخلايا السرطانية من البقاء على قيد الحياة في الأورام الفقيرة بالمغذيات.

هناك أيضًا مراجعة بواسطة Jay Keasling حول الهندسة الأيضية لإنتاج مواد مثل عقاقير المنتجات الطبيعية والمواد الكيميائية والوقود الحيوي. الهندسة الأيضية هي فرع من فروع البيولوجيا التركيبية التي تصمم مسارات التمثيل الغذائي لإنتاج مثل هذه المواد ، ومن ثم تم إدراج هذه المراجعة في القسم الخاص بالتمثيل الغذائي. لدينا العديد من المقالات حول البيولوجيا التركيبية في هذه المدونة ، يركز معظمها على الهندسة الأيضية ودورها في تصنيع الأدوية واكتشاف الأدوية.

إجمالاً ، فإن القسم الخاص بالتمثيل الغذائي في 3 ديسمبر يستحق القراءة من قبل الباحثين الأساسيين والباحثين في مجال اكتشاف وتطوير الأدوية في شركات التكنولوجيا الحيوية والأدوية. قد يوسع آفاقك ويؤدي إلى أفكار جديدة للبحث والتطوير أو الشراكة ، لا سيما في اكتشاف أدوية الأورام.
___________________________________________________

بصفتك منتجي هذه المدونة ، وكمستشارين في مجال التكنولوجيا الحيوية وصناعة الأدوية ، تود شركة Haberman Associates أن تسمع منك. إذا كنت تعمل في شركة تكنولوجيا حيوية أو شركة أدوية ، وترغب في إجراء مناقشة هاتفية مدتها 15-20 دقيقة ، دون التزام بشأن المشكلات التي أثارتها هذه المدونة أو مقالات أخرى في المدونة ، أو حول المشكلات الأخرى التي تهم شركتك ، فالرجاء النقر هنا. نرحب أيضًا بتعليقاتكم على هذا أو أي مقال آخر في هذه المدونة.


1 المقدمة

يتكون التمثيل الغذائي من مجموعة كاملة من التفاعلات الكيميائية التي تحدث في الكائن الحي والتي تسمح له بالتكاثر والتطوير والحفاظ على بنيته والاستجابة للبيئة. تشكل هذه التفاعلات الكيميائية شبكة معقدة من المسارات والدورات التي يتم فيها تحديد تدفق نواتج التفاعل (المستقلبات) بواسطة العديد من الآليات التنظيمية. تقليديا ، ينقسم التمثيل الغذائي إلى تقويض ، وتحطيم الجزيئات المعقدة ، والأيض ، والعمليات المتعلقة بتوليف المواد العضوية المعقدة.

وفقًا للتعريف الوارد أعلاه ، يشمل التمثيل الغذائي كل عملية خلوية ، بدءًا من تكرار الحمض النووي إلى النسخ والترجمة إلى وظيفة الإنزيم ، كما يتضمن أيضًا كيمياء الجزيئات الصغيرة في الخلية. في هذا الفصل ، سوف نركز على التمثيل الغذائي الوسيط ، والذي يصف جميع التفاعلات المتعلقة بتخزين وتوليد الطاقة الأيضية اللازمة للتخليق الحيوي للمركبات منخفضة الوزن الجزيئي ومركبات تخزين الطاقة (ماثيوز وفان هولد ، 1996). في مسار التمثيل الغذائي الوسيط ، تلعب بنية كل إنزيم دورًا مهمًا في تحديد الخصائص المحددة لكل تفاعل.

في أوائل السبعينيات ، قدم برينر أنواع معينة انيقة كنموذج وراثي متعدد الخلايا ، ويرجع ذلك أساسًا إلى أن هذا الكائن الحي يحتوي على عدد قليل جدًا من الخلايا الجسدية ، مما جعل من الممكن للباحثين إعادة بناء سلالة الخلية ورسم خريطة أسلاك الجهاز العصبي (برينر ، 1974). منذ ذلك الحين ، أصبحت واحدة من أقوى الأدوات لدراسة علم الوراثة لتطور الميتازوان ، وعلم الأعصاب ، والشيخوخة والعديد من العمليات البيولوجية الأخرى. ومع ذلك ، فإن هذه الدودة أقل قابلية للدراسة البيوكيميائية الكلاسيكية. يصعب أحيانًا الحصول على كميات كبيرة من الأفراد المتزامنين من قشر البيض والجلد الذي يمثل حواجز صعبة ومن المستحيل فعليًا جمع الأنسجة النقية بكميات ذات صلة كيميائيًا حيويًا (Mains and McGhee ، 1999). ومع ذلك ، فقد سمحت لنا العديد من الدراسات الأيضية للنيماتودا التي تعيش بحرية والديدان الخيطية الطفيلية (Bolla ، 1980) باكتساب رؤى أعمق للأحداث الكيميائية الحيوية المعقدة التي تدعم حياة C. ايليجانس .

يتم الحفاظ على شبكة التمثيل الغذائي الوسيطة جيدًا بين حقيقيات النوى ، كما أن المسارات الأيضية الرئيسية الموجودة في الكائنات غيرية التغذية موجودة أيضًا في C. ايليجانس (فاستريك وآخرون ، 2007). في القسم الأول من هذا الفصل ، سنشرح خصائص هذه المسارات العامة في دراستنا C. ايليجانس نموذج. سنركز لاحقًا على المركبات الحيوية التي لا يمكن تصنيعها بواسطتها C. ايليجانس وبالتالي يجب استخراجه من البيئة. ستتم مناقشة الفيتامينات والأحماض الأمينية الأساسية والمركبات الأخرى ذات الصلة في القسم الخاص بالمتطلبات الغذائية. في نهاية هذا الفصل ، سيتم أيضًا تقديم لمحة موجزة عن منتجات النفايات الأيضية المختلفة وتخزين وإنتاج الطاقة الأيضية في C. ايليجانس .

في العديد من التقاطعات داخل شبكة التمثيل الغذائي ، يمكن تحويل تدفق المستقلبات إلى اتجاه محدد وفقًا لحاجة الكائن الحي في تلك اللحظة بالذات. يمكن أن تحدث هذه التحولات الأيضية على الفور ، على سبيل المثال كاستجابة للبيئات المتغيرة ، أو بشكل أبطأ على مدار C. ايليجانس دورة الحياة. في القسم 6 ، سنشرح بعض التغييرات الأيضية النموذجية التي تحدث من مرحلة التطور الجنيني إلى المرحلة اليرقية الأخيرة ، بما في ذلك مرحلة dauer المتخصصة. سنركز أيضًا على التغيرات الأيضية التي تصاحب عملية شيخوخة الدودة ، والتقلبات الكبيرة في العوامل البيئية الحيوية وغير الحيوية التي قد تواجهها التربة. C. ايليجانس . أخيرًا ، سنناقش أنماط التمثيل الغذائي التي تنشأ بسبب التغيرات في درجة الحرارة ، أو تقييد الطعام ، أو الحرمان من الأكسجين أو الإجهاد التناضحي.


تحدد بيولوجيا الشبكة القائمة على التعبير التغيير في المسارات التنظيمية الرئيسية لمرض السكري من النوع 2 والمخاطر / المضاعفات المرتبطة به

داء السكري من النوع الثاني (T2D) هو مرض متعدد العوامل وغير متجانس وراثيًا يؤدي إلى ضعف توازن الجلوكوز ومقاومة الأنسولين. يسبب الشكل المتقدم للمرض مضاعفات حادة في القلب والأوعية الدموية والكلى والعصبية والأوعية الدموية الدقيقة. وبالتالي ، هناك حاجة مستمرة لاكتشاف علاج جديد وفعال ضد المرض من خلال السعي للكشف عن مختلف آليات الإشارات البديلة الجديدة التي يمكن أن تؤدي إلى مرض السكري والمضاعفات المرتبطة به. تسمح الدراسة الحالية باكتشاف الأهداف الجزيئية من خلال كشف دورها في المسارات البيولوجية المتغيرة أثناء مرض السكري وعوامل الخطر والمضاعفات المرتبطة به. لقد استخدمنا مفهوم الشبكات الوظيفية المتكاملة من خلال دمج شبكة التعبير المشترك وشبكة التفاعل لاكتشاف المسارات واللوائح المعدلة نسبيًا والمتعلقة بالمرض. يشير تحليلنا إلى أربع شبكات جديدة مهمة يمكن أن تؤدي إلى الإصابة بمرض السكري والاختلالات الأخرى المرتبطة به. (أ) توضح الشبكة الأولى التنظيم الأعلى لـ TGFBRII الذي يسهل الإجهاد التأكسدي ويسبب التعبير عن جينات النسخ المبكر عبر مسار MAPK مما يؤدي إلى مضاعفات القلب والأوعية الدموية والكلى. (ب) توضح الشبكة الثانية التفاعلات الجديدة بين GAPDH والجينات المرشحة للالتهابات والانتشار ، أي SUMO4 و EGFR مما يشير إلى وجود صلة جديدة بين السمنة ومرض السكري. (ج) تصور الشبكة الثالثة تفاعلات فريدة من نوعها PTPN1 مع EGFR و CAV1 والتي يمكن أن تؤدي إلى ضعف وظيفة الأوعية الدموية في حالة اعتلال الكلية السكري. (د) أخيرًا ، من شبكتنا الرابعة ، استنتجنا أن تفاعل بيتا كاتينين مع CDH5 و TGFBR1 من خلال جزيئات Smad يمكن أن يساهم في حدوث خلل وظيفي في البطانة. يمكن اقتراح احتمال ظهور مضاعفات الكلى في حالة T2D. قد يوفر التحقيق التجريبي في هذا الجانب مزيدًا من الملاحظة الحاسمة في تحديد هدف الدواء وفهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية للـ T2D ومضاعفاته.

بيان تضارب المصالح

تضارب المصالح: أعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة.

الأرقام

الشكل 1. نظرة عامة على شبكة متكاملة من ...

الشكل 1. نظرة عامة على الشبكة المتكاملة للتعبير المشترك للجين ومعلومات التفاعل بين البروتين والبروتين في المصفوفة الدقيقة ...

يوضح الشكل 2. TranscriptionFactors_KidneyComplication network التفاعل ...

الشكل 2. TranscriptionFactors_KidneyComplication network توضح تفاعل الجينات الورمية الأولية مع جزيئات SMAD والمستقبلات النووية ...

الشكل 3. تظهر شبكة GAPDH-EGFR_MicrovascularComplication حدوث EGFR ...

الشكل 3. GAPDH-EGFR_MicrovascularComplication network تظهر مقاومة الأنسولين المستحثة بـ EGFR والأوعية الدموية الدقيقة التي يسببها GAPDH ...

الشكل 4. Akt / Pi3k pathway_VascularDysfunction network تعرض التنظيم ...

الشكل 4. Akt / Pi3k pathway_VascularDysfunction network تظهر التنظيم الأعلى لهذا المسار من خلال زيادة التعبير عن EGFR ...

الشكل 5. تُظهر شبكة Wnt_VascularComplication التفاعل ...

الشكل 5. تُظهر شبكة Wnt_VascularComplication التفاعل بين انشطار الميتوكوندريا ، ROS ، إشارات Wnt و VE-cadherin ...

الشكل 6. متوسط ​​معامل التجميع C (k) لـ ...

الشكل 6. متوسط ​​معامل التجميع C (k) لجميع الجينات ذات الروابط k يتبع القياس ...

الشكل 7. توزيع درجة عقدة قانون الطاقة لـ ...

الشكل 7. توزيع درجة عقدة قانون الطاقة لشبكات التوقيع الأربعة.

الشكل 8. تحليل المعاملات الطوبولوجية التي تشير إلى ...

الشكل 8. تحليل معاملات طوبولوجي يشير إلى تنظيم شبكة معياري.


تحويل الوقود و لماذا نشعر بالسمنة من تناول الكثير من الحلويات!

المصدر المباشر للطاقة لمعظم الخلايا هو الجلوكوز.

كيف يتم استخلاص الطاقة من الجلوكوز موصوفة في
تحلل السكر و في
التنفس الخلوي.

إن تعقيد الآلية التي تستخدم بها الخلايا الجلوكوز قد يجعلك تأمل بشدة ألا تكون هناك حاجة إلى نظام مشابه لكل نوع من أنواع الوقود. وبالفعل ليس كذلك.

واحدة من المزايا الرائعة لأكسدة الجلوكوز خطوة بخطوة إلى ثاني أكسيد الكربون2 و ح2O هو أن العديد من المركبات الوسيطة التي تشكلت في العملية تربط استقلاب الجلوكوز بعملية التمثيل الغذائي لجزيئات الطعام الأخرى.

على سبيل المثال ، عند استخدام الدهون كوقود ، يتم تحويل جزء الجلسرين من الجزيء إلى PGAL ويدخل في مسار تحلل السكر في تلك المرحلة. يتم تحويل الأحماض الدهنية إلى جزيئات من أسيتيل CoA وتدخل المسار التنفسي لتتأكسد في الميتوكوندريا.

  • أولاً ، يتم إزالة النيتروجين ، وهي عملية تسمى نزع الأمين.
  • ثم تدخل الأجزاء المتبقية المسار التنفسي في عدة نقاط.
  • يتم تحويل الأحماض الأمينية Gly و Ser و Ala و Cys إلى حمض البيروفيك وتدخل الميتوكوندريا ليتم تنفسها.
  • تعمل acetyl-CoA والعديد من المركبات الوسيطة في دورة حامض الستريك كنقاط دخول لشظايا الأحماض الأمينية الأخرى (الموضحة باللون الأزرق).

وبالتالي تسمح هذه الروابط بالتنفس للدهون والبروتينات الزائدة في النظام الغذائي. ليست هناك حاجة إلى آلية خاصة للتنفس الخلوي من قبل تلك الحيوانات التي تعتمد بشكل كبير على الدهون المبتلعة (مثل العديد من الطيور) أو البروتينات (مثل الحيوانات آكلة اللحوم) لإمدادها بالطاقة.

يتم تحويل الكثير من البروتين الذي نستهلكه في النهاية إلى جلوكوز (عملية تسمى استحداث السكر) لتوفير الوقود للدماغ والأنسجة الأخرى.

على الرغم من أن جميع أطعمتنا قابلة للتحويل إلى حد ما ، إلا أنها ليست كذلك تمامًا. بمعنى آخر ، لا يوجد طعام واحد يمكنه توفير جميع احتياجاتنا الابتنائية.

يمكننا بالفعل تصنيع العديد من الدهون من الجلوكوز ، ولكن لا يمكن تصنيع بعض الدهون غير المشبعة ويجب تناولها مباشرة في نظامنا الغذائي.

كلها غير مشبعة ، أي لها روابط مزدوجة.

على الرغم من أنه يمكننا تصنيع 11 من الأحماض الأمينية من سلائف الكربوهيدرات ، يجب أن نحصل على 9 أحماض أمينية أخرى ("الأحماض الأمينية الأساسية") مباشرة.

تعمل العديد من النقاط التي تربط عملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات بهدم الدهون والبروتينات كصمامات ثنائية الاتجاه (يشار إليها في الشكل بواسطة الأسهم ذات الرأسين). أنها توفر نقاط دخول ليس فقط لتقويض (التنفس الخلوي) من الأحماض الدهنية ، الجلسرين ، والأحماض الأمينية ، ولكن لتركيبها (الابتنائية) كذلك. وبالتالي يمكن أن يؤدي الانهيار التقويضي للنشويات (من خلال acetyl-CoA و PGAL) إلى تخليق الدهون (كما يعرف الكثير منا!).

يمثل الفركتوز مشكلة خاصة

يتم إنتاج الفركتوز عن طريق هضم السكروز ثنائي السكاريد (سكر المائدة الشائع) في السكريات الأحادية الجلوكوز والفركتوز [عرض]. يشترك كل من الجلوكوز والفركتوز في نفس الصيغة التجريبية (C6ح12ا6) ونفس محتوى السعرات الحرارية (686 كيلو كالوري / مول). لكن الجسم يعاملهم بشكل مختلف تمامًا.


مقدمة

الدراسات التطورية الأولية للوظيفة الكيميائية الحيوية ، والتي أدت إلى مجال الكيمياء الحيوية المقارنة ، ركزت بشكل أساسي على الخصائص الخاصة بالأنواع أو الفروق بين الأنواع في الصفات البيوكيميائية ، وأبرزها جوانب وظيفة الإنزيم والتمثيل الغذائي (Somero، 1969 Baldwin، 1970 Hochachka، 1973 Hochachka and Somero ، 2002). تم إجراء هذه التحقيقات بشكل أساسي من قبل علماء الكيمياء الحيوية أو علماء وظائف الأعضاء ، وكانت ثقيلة على الكيمياء الحيوية ولكنها خفيفة على التطور ، وتم نشرها بشكل أساسي في المجلات الفسيولوجية أو البيوكيميائية. بدءًا من أواخر الستينيات إلى السبعينيات ، بدأ علماء الأحياء التطورية في استخدام الإنزيمات المتغيرة وراثيًا (الألوزيمات ، تعدد الأشكال الإنزيمي) ، كنماذج تجريبية ملائمة للتحقيق في القضايا الجينية التطورية العامة ، مثل الأهمية النسبية للانتقاء الطبيعي عكس الانجراف الجيني العشوائي في التطور الميكروي (علم الوراثة السكانية للتطور قصير المدى). كانت الدراسات الأولية ثقيلة على التطور ولكنها كانت خفيفة على الكيمياء الحيوية ، ونُشرت بشكل أساسي في المجلات التطورية أو الجينية (Lewontin ، 1974 Selander ، 1976) (راجعها Mitton ، 1997). ومع ذلك ، فإن المعرفة التفصيلية لوظيفة الإنزيم كان يُنظر إليها بشكل متزايد على أنها ضرورية للتمييز بشكل كافٍ بين الفرضيات التطورية المتنافسة (مثل الجدل بين المحايد والاختيار) ، وأصبحت التوصيفات الوظيفية المتعمقة للأنزيمات موضع تركيز بحثي مهم بشكل تدريجي (Koehn et al. ، 1983 Eanes) ، 1999 وات ودين ، 2000). بدأ هذا التطور توليفًا أكثر عمقًا وتوازنًا بين الكيمياء الحيوية الوظيفية والتطور الجزئي (علم الوراثة السكانية) ، بما في ذلك الأساليب الكيميائية الحيوية المعقدة [على سبيل المثال. التحليلات الحركية للكفاءة التحفيزية (Hall and Koehn ، 1983)] والتحليلات الجينية السكانية القوية لتطور الإنزيم (Eanes، 1999 Storz and Wheat، 2010).

خلال العقد الماضي ، توسعت دراسات التطور الجزئي للوظيفة البيوكيميائية للتركيز أكثر فأكثر على التغيرات التكيفية في مسارات الأيض الوسيط بدلاً من الجوانب الوظيفية للإنزيم الفردي. على سبيل المثال ، كما نوقش بمزيد من التفصيل أدناه ، فقد بحثت دراسات التطور الجزئي لعملية التمثيل الغذائي الوسيط ، من منظور جديد ، قضايا طويلة الأمد في التطور لم يتم دراستها سابقًا من وجهة نظر كيميائية حيوية [الانقسام الهجين والانتواع ، التطور الموازي (Burton ، 2006 Rausher ، 2008 Streisfeld and Rausher ، 2009)]. بالإضافة إلى ذلك ، وسعت المعلومات الأيضية من فهمنا للموضوعات التقليدية للتطور الكيميائي الحيوي مثل التكيف الكيميائي الحيوي مع درجة الحرارة (Eanes ، 1999) ، بالإضافة إلى المساهمة بشكل كبير في الدراسات الأساسية لعلم الوراثة للتطور التكيفي (Rausher ، 2008) ، والتطور من السمات المعقدة ، مثل تاريخ الحياة (Zera and Harshman، 2009 Zera and Harshman، 2011). أخيرًا ، تساهم دراسات التطور الجزئي للأيض الوسيط بشكل كبير في تطوير بيولوجيا الأنظمة التطورية ، والتي تركز على تطور الشبكات بأكملها (مثل تحلل السكر) (Eanes، 1999 Eanes، 2011) ، وتأثير سمات الشبكة على تطور الفرد. البروتينات (مثل "موضع المسار" ومعدل تطور البروتين) (Eanes، 1999 Dykhuizen and Dean، 2009 Rausher et al.، 1999 Rausher et al.، 2008 Wright and Rausher، 2010).

لماذا التركيز المتزايد على تطور مسارات التمثيل الغذائي؟

أدى عدد من العوامل إلى زيادة الاهتمام بتطور الأيض الوسيط ، وأبرزها: (1) زيادة تقدير أهمية التحقيقات التكاملية متعددة المستويات (2) التحول المتزايد إلى التفكير "الشبكي" أو "الأنظمة" و (3) التطورات التكنولوجية الحديثة (omics) التي تسمح بتوصيف مكونات متعددة من المسارات في وقت واحد. منذ الثمانينيات ، كان هناك تركيز متزايد في علم الأحياء التطوري على الدراسات التكاملية التي تربط التحقيقات عبر مستويات متعددة من التسلسل الهرمي البيولوجي ، غالبًا من الجين إلى الكائن الحي بأكمله (Koehn et al. ، 1983 Feder and Watt ، 1992 Eanes ، 1999 Rausher ، 2008 Zera and Harshman، 2009) (الشكل 1). في هذه الدراسات ، غالبًا ما يحتل التمثيل الغذائي الوسيط موقع "بوابة" مركزي ، مما يوفر الرابط بين التباين الجزيئي والتباين في أداء الكائن بأكمله.

يمكن تصنيف نوع واحد من الدراسة التكاملية على أنها "من أسفل إلى أعلى" ، حيث يكون الهدف هو فهم إلى أي مدى يغير الاختلاف الجزيئي أو الكيميائي الحيوي الملاءمة ، وبالتالي يمكن التصرف بناءً عليه عن طريق الانتقاء الطبيعي. من الأمثلة الكلاسيكية على مثل هذا النوع من الدراسة "الرأسية ، التصاعدية" دراسة تعدد أشكال الإنزيم (Koehn et al.، 1983 Watt، 1991 Eanes، 1999 Watt and Dean، 2000 Storz and Wheat، 2010). لقد تم الاعتراف منذ فترة طويلة بأن الاختلافات الكيميائية الحيوية بين الألوزيمات (المتغيرات الجينية لإنزيم معين) ضرورية ولكنها ليست كافية للتأثير على لياقة الكائن الحي. للتأثير على اللياقة ، يجب أن تؤثر الألوزيمات بشكل مختلف على التدفق من خلال المسار الذي تعمل فيه. ومع ذلك ، نظرًا للعلاقة الزائدية غير الخطية في كثير من الأحيان بين نشاط الإنزيم وتدفق المسار (Kacser and Burns ، 1979 Kacser and Burns ، 1981 Dykuizen and Dean ، 1990) ، حيث غالبًا ما ينتج عن التغيير الكبير في نشاط الإنزيم تغيير بسيط في نشاط الإنزيم. التدفق ، مثل هذا التعديل المعتمد على اللوزيم في التدفق ليس مؤكدًا بأي حال من الأحوال. جلب هذا الإدراك التحقيق في allozymes وتدفق المسار إلى المقدمة في الدراسات التطورية لوظيفة allozyme ، واستمرت إعادة التركيز على مسارات التمثيل الغذائي حتى يومنا هذا (Koehn et al.، 1983 Eanes، 1999 Eanes، 2011 Dykhuizen and Dean، 2009).

في حالات أخرى ، كان الدافع لإجراء تحقيق تكاملي هو فهم تطور النمط الظاهري لكائن كامل ، من خلال فهم كيفية تطور المكونات الأساسية للسمة. يمكن تصنيف هذا النوع من الدراسة على أنه "من أعلى إلى أسفل" (Zera and Harshman، 2009 Zera and Harshman، 2011 Dykhuizen and Dean، 2009). على سبيل المثال ، كما نوقش بمزيد من التفصيل أدناه ، لفهم تطور لون الزهرة ، أو سمة تاريخ الحياة مثل التشتت ، قام العمال بالتحقيق في التغييرات في (1) مسارات الأيض الوسيط الذي ينتج أصباغ الأزهار / وقود الطيران الدهني ، (2) الإنزيمات التي تشكل المسارات ، و (3) الجينات التي تشفر الإنزيمات (Rausher، 2008 Zera and Harshman، 2009). علاوة على ذلك ، نظرًا لأن هذه المسارات تتكون من العديد من المكونات المتفاعلة (مثل الإنزيمات) ، فإن هذه الدراسات غالبًا ما تتضمن تحقيقات "أفقية" وكذلك "عمودية" (الشكل 1). مهما كان الدافع ، فإن التحقيق في أسباب ونتائج تعديلات الأيض الوسيط يلعب دورًا مهمًا في هذه الدراسات التكاملية للتكيف.

بالإضافة إلى زيادة أهمية الدراسات التكاملية ، كان هناك إدراك متزايد لأهمية التفكير الشبكي أو النظم في التحليل التطوري (Eanes، 1999 Dykhuizen and Dean، 1990 Dykhuizen and Dean، 2009 Rausher et al.، 2008). تتكون العديد من التعديلات من شبكة من المكونات المتفاعلة ، ولفهم كيفية تطور هذا التكيف ، من الضروري فهم كيفية تطور سمات المكون من خلال تأثيرها على بعض الخصائص النظامية. على العكس من ذلك ، يمكن أن يؤثر الوضع الوظيفي لأحد المكونات في الشبكة بقوة على الديناميكيات التطورية لهذا المكون. تعد مسارات التمثيل الغذائي الوسيط أمثلة رئيسية للشبكات وكان هناك اهتمام متزايد بتطور الخصائص الجهازية للمسارات الأيضية [على سبيل المثال التغيرات التطورية في تدفق حال السكر (Eanes et al.، 2006 Eanes، 2011)] ، بالإضافة إلى تأثير خصائص المسار على تطور مكونات المسار [على سبيل المثال يمكن أن يعتمد معدل تطور الإنزيم على موضع مساره على سبيل المثال نقطة تفرع عكس المصب (Eanes، 1999 Rausher et al.، 1999 Rausher et al.، 2008 Wright and Rausher، 2010)]. هذا التركيز المتزايد على الخصائص الجهازية يجلب أيضًا مسارات الأيض الوسيط إلى طليعة دراسات الكيمياء الحيوية التطورية.

رسم تخطيطي يوضح الدراسات التكاملية الرأسية والأفقية للأسباب الوظيفية للتكيف كما هو مطبق على مكونات اختلاف تاريخ الحياة في جريلوس. تركز الدراسات الرأسية (داخل الخطوط المنقطة) على سلسلة السببية لعامل واحد من خلال عدة مستويات من التسلسل الهرمي البيولوجي. في هذه الحالة ، يؤدي الاختلاف في التسلسل و / أو التعبير عن جين معين إلى تباين مرتبط في نشاط الإنزيم ، والتدفق عبر المسار الذي يعمل فيه الإنزيم ، وأخيرًا التباين في سمة الكائن الحي بأكمله. تركز الدراسات الأفقية (داخل الخطوط الصلبة) على مكونات متعددة للتباين على مستوى معين من التسلسل الهرمي البيولوجي. في هذه الحالة ، يؤدي التباين في الإنزيمات المتعددة إلى تباين في التدفق من خلال المسار الذي تعمل فيه الإنزيمات. تشير النصوص الفرعية إلى جينات مختلفة ، ونواتج الجينات ، وما إلى ذلك. في هذا المثال ، تكون الجوانب المحورية لفيزيولوجيا الجهاز (الكائن الكامل) هي التدفقات عبر مسارات التخليق الحيوي للأحماض الدهنية (FA flux) وأكسدة الأحماض الدهنية (FA ox) تدفق) ، والذي يساهم في تركيز الدهون الثلاثية في الجسم كله.

رسم تخطيطي يوضح الدراسات التكاملية الرأسية والأفقية للأسباب الوظيفية للتكيف كما هو مطبق على مكونات اختلاف تاريخ الحياة في جريلوس. تركز الدراسات الرأسية (داخل الخطوط المنقطة) على سلسلة السببية لعامل واحد من خلال عدة مستويات من التسلسل الهرمي البيولوجي. In this case, variation in the sequence and/or expression of a particular gene results in associated variation in enzyme activity, flux through the pathway in which the enzyme functions, and, finally, variation in a whole-organism trait. Horizontal studies (within the solid lines) focus on multiple components of variation at a particular level of the biological hierarchy. In this case, variation in multiple enzymes gives rise to variation in flux through the pathway in which the enzymes function. Subscripts refer to different genes, products of the genes, etc. In this example, the focal aspects of systemic (whole-organism) physiology are fluxes through the pathways of fatty-acid biosynthesis (FA flux) and fatty-acid oxidation (FA ox flux), which contribute to whole-organism triglyceride concentration.

Finally, the development of various omics approaches (genomics, transcriptomics, proteomics) has produced an unprecedented wealth of information on variation in components of intermediary metabolism. This information, in turn, has provided the opportunity to investigate evolutionary changes in whole pathways, which has made an important contribution to the increased interest in adaptive changes in pathways of metabolism (Frera et al., 1999 Gracey and Cossins, 2003 van Strallen and Roelofs, 2006 Larracuente et al., 2007 Greenburg et al., 2008 Matzkin and Markow, 2009 St-Cyr et al., 2008 Eanes, 2011). In the following section, I focus on five prominent areas of recent research on the microevolution of intermediary metabolism.


Glyceraldehyde

حركية السموم

As glyceraldehyde is a normal metabolic intermediate in humans, it cannot be readily categorized as a ‘toxic’ chemical. Given a large enough exposure or dose, any chemical can result in toxic injury. As with any aldehyde/alcohol, very high air concentrations or accidental ingestion of large amounts would be expected to overwhelm the body's natural defenses and produce an adverse effect (e.g., eye, nose, and lung irritation from airborne dust).

Glyceraldehyde is a chemical that occurs naturally in living organisms, including humans. It is an intermediate in the metabolism of fructose. In the liver, fructose is converted to fructose-1-phosphate by the enzyme fructokinase. Fructose-1-phosphate is then converted to two three-carbon molecules, glyceraldehyde and dihydroxyacetone phosphate, by the enzyme fructose-1-phosphate aldolase. Glyceraldehyde is then converted into glyceraldehyde-3-phosphate by the enzyme glyceraldehyde kinase. Glyceraldehyde-3-phosphate is a high-energy intermediate that provides the body with a way of extracting energy to make ATP, which can then be used to power other metabolic functions, such as muscle contraction. Following exposure and absorption of small to moderate doses, glyceraldehyde would be easily assimilated عبر this normal carbohydrate metabolic capacity.


We have developed highly efficient mass-spectrometry based technology for system-wide identification and quantification of PTM sites and established the bioinformatics platform for understanding the functional relevance of the PTMs in protein structure and cellular physiology.


BCMB 301: INTERMEDIARY METABOLISM

Carbohydrates: Digestion of carbohydrates, glycolysis and fate of pyruvate in different organisms tricarboxylic acid (TCA) cycle pentose phosphate pathway and fate of reduced coenzymes catabolism of monosaccharides other than glucose gluconeogenesis, Calvin Benson cycle, Cori cycle, glyoxylate cycle glycogenesis and glycogenolysis regulation of carbohydrate metabolism Diseases of carbohydrate metabolism.

Lipids: Digestion of triacylglycerols the different lipases (lipoprotein lipase, hormone-sensitive lipase) fate of glycerol beta-oxidation of fatty acids fate of products (acetyl and propionyl CoA, ketone bodies, reduced coenzymes) synthesis of fatty acids triacylglycerol, cholesterol regulation of metabolism.

Amino acids: Digestion of proteins, transamination, deamination and decarboxylation of amino acids and the fate of ammonia (urea cycle) and carbon skeleton metabolism of specific amino acids (aromatic and sulphur-containing amino acids) synthesis of amino acids in-born errors of amino acid metabolism regulation of metabolism.

Energetics: Free energy and biochemical reactions (spontaneity, anabolic and catabolic reactions) metabolic reactions and ATP energy of hydrolysis of ATP, ADP and phosphorylation products ATP production (substrate level and oxidative phosphorylation, photophosphorylation, C3، ج4) coupling reactions uncoupling agents.


أساليب

Strains, medium and cultivation conditions

The strains used in this study are listed in Table 4. All liquid cultivations were carried out using minimal medium as described in Blank and Sauer (2004) [21]. The pre-cultures were always cultured in glucose minimal medium. Other carbon sources or labeled substrates were only added to the experiment culture at 10 g/l each.

For flux analysis experiments, FY4 was freshly plated from a glycerol stock on a YPD (1% yeast extract, 2% peptone and 2% glucose) plate. The liquid pre-culture was inoculated from the YPD plates. For the experiment cultures, minimal medium containing 10 g/l of either glucose, mannose, galactose or pyruvate as sole carbon source was used. FY4 was cultured in 96-deep-well plates (Kuehner AG, Birsfeld, Switzerland) [35] as batch cultures at 30°C and 300 rpm in a shaker with 50 mm shaking amplitude. The culture volume was 1.2 ml. To improve mixing, a single 4 mm diameter glass bead (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) was added per deep-well. The minimal medium for experiment cultures contained a mixture of 20% [U- 13 C] labeled glucose ( 13 C enrichment ≥ 99%, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA) and 80% naturally labeled glucose. The same experiment was performed separately for mannose ( 13 C enrichment ≥ 99%, Omicron Biochemicals, South Bend, USA), galactose ( 13 C enrichment ≥ 98%, Omicron Biochemicals, South Bend, USA) and pyruvate ( 13 C enrichment ≥ 99%, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA). For glucose and galactose, additional flux experiments were performed with 100% [C1- 13 C] labeled glucose ( 13 C enrichment ≥ 99%, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA) or galactose ( 13 C enrichment ≥ 99%, Omicron Biochemicals, South Bend, USA) to better resolve the pentose phosphate pathway.

For the protein expression experiments, GFP-tagged strains and the TAP-tagged reference strain were plated from glycerol stocks on minimal medium plates supplemented with leucine (0.24 g/l), methionine (0.115 g/l) and uracil (0.05 g/l). Liquid pre-cultures of minimal medium containing leucine (0.24 g/l), methionine (0.115 g/l) and uracil (0.05 g/l) were inoculated from the minimal medium plates with 10 g/l glucose. The pre-cultures were cultivated in 96-deep-well plates with the same conditions as explained above. For the experimental culture, additionally histidine (0.025 g/l) was added to the minimal media already containing leucine, methionine and uracil, the carbon source was either 10 g/l glucose, mannose, galactose or pyruvate. The experiment cultures were cultivated in 96-microtiterplates in an incubator with online monitoring of biomass and fluorescence signals (mp2-labs, Aachen, Germany) at 30°C and 800 rpm and a shaking diameter of 3 mm.

For the transcriptional regulation experiment, the transcription factor deletion strains were freshly plated from glycerol stocks on YPD plates containing 300 μg/ml geneticin (G418) (Gibco, Paisley, UK). The liquid pre-cultures were inoculated from the YPD plates. For the liquid cultures yeast minimal medium was used. The pre-cultures were cultivated in 96-deep-well plates with 10 g/l glucose as described above. Medium and cultivation conditions were identical to the flux experiment described above. Only [U- 13 C] experiments were performed.

Determination of growth rate, uptake and secretion rates

Growth rates were determined in eight independent experiments on the naturally labeled carbon sources. To determine the growth rate, the optical density at a wavelength of 600 nm was measured in a spectra-photometer (Molecular Devices, Sunnyvale, USA) for 8 to 12 times over the whole growth curve of FY4. Specific growth rates were determined by linear regression of the logarithmic OD600 values over time from at least 6 data points at maximum rate.

The supernatant samples from mid-exponential growing cells were analyzed with an HPX-87H Aminex, ion-exclusion column (Biorad, Munchen, Germany) as described previously [36, 37] on an HPLC HP1100 system (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). The column temperature was 60°C and as eluant 5 mM H2وبالتالي4 was used with a flow rate of 0.6 ml/min. Pyruvate, succinate and acetate were determined at a wavelength of 210 nm with the UV detector. Glucose, mannose, galactose, glycerol and ethanol were measured with a refractive index detector. The uptake and secretion rates were determined from two points (beginning of exponential growth and mid exponential growth), in eight replicates. The substrate or by-product concentrations during exponential growth were plotted against the corresponding cell dry weights. The cell dry weights were calculated from the OD600 values multiplied with a conversion factor that was previously determined. A linear fit was applied to calculate the slope. The inverse of this slope is the biomass yield in g/mmol. The non inversed slope was further multiplied with the growth rate to get uptake and secretion rates.

Flux analysis

The labeled cultures were inoculated with an OD600 of 0.015 or less. 1 ml of culture was harvested during mid-exponential growth (OD600 0.5 - 1.2). The cells were washed three times with ddH2O and stored at -20°C for GC-MS analysis. The supernatant was stored for determining uptake and secretion rates of glucose, mannose, galactose, pyruvate, ethanol, acetate, glycerol and succinate at -20°C. The experiment was repeated at least two times.

Samples for GC-MS analysis were prepared as described previously [20]. The frozen cell pellet was hydrolyzed with 6 mol/l HCl for 12 h at 105°C. The samples were dried at 95°C under a constant air stream. They were derivatized using 20 μl of the solvent DMF (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) and 20 μl of the derivatization agent N-(tert-butyldimethylsilyl)-ن-methyl-trifluoroacetamide with 1% ثلاثي-butyldimethylchlorosilane (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) for 1 h at 85°C. The mass isotopomer distributions of the protein-bound amino acids were measured with a 6890N GC system (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) combined with a 5973 Inert XL MS system (Agilent Technologies, Santa Clara, USA).

Flux ratios were determined from the mass isotopomer distribution of the protein-bound amino acids with the software FiatFlux [38] using the analytical equations developed by Blank and Sauer (2004) [21]. For the determination of the TCA cycle flux ratio, equation 3 of Blank and Sauer (2004) was applied [21]. For growth on pyruvate, only the split between anaplerosis and the TCA cycle could be resolved. The mass isotopomer distribution was corrected for the amount of unlabeled biomass and naturally occurring stables isotopes [20]. For the calculation of net fluxes, all flux ratios were taken from the [U- 13 C] experiment except for the carbon sources glucose and galactose where the ratio for the split between glycolysis and the pentose phosphate pathway was obtained from a [C1- 13 C] experiment. The gluconeogenic ratio varied dependent on the tuning of the MS instrument therefore a flux ratio range was used for the later calculation.

Net fluxes [39, 23] were calculated with the software Fiat Flux. The stoichiometric equation system was solved with constraints of ratios, uptake, secretion and biomass formation rates. For growth on pyruvate, only the flux through the TCA cycle was calculated from the split ratio between anaplerosis and the respiratory TCA cycle. The anaplerotic fraction of the flux into the TCA cycle equals the flux from 2-oxoglutarate to the biomass. Since Mae1p is not expressed during growth on pyruvate (enzyme abundance measurement) we can calculate the actual flux through the TCA cycle from the flux through the anaplerotic reaction and the flux ratio. For all further calculations we assume a standard deviation of 20% for the respiratory flux through the TCA cycle on pyruvate. In the same way then described for pyruvate, the respiration is quantified in the transcription factor deletion strains.

Protein abundance measurement

The enzyme expression level was calculated from the slope between the biomass signal (light scattering) [40] (excitation at 620 nm) and the GFP signal (excitation at 486 nm, emission at 510 nm) gained from the protein GFP-fusion strains [18] (Table 4). HO-TAP::HIS3 was used as reference to correct for auto fluorescence. Thus, the slope between the GFP and the biomass signal, calculated for the reference was subtracted from the slope calculated for the GFP-fusion strains. The slope, corrected for the autofluorescence, quantifies the enzyme abundances. Significant changes are assigned for p-values of 0.12 or lower which ensures that the error ranges between enzyme expression during growth on glucose compared to each other carbon source do not overlap and thus truly differential expressed enzymes are further investigated.

Prediction of involved transcription factors

Transcription factors are more often associated with a subset of differentially expressed proteins than expected by chance were determined by a statistical analysis adopted from Boyle وآخرون. [28] as outlined in Kümmel وآخرون. [29]: The likelihood is calculated with the hypergeometric distribution that a transcription factor is associated with the differential expressed enzymes between two conditions compared to all enzymes (Figure 4).

F : probability value of a transcription factors

ك أنا: number of interactions between a transcription factor and the differential expressed enzymes

م : total number of interactions between a transcription factor and all investigated enzymes

ن : number of differential expressed enzymes

ن : total number of enzymes

The such calculated significants value F gives the probability that the transcription factor has at least the observed number of interactions with the subset of differential expressed enzymes by chance. When the probability value F is low we conclude that the considered transcription factor is likely to be involved in the regulation of the observed differential expressed enzymes. The transcription factor interactions were from the yeastract database (literature curated once) [27]. The differential expressed enzymes were in this study determined with GFP-fusion strains [18], whereas only p-values of 0.12 or lower were assigned as differentially expressed, which ensures that the error ranges between enzyme expression during growth on glucose compared to each other carbon source do not overlap and thus truly differential expressed enzymes are further investigated. We assigned transcription factors being most likely to regulate the up-regulated enzymes based on the F value (Figure 5). Thus we used, as compromise between the two data sets, the transcription factors with the lowest five F values for the further analysis. The program code is written in MatLab.


شاهد الفيديو: شرح الأيض التمثيل الغذائى والإنزيمات وخصائصها (كانون الثاني 2022).