معلومة

كيف يتم تحديد نوع التلاعب الجيني في CRISPR-Cas9؟

كيف يتم تحديد نوع التلاعب الجيني في CRISPR-Cas9؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد كنت أقرأ قليلاً عن نظام CRISPR-Cas9 لمعالجة الجينات. من ما قرأته ، فإنه يقدم فواصل مزدوجة في نقاط محددة يحددها اختيار sgRNA. ولكن كيف يمكنك الانتقال من الانقطاعات المزدوجة إلى تعديل الجينات بطرق محددة بشكل لا يصدق؟ بقدر ما قرأت ، يمكنك إصلاح الطفرات النقطية أو إدخال جينات كاملة أو تعطيل الجينات باستخدام CRISPR-Cas9. كيف تحدد نوع آلية الإصلاح التي يتم استدعاؤها؟


ولكن كيف يمكنك الانتقال من الانقطاعات المزدوجة إلى تعديل الجينات بطرق محددة بشكل لا يصدق؟

يجب عليك قراءة صفحة ويكيبيديا على نظام CRISPR-Cas. يتم توفير خصوصية الهدف من خلال tracrRNA.

كيف تحدد نوع آلية الإصلاح التي يتم استدعاؤها؟

يمكن إجراء الإصلاح إما عن طريق الانضمام غير المتماثل (NHEJ) أو إعادة التركيب المتماثل (HR). إذا قمت بتوفير قالب الحمض النووي المفرط عن طريق تعداء ، فمن المحتمل أن يزيد من فرصة الموارد البشرية ويمكن استخدام هذا في عملية التكاثر.

في حالة عدم توفير أي قالب ، يمكن إصلاح الحمض النووي بواسطة الموارد البشرية باستخدام الكروماتين الشقيق أو NHEJ. اعتمادًا على مرحلة دورة الخلية ، تُفضل إحدى هذه الآليات على الأخرى. يظهر أن الموارد البشرية هي الأكثر نشاطًا في المرحلة S وتبدأ في الانخفاض في المرحلة G2.

لذلك عندما ترغب في إجراء تعديلات جينية أو تعديلات محددة ، فقم بالمشاركة في نقل CRISPR-Cas مع الحمض النووي المحول (مع الأجنحة المتجانسة لاستهداف تسلسل الحمض النووي) أو الحمض النووي المتماثل مع طفرة (طفرات) نقطية ، ويفضل أن يكون ذلك في الخلايا في المرحلة S. من الممكن مزامنة الخلايا باستخدام نوكودازول أو جزيئات أخرى توقف دورة الخلية.


معالجة قوية للحمض النووي: تحرير محسّن للجينات مع فهم جديد لأداة CRISPR-Cas9

هيكل ثلاثي الأبعاد لمحرر أساسي ، يتألف من بروتين Cas9 (أبيض ورمادي) ، والذي يرتبط بهدف الحمض النووي (اللولب الأزرق والأزرق) المكمل لدليل الحمض النووي الريبي (الأرجواني) ، وبروتينات نزع الأمين (الأحمر والوردي) ، التي تستبدل نوكليوتيد بآخر. الائتمان: صورة جامعة كاليفورنيا في بيركلي بواسطة جافين نوت وأودرون لابينايت

تلتقط Cryo-EM محرر CRISPR-Cas9 الأساسي أثناء العمل.

في غضون ثماني سنوات فقط ، أصبح CRISPR-Cas9 محرر الجينوم المفضل لكل من البحث الأساسي والعلاج الجيني. لكن CRISPR-Cas9 أنتج أيضًا أدوات أخرى يمكن أن تكون قوية لمعالجة الحمض النووي والتي يمكن أن تساعد في إصلاح الطفرات الجينية المسؤولة عن الأمراض الوراثية.

حصل الباحثون في جامعة كاليفورنيا ، بيركلي ، الآن على أول هيكل ثلاثي الأبعاد لواحدة من أكثر هذه الأدوات الواعدة: محررات القواعد ، التي ترتبط بالحمض النووي ، وبدلاً من القطع ، تحل محل نيوكليوتيد آخر بدقة.

تم إنشاؤه لأول مرة منذ أربع سنوات ، يتم استخدام المحررين الأساسيين بالفعل في محاولات لتصحيح طفرات النوكليوتيدات المفردة في الجينوم البشري. يمكن لمحرري القاعدة المتاحين الآن معالجة حوالي 60٪ من جميع الأمراض الجينية المعروفة - يحتمل أن يكون أكثر من 15000 اضطراب وراثي - ناجمة عن طفرة في نوكليوتيد واحد فقط.

الهيكل المفصل ثلاثي الأبعاد ، الوارد في عدد 31 يوليو من المجلة علم، يوفر خارطة طريق لتعديل المحررات الأساسية لجعلها أكثر تنوعًا ويمكن التحكم فيها لاستخدامها في المرضى.

قال جافين نوت ، زميل ما بعد الدكتوراه في جامعة كاليفورنيا في بيركلي: "تمكنا لأول مرة من مراقبة محرر قاعدة أثناء عمله". "الآن يمكننا أن نفهم ليس فقط متى يعمل ومتى لا يعمل ، ولكن أيضًا نصمم الجيل التالي من المحررين الأساسيين لجعلهم أفضل وأكثر ملاءمة من الناحية السريرية."

المحرر الأساسي هو نوع من بروتين الانصهار Cas9 يستخدم Cas9 المعطل جزئيًا - يتم تعطيل مقصات القص الخاصة به بحيث تقطع خيطًا واحدًا فقط من الحمض النووي - وإنزيمًا ، على سبيل المثال ، ينشط الجين أو يسكته ، أو يعدل المناطق المجاورة من الحمض النووي. نظرًا لأن الدراسة الجديدة تشير إلى الهيكل الأول لبروتين الانصهار Cas9 ، فقد تساعد في توجيه اختراع عدد لا يحصى من أدوات تحرير الجينات الأخرى المستندة إلى Cas9.

قال Audrone Lapinaite ، وهو من جامعة كاليفورنيا بيركلي سابق زميل ما بعد الدكتوراه وهو الآن أستاذ مساعد في جامعة ولاية أريزونا في تيمبي. "الهياكل التي حصلنا عليها من هذا المحرر الأساسي المرتبط بهدفه يمنحنا حقًا طريقة للتفكير في بروتينات الانصهار Cas9 ، بشكل عام ، مما يمنحنا أفكارًا عن منطقة Cas9 الأكثر فائدة لدمج البروتينات الأخرى."

Lapinaite و Knott ، اللذان قبلا مؤخرًا منصب زميل باحث في جامعة موناش في أستراليا ، هما أول مؤلفي الورقة البحثية.

قالت كبيرة الباحثين جينيفر دودنا ، أستاذة البيولوجيا الجزيئية والخلوية والكيمياء بجامعة كاليفورنيا في بيركلي ، "تساعدنا هذه البنية على فهم المحررين الأساسيين على مستوى أعمق بكثير". "الآن بعد أن أصبح بإمكاننا رؤية ما نعمل معه ، يمكننا تطوير استراتيجيات مدروسة لتحسين النظام."

تحرير قاعدة واحدة في كل مرة

في عام 2012 ، أظهر الباحثون لأول مرة كيفية إعادة هندسة إنزيم بكتيري ، Cas9 ، وتحويله إلى أداة لتعديل الجينات في جميع أنواع الخلايا ، من البكتيريا إلى الإنسان. من بنات أفكار دودنا وزميلتها الفرنسية ، إيمانويل شاربنتييه ، حولت تقنية CRISPR-Cas9 الأبحاث البيولوجية وجلبت العلاج الجيني إلى العيادة لأول مرة منذ عقود.

الهيكل الثلاثي الأبعاد لمحرر أساسي أثناء قيامه بتحرير امتداد DNA. الائتمان: رسم جامعة كاليفورنيا في بيركلي بواسطة جافين نوت

اختار العلماء بسرعة Cas9 لإنتاج عدد كبير من الأدوات الأخرى. بشكل أساسي عبارة عن مزيج من البروتين والحمض النووي الريبي ، يستهدف Cas9 بدقة امتدادًا معينًا من الحمض النووي ثم يقصه بدقة ، مثل المقص. ومع ذلك ، يمكن كسر وظيفة المقص ، مما يسمح لـ Cas9 باستهداف وربط الحمض النووي دون قطع. بهذه الطريقة ، يمكن لـ Cas9 نقل إنزيمات مختلفة إلى مناطق مستهدفة من الحمض النووي ، مما يسمح للإنزيمات بمعالجة الجينات.

في عام 2016 ، قام ديفيد ليو David Liu من جامعة هارفارد والمعهد الواسع لمعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وجامعة هارفارد بدمج Cas9 مع بروتين بكتيري آخر للسماح بالاستبدال الدقيق للنيوكليوتيدات بآخر: أول محرر أساسي.

بينما كان محرر قاعدة الأدينين المبكر بطيئًا ، فإن الإصدار الأحدث ، المسمى ABE8e ، سريع للغاية: فهو يكمل ما يقرب من 100٪ من التعديلات الأساسية المقصودة في 15 دقيقة. ومع ذلك ، قد يكون ABE8e أكثر عرضة لتحرير قطع غير مقصودة من الحمض النووي في أنبوب اختبار ، مما قد يؤدي إلى إنشاء ما يُعرف بالتأثيرات غير المستهدفة.

تم الحصول على الهيكل الذي تم الكشف عنه حديثًا باستخدام تقنية تصوير عالية الطاقة تسمى الفحص المجهري الإلكتروني (cryoEM). أظهرت فحوصات النشاط سبب كون ABE8e عرضة لإنشاء المزيد من التعديلات غير المستهدفة: إن بروتين نزع الأمين المندمج في Cas9 يكون نشطًا دائمًا. بينما يقفز Cas9 حول النواة ، فإنه يربط ويطلق مئات أو آلاف أجزاء الحمض النووي قبل أن يجد هدفه المقصود. إن نزع الأمين المرفق ، مثل المدفع السائب ، لا ينتظر تطابقًا مثاليًا وغالبًا ما يعدل قاعدة قبل أن يأتي Cas9 للراحة على هدفه النهائي.

يمكن أن تؤدي معرفة كيفية ارتباط مجال المستجيب و Cas9 إلى إعادة تصميم تجعل الإنزيم نشطًا فقط عندما يجد Cas9 هدفه.

"إذا كنت تريد حقًا تصميم بروتين اندماج محدد حقًا ، فعليك إيجاد طريقة لجعل المجال التحفيزي جزءًا من Cas9 ، بحيث يكون الأمر منطقيًا عندما يكون Cas9 على الهدف الصحيح وعندها فقط يتم تنشيطه ، بدلاً من أن يكون قال لابينايت.

تحدد بنية ABE8e أيضًا تغييرين محددين في بروتين deaminase مما يجعله يعمل بشكل أسرع من الإصدار الأول من المحرر الأساسي ABE7.10. تسمح هاتان الطفرات النقطية للبروتين بإمساك الحمض النووي بشكل أكثر إحكامًا واستبدال A بـ G.

"بصفتي عالم أحياء بنيوية ، أريد حقًا أن أنظر إلى جزيء ما وأفكر في طرق لتحسينه بشكل عقلاني. هذا الهيكل والكيمياء الحيوية المصاحبة تمنحنا حقًا تلك القوة "، أضاف نوت. "يمكننا الآن إجراء تنبؤات عقلانية لكيفية تصرف هذا النظام في الخلية ، لأننا نستطيع رؤيته والتنبؤ بكيفية كسره أو التنبؤ بطرق لجعله أفضل."

قال ليو ، الذي حصل على درجة الدكتوراه: "في حين أن محرري القواعد يُستخدمون الآن على نطاق واسع لإدخال تغييرات دقيقة في الكائنات التي تتراوح من البكتيريا إلى النباتات إلى الرئيسيات ، لم يلاحظ أحد سابقًا التركيب الجزيئي ثلاثي الأبعاد لمحرر القاعدة". في عام 1999 من جامعة كاليفورنيا في بيركلي وهو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي. "يكشف هذا المشروع التعاوني عن التركيب الجزيئي الجميل لمحرر أساسي متطور وفعال للغاية - ABE8e - تم اكتشافه أثناء الاشتراك في موقع DNA مستهدف."

المرجع: & # 8220DNA التقاط بواسطة محرر قاعدة الأدينين CRISPR-Cas9 الموجه & # 8221 بواسطة Audrone Lapinaite ، Gavin J. Knott ، Cody M. Palumbo ، Enrique Lin-Shiao ، Michelle F. Richter ، Kevin T. Zhao ، Peter A. بيل ، ديفيد ر. ليو وجنيفر أ.دودنا ، 31 يوليو 2020 ، العلوم.
DOI: 10.1126 / science.abb1390

بالإضافة إلى Lapinaite و Knott و Doudna و Liu ، فإن المؤلفين المشاركين الآخرين هم كودي بالومبو وبيتر بيل من جامعة كاليفورنيا في ديفيس ، وإنريكي لين شياو من جامعة كاليفورنيا في بيركلي وميشيل ريشتر وكيفين جاو من معهد برود ، وهو تعاون بين جامعة هارفارد وجامعة كاليفورنيا. معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا.


الماضي والحاضر والمستقبل للتلاعب الجيني في التوكسوبلازما جوندي

Toxoplasma gondii هو نموذج كلاسيكي لدراسة الكائنات الحية الدقيقة داخل الخلايا حيث تم تطوير العديد من أدوات التلاعب الجيني في T. gondii على مدار العشرين عامًا الماضية. نلخص هنا الاستراتيجيات الرئيسية للمعالجة الوراثية لـ T. gondii بما في ذلك التهجينات الجينية ، والطفرات الإدراجية ، والطفرات الكيميائية ، واستبدال الجينات المتماثلة ، وتقنيات الضربة القاضية المشروطة ، والتكرارات القصيرة المتناوبة المتباعدة المنتظمة (CRISPR) -Cas9 التي تم تطويرها مؤخرًا. نقوم بتقييم مزايا وقيود كل من هذه الأدوات من منظور تاريخي. نناقش أيضًا تطبيقات إضافية لأنظمة CRISPR-Cas9 المعدلة للاستخدام في T. gondii ، مثل تنظيم التعبير الجيني ، ووضع العلامات على مواقع الجينوم المحددة ، والتعديلات اللاجينية. هذه الأساليب لديها القدرة على إحداث ثورة في تحليل بيولوجيا T. gondii ومساعدتنا على تطوير عقاقير ولقاحات جديدة بشكل أفضل.


أصول بكتيرية

مثل العديد من الأدوات المفيدة في التكنولوجيا الحيوية ، تم اكتشاف كريسبر-كاس 9 لأول مرة في البكتيريا. في الطبيعة ، تعمل أشكال CRISPR-Cas9 كنظام مناعي للبكتيريا ضد العاثيات (الفيروسات التي تهاجم البكتيريا). عندما تهاجم العاثية البكتيريا ، فإنها تحقن حمضها النووي في البكتيريا. إذا نجحت العاثية ، يتم دمج هذا الحمض النووي في جينوم البكتيريا. تذكر أن الجينوم ، وهو مجموع الحمض النووي في الكائن الحي ، هو دليل التعليمات لصنع هذا الكائن الحي والحفاظ عليه. عندما يتم إدخال الحمض النووي للعاثيات في جينوم البكتيريا ، يبدأ الحمض النووي الجديد في إعطاء البكتيريا تعليمات جديدة. بدلاً من القيام بكل الأشياء التي تحتاجها الخلية البكتيرية لكي تكون بكتيريا صحية وسعيدة ، تبدأ البكتيريا في بناء عاثيات جديدة. يتم تدمير البكتيريا عندما تنفجر العاثيات الجديدة إلى العالم (نوعًا ما يشبه كيف تولد الكائنات الفضائية الجديدة في فيلم Alien) بعبارة أخرى ، عن طريق إدخال الحمض النووي الخاص بها في بكتيريا ، تخطف العاثيات آلية البكتيريا لتقوم بعملها الخاص. الأهداف الإنجابية.

تستخدم البكتيريا أشكالا مختلفة من كريسبر كاس 9 للدفاع عن نفسها ضد مثل هذه الغزوات الفيروسية. بمجرد حقن DNA البكتيريا في البكتيريا ، تنتج البكتيريا كريسبر-كاس 9. يحدد هذا المقص الجزيئي الحمض النووي الغريب ويقطعه. بمجرد قطعه ، يصبح الحمض النووي للعاثيات غير نشط ولا يمكنه اختطاف البكتيريا بعد الآن.

حسنا هذا رائع. ولكن كيف تعمل تقنية CRISPR-Cas9 بالفعل ، وما هي تقنية CRISPR-Cas9 بالضبط؟
ما هو كريسبر كاس 9؟

لنبدأ بكسر الاختصار. CRISPR لتقف على ج مشتهى ص على سبيل المثال أنا متباعد س هورت ص أليندروميك ص الحلقات.

تشير عبارة "التكرارات القصيرة المتناظرة" إلى أجزاء قصيرة من الدنا البكتيري (حوالي 20-40 زوجًا قاعديًا في الطول) تكون متناظرة. المتماثل هو سلسلة من الحروف تقرأ نفس الشيء في كلا الاتجاهين. على سبيل المثال ، لا تزال عبارة "سيارة سباق" تتهجى سيارة سباق إذا قرأتها للأمام أو للخلف. لذلك ، فإن الجزء المتناوب من الحمض النووي هو الجزء الذي تقرأ نيوكليوتيداته (الأدينين ، الجوانين ، الثايمين ، السيتوزين) نفس الشيء في كلا الاتجاهين.

في كريسبر ، هذه مطابق متواليات متناظرة معاد، ومن هنا جاء اسم "التكرارات القصيرة المتناظرة"

يشير النصف الأول من اختصار CRISPR ، "Clustered Regularly Interspaced" إلى حقيقة أن التكرارات المتناوبة متجمعة في منطقة واحدة من الجينوم البكتيري وأن التكرارات متباعدة على فترات منتظمة. كان العلماء الذين كانوا يدرسون تقنية كريسبر لأول مرة في ثمانينيات وتسعينيات القرن الماضي أكثر انبهارًا بالحمض النووي الذي ملأ الفراغات بين التكرارات المتناغمة. تسمى هذه الأجزاء من الحمض النووي فاصل DNA، كانوا جميعا فريدة من نوعها و هم مطابقة تمامًا للحمض النووي الموجود في العاثيات (الفيروسات التي تهاجم البكتيريا).

اكتشف العلماء أيضًا جينات أخرى مرتبطة بـ CRISPR DNA على جينوم البكتيريا. هؤلاء ج RISPR كما الجينات الاجتماعية ، أو جينات كاس، توفير التعليمات الجينية لبناء بروتينات كاس. بروتينات كاس تتكون عادة من هيليكس الإنزيمات (البروتينات التي تزيل الحمض النووي) و نوكلياز الإنزيمات (البروتينات التي تقطع الحمض النووي). Cas9 هو نوع واحد فقط من بروتين Cas.


شكوى DMCA

إذا كنت تعتقد أن المحتوى المتاح عن طريق موقع الويب (كما هو محدد في شروط الخدمة الخاصة بنا) ينتهك واحدًا أو أكثر من حقوق الطبع والنشر الخاصة بك ، فيرجى إخطارنا من خلال تقديم إشعار كتابي ("إشعار الانتهاك") يحتوي على المعلومات الموضحة أدناه إلى الجهة المعينة الوكيل المذكور أدناه. إذا اتخذ Varsity Tutors إجراءً ردًا على إشعار الانتهاك ، فسيحاول بحسن نية الاتصال بالطرف الذي جعل هذا المحتوى متاحًا عن طريق عنوان البريد الإلكتروني الأحدث ، إن وجد ، الذي قدمه هذا الطرف إلى Varsity Tutor.

قد تتم إعادة توجيه إشعار الانتهاك الخاص بك إلى الطرف الذي جعل المحتوى متاحًا أو إلى جهات خارجية مثل ChillingEffects.org.

يُرجى العلم أنك ستكون مسؤولاً عن التعويضات (بما في ذلك التكاليف وأتعاب المحاماة) إذا لم تُثبت بالدليل المادي أن منتجًا أو نشاطًا ما ينتهك حقوق الطبع والنشر الخاصة بك. وبالتالي ، إذا لم تكن متأكدًا من أن المحتوى الموجود على الموقع الإلكتروني أو المرتبط به ينتهك حقوق الطبع والنشر الخاصة بك ، فيجب أن تفكر أولاً في الاتصال بمحامٍ.

الرجاء اتباع هذه الخطوات لتقديم إشعار:

يجب عليك تضمين ما يلي:

توقيع مادي أو إلكتروني لمالك حقوق الطبع والنشر أو شخص مخول بالتصرف نيابة عنه تعريف بحقوق النشر المزعوم انتهاكها وصفًا لطبيعة وموقع المحتوى الذي تدعي أنه ينتهك حقوق الطبع والنشر الخاصة بك ، بما يكفي التفاصيل للسماح للمدرسين المختلفين بالعثور على هذا المحتوى وتحديده بشكل إيجابي ، على سبيل المثال ، نطلب رابطًا إلى السؤال المحدد (وليس فقط اسم السؤال) الذي يحتوي على المحتوى ووصف أي جزء معين من السؤال - صورة ، أو الرابط والنص وما إلى ذلك - تشير شكواك إلى اسمك وعنوانك ورقم هاتفك وعنوان بريدك الإلكتروني وبيان من جانبك: (أ) تعتقد بحسن نية أن استخدام المحتوى الذي تدعي أنه ينتهك حقوق الطبع والنشر الخاصة بك هو غير مصرح به بموجب القانون ، أو من قبل مالك حقوق الطبع والنشر أو وكيل المالك (ب) أن جميع المعلومات الواردة في إشعار الانتهاك الخاص بك دقيقة ، و (ج) تحت طائلة عقوبة الحنث باليمين ، أنك إما مالك حقوق الطبع والنشر أو شخص مخول بالتصرف نيابة عنه.

أرسل شكواك إلى وكيلنا المعين على:

تشارلز كوهن فارسيتي توتورز ذ م م
101 طريق هانلي ، جناح 300
سانت لويس ، مو 63105


تقنية كريسبر للدراسة الكانديدا صنف

على الرغم من أن هذه التقنيات قد قدمت تطورات كبيرة في دراسة الكانديدا علم الوراثة ، يستمر تطوير أدوات جديدة لتحسين الدراسات الجينومية الوظيفية. كريسبر هي أداة لتحرير الجينات أحدثت ثورة في كفاءة التحليل الجيني في عدد لا يحصى من الكائنات الحية ، بما في ذلك العديد من الأنواع الميكروبية المستعصية في السابق والعديد من الأنواع الكانديدا الأنواع (Shapiro et al.، 2018a Rom & # x000E1n et al.، 2019b Morio et al.، 2020). نظام تحرير الجينوم هذا معقد يتكون من مكونين جزيئيين رئيسيين: إنزيم نوكلياز داخلي مرتبط بـ CRISPR ، و RNA دليل واحد (sgRNA). يوجه sgRNA مجمع CRISPR-Cas إلى موقع دقيق للحمض النووي حيث يؤدي إلى حدوث كسر مزدوج الشريطة (DSB) من خلال نشاط نوكلياز Cas & # x00027s (Dominguez et al. ، 2015). يتكون sgRNA نفسه من مكونين رئيسيين: crRNA ، وهو عبارة عن تسلسل قصير (& # x0201Cspacer & # x0201D) يحدد موقعًا دقيقًا في الجينوم المستهدف (& # x0201Cprotospacer & # x0201D) استنادًا إلى الاقتران الأساسي التكميلي ، و tracrRNA ، الذي يربط بروتين Cas (Mohanraju et al. ، 2016). من أجل أن يستهدف مجمع CRISPR الموقع الجينومي الصحيح ، فإنه يتطلب أن يكون التسلسل المستهدف مجاورًا لعنصر مجاور أولي (PAM) في الجينوم (Russa et al. ، 2015). يسمح هذا التسلسل القصير لمركب CRISPR بالتمييز بين الهدف وتسلسل sgRNA (Russa et al. ، 2015). ل الأبراج العقدية كاس 9 (SpCas9) ، أحد أكثر أنظمة CRISPR استخدامًا ، تسلسل PAM هو NGG (Russa et al. ، 2015). يمكن أن يكون هذا عاملاً مقيدًا عند تصميم sgRNAs ، حيث أن تسلسل PAM ليس وفيرًا بشكل موحد في جميع الكائنات الحية. للتحايل على هذا ، يمكن استخدام بروتينات Cas الأخرى لتحرير CRISPR ، والتي يمتلك كل منها تسلسل PAM فريدًا ، وبالتالي نطاق استهداف مختلف.

تعتمد كفاءة CRISPR & # x00027s كنظام لتحرير الجينوم على الآليات الخلوية الموجودة مسبقًا التي تعمل على إصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs). استراتيجيتان للإصلاح الأكثر شيوعًا هما الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) والربط النهائي غير المتماثل (NHEJ) (Sander and Keith Joung ، 2014). تعمل الإستراتيجية الأولى ، HDR ، على إصلاح DSBs باستخدام الحمض النووي المكمل للموقع التالف كقالب (Sander and Keith Joung ، 2014). يمكن استغلال آلية الإصلاح هذه من خلال تزويد الخلية بشريط DNA خارجي المنشأ يحتوي إما على طفرات محددة أو تسلسلات جديدة للحمض النووي ليتم دمجها في الموقع المستهدف (Sander and Keith Joung ، 2014). تقدم استراتيجية إصلاح DSB الأخرى ، NHEJ ، عمليات الإدخال أو الحذف (indels) في منطقة DSB عند إعادة الانضمام إلى الحمض النووي المشقوق (Maruyama et al. ، 2016).في السنوات القليلة الماضية ، تم تطوير تقنيات كريسبر لتعديل الجينوم السريع في العديد من التقنيات الكانديدا الأنواع ، كما هو موضح أدناه.

تطوير تقنية كريسبر في المبيضات البيض

في حدود الكانديدا الجنس ، تم تطوير CRISPR لأول مرة في الأنواع التي تمت دراستها على نطاق واسع ، C. البيض، قبل أن يتم تطبيقها على الآخرين الكانديدا الكائنات الحية (الشكل 2). أول تطبيق لـ CRISPR بلغة C. البيض كان في عام 2015 بواسطة Vyas et al. الذي قام بتكييف نظام نوكلياز Cas9 و sgRNA من S. cerevisiae وتحسينه للاستخدام في C. البيض (فياس وآخرون ، 2015). نظرًا لاستخدام CTG البديل ، فإن CAS9 nuclease- ترميز الجين ل C. البيض يجب تحسينها لتجنب سوء دمج الأحماض الأمينية السيرين في نوكلياز. حيث C. البيض غير قادر على الحفاظ على البلازميدات المتكاثرة بشكل مستقل ، فقد تم تصميم نظام كريسبر البلازميد للاندماج في C. البيض الجينوم ، ومروج RNA polymerase III الداخلي ، pSNR52، للتعبير عن sgRNA (Vyas et al. ، 2015). تم إنشاء نظامين في البداية ، نظام منفرد وثنائي ، حيث تم استخدام إما واحد أو اثنين من البلازميدات للتعبير عن Cas9 و sgRNA ، على التوالي (الشكل 2). قدم كلا النظامين قالب إصلاح باستخدام HDR لاستهداف الجين عن طريق إدخال طفرة تغيير الإطارات أدت إلى كودون توقف سابق لأوانه (Vyas et al. ، 2015). أظهرت الأنظمة ترددًا للطفرة يتراوح بين 20 & # x0201340٪ و 60 & # x0201380٪ لنظام الثنائي والنظام الفردي ، على التوالي (Vyas et al. ، 2015). شكل هذا أول استخدام لـ CRISPR في C. البيض، ووصف نظامًا يمكنه تحور الجينات في كل من أليلات هذا ثنائي الصبغة ، بالإضافة إلى عدة نسخ من عائلة متعددة الجينات من تحول واحد (Vyas et al. ، 2015). كان هذا الاكتشاف علامة فارقة في C. البيض البحث ، وتوفير أساس للتقدم المستمر في هذا المجال.

الشكل 2. تقنيات كريسبر المستخدمة للدراسة الكانديدا محيط. (أ) C. البيض يتكون النظام المنفرد من بلازميد CRISPR واحد يحتوي على كل من إنزيم Cas9 و sgRNA الذي يتم دمجه بعد ذلك في ENO1 المكان. (ب) C. البيض نظام الثنائي الذي ينقسم فيه نظام كريسبر إلى بلازميدات ويتكامل في موقعين مختلفين (ENO1 و RP10). (ج) يستخدم نظام عابر في C. albicans و C. lusitaniae و C. glabrata و C. Tropis كطريقة تعبير بديلة لتكامل نظام كريسبر. (د) لتجنب التغييرات في نظام التعبير من الأنواع إلى الأنواع ، يمكن تحويل نظام خالٍ من التعبير ، يتم فيه تعقيد Cas9 المنقى و CRISPR RNAs لتشكيل بروتينات نووية ريبية (RNPs) ، إلى الخلية. (هـ) يتم التحكم في تعبير Cas9 تحت مروجات مختلفة اعتمادًا على الأنواع التي يتم تطبيقها عليها.

تم وصف نظام CRISPR في Vyas et al. تضمن التكامل المستقر للبلازميد الذي يشفر مكونات كريسبر مباشرة في جينوم C. البيض. لتجنب المخاوف من أي تأثيرات خارج الهدف يمكن أن تنجم عن نشاط CRISPR المستمر ، تم تطوير نهج عابر للتعبير عن النظام دون تكامل الجينوم (الشكل 2). مين وآخرون أنشأ نظامًا عابرًا عبر عن Cas9 و sgRNA يستهدفان ADE2 مراسل الجينات في C. البيض (فياس وآخرون ، 2015 مين وآخرون ، 2016). تم توفير علامة اختيار مقاومة nourseothricin على قالب إصلاح تم استخدامه لتعطيل بنجاح ADE2 الجين عند إصلاح DSB. أثبت هذا أن تكامل البلازميد والتعبير التأسيسي لـ Cas9 ليس ضروريًا لاستخدام كريسبر في C. البيض، مما يقلل من احتمالية حدوث تعديلات على الحمض النووي خارج الهدف. يوفر النظام العابر أيضًا فرصة لتوسيع التصميم التجريبي من خلال الاستهداف المتسلسل لمواقع متعددة من خلال تحويل أشرطة sgRNA المتعددة إلى خلية واحدة (Min et al. ، 2016).

نظرًا للعدد المحدود من علامات التحديد السائدة المتاحة للاستخدام في C. البيض، إعادة تدوير علامات الاقتران باستخدام أشرطة تحرير CRISPR تسمح بحدوث خطوات تحرير جينية متعددة في نفس السلالة. إحدى الطرق المعتمدة على CRISPR لإعادة تدوير الواسمات هي استئصال العلامة بوساطة كريسبر (CRIME) ، حيث يحدث كسر مزدوج الجديلة داخل العلامة المختارة لتحريك إعادة تركيب سلاسل التكرار المُحاطة مباشرةً ، والاستئصال اللاحق للعلامة المختارة من الجينوم (هوانغ وميتشل ، 2017). كما تم تطوير طرق أخرى مثل C. البيض نظام LEUpOUT ونظام HIS-FLP ، اللذين يمكِّنان من تحرير CRISPR متماثل اللواقح بكفاءة عالية وبدون علامات جنبًا إلى جنب مع إعادة تدوير العلامات وإزالة CRISPR (Nguyen et al. ، 2017). زادت هذه الطرق معًا من قدرات الجيل المتحور من خلال تمكين تحرير الجينوم بدون علامات من خلال تحول واحد.

على الرغم من أن أنظمة CRISPR هذه أثبتت فعاليتها من أجل C. البيض التحرير ، لا تزال هناك فرص لزيادة كفاءتها ، على سبيل المثال من خلال تحسين تعبير sgRNA والمعالجة في الخلية. على سبيل المثال ، وجد اختبار العديد من مروجي sgRNA وخطط معالجة الحمض النووي الريبي بعد النسخ أن الحمض النووي الريبي نسخ تحت سيطرة ADH1 قام المروج بزيادة معدلات الطفرات المستندة إلى CRISPR بمقدار 10 أضعاف (Ng and Dean ، 2017). بالإضافة إلى ذلك ، فإن sgRNA المحاط بـ 5 & # x02032 tRNA جعل sgRNA ناضجًا أكثر استقرارًا ، مما أدى إلى تحسينين مهمين لكفاءة تحرير CRISPR في C. البيض (نج ودين ، 2017).

كريسبر في غير-المبيضات البيض

بعد تجربة نظام التحرير الجيني CRISPR-Cas9 في C. البيض، التنفيذ في أخرى الكانديدا الأنواع كانت سريعة في المتابعة. بينما في بعض الحالات يتم تكييف أنظمة الخميرة التي تم إنشاؤها مسبقًا CRISPR-Cas9 لغيرالمبيضات البيض لم تتطلب الأنواع مزيدًا من التعديلات ، وفي معظم الحالات ، كان استبدال عناصر بنية CRISPR بمنظمين خاصين بالأنواع أمرًا ضروريًا لتحقيق تعديلات جينية فعالة. لتجنب التعديلات الإضافية اللازمة للتعبير عن sgRNAs المشفر بالبلازميد و Cas9 في هذه الأنواع ، تم تصميم CRISPR-Cas9 الخالي من التعبير ، حيث تم تنقية Cas9 و CRISPR RNAs (crRNA و tracrRNA) ، لتكوين البروتينات النووية الريبية (RNPs) خارجيًا. (Grahl et al.، 2017 Morio et al.، 2020). يمكن تحويل هذه RNPs إلى متنوعة الكانديدا الأنواع ، جنبًا إلى جنب مع نموذج إصلاح لإصلاح DSB. مقارنة بالطرق السابقة التي كانت تتطلب فقط استخدام بنية اضطراب الجينات ، أدت إضافة RNPs إلى زيادة كفاءة التحول في جميع العزلات السريرية التي تم اختبارها ، من 10 إلى 70٪ في أحادية العدد C. lusitaniae، 20 إلى 60٪ في C. glabrata، و 50 إلى 70٪ في C. أوريس (جراح وآخرون ، 2017). يمكن استغلال استخدام Cas9 المتاح تجاريًا والحمض النووي الريبي المصمم خصيصًا كنظام خالٍ من التعبير ، وهو مفيد للدراسة الكانديدا الأنواع التي تتوفر فيها أدوات وراثية جزيئية محدودة (البلازميدات ، الواسمات المختارة ، المحفزات الخاصة بالأنواع ، إلخ). على الرغم من ملاءمتها ، فإن هذه الطريقة ليست فعالة من حيث التكلفة مقارنة بالتعبير القائم على البلازميد لآلات CRISPR-Cas9 (Grahl et al. ، 2017 Morio et al. ، 2020). لذلك ، بالتوازي مع هذه الأنظمة الخالية من التعبير ، تم أيضًا تطوير أنظمة CRISPR-Cas9 الخاصة بالأنواع.

كريسبر في C. glabrata

بسبب علاقتها التطورية أوثق بـ S. cerevisiae مقارنة مع أعضاء الكانديدا CTG clade ، تقنية CRISPR-Cas9 تم إنشاؤها بسرعة في مسببات الأمراض الفطرية C. glabrata، باستخدام نظام CRISPR-Cas9 من S. cerevisiae كأساس (DiCarlo et al.، 2013 Enkler et al.، 2016). نظرًا لأن DNA episomal مستقر في C. glabrata، يمكن التعبير عن كل من Cas9 و sgRNA من تكرار البلازميدات بشكل مستقل. تم تصميم متجهين يعبران عن sgRNAs لحساب أي متطلبات تنظيمية خاصة بالأنواع ، أحدهما تحت سيطرة S. cerevisiae مروج RNA polymerase III SNR52 والآخر باستخدام C. glabrata RNAH1 بالتزامن مع تسلسل إنهاء Tyr 2 tRNA ، tTy2. تم وضع Cas9 تحت C. glabrata pCYC1 المروج كبديل ل S. cerevisiae pTEF1 المروج ، والذي وجد أنه يقلل من لياقة مضيفه C. glabrata سلالة (Enkler et al. ، 2016).

نظرًا لأن NHEJ هي الآلية الأكثر شيوعًا لإصلاح أجهزة DSB في C. glabrata، استخدمت أنظمة CRISPR هذه البلازميدات التي تعبر عن Cas9 و sgRNA ، لكنها لم تتضمن قالب إصلاح الحمض النووي (Vyas et al. ، 2018). باستخدام هذا النظام ، مع C. glabrataمحفزات محددة ، لوحظت مستويات فعالة من طفرات indel في C. glabrata. لتحديد ما إذا كان نظام CRISPR-Cas9 يمكنه تحقيق عمليات حذف مستهدفة عبر HDR بتنسيق C. glabrata، تم تحويل بناءين مختلفين لاضطراب الجينات ، يعملان كقوالب لإصلاح الحمض النووي لـ HDR جنبًا إلى جنب مع بلازميدات Cas9 و sgRNA لاستهداف ADE2 locus: تم استخدام قالب إصلاح قصير لإدخال كود التوقف ، وتم تجميع قالب إصلاح طويل لتعطيل C. glabrata HIS3 الجين. كان نظام CRISPR-Cas9 هذا قادرًا على تقليل الطول الموصى به سابقًا لمناطق التماثل من 500 زوج أساسي إلى ما يصل إلى 20 & # x02013200 زوجًا أساسيًا لتحقيق HDR الفعال واضطراب الجينات (Schwarzm & # x000FCller et al.، 2014 Enkler et al.، 2016).

بينما كانت التطبيقات الأولية لتقنية CRISPR-Cas9 في C. glabrata يتطلب استخدام اثنين من بلازميدات التعبير التي تعبر عن sgRNA و Cas9 بشكل منفصل ، تم في النهاية تبسيط النظام في بنية واحدة (Vyas et al. ، 2018). يحتوي نظام Solo CRISPR الموحد هذا على sgRNA ، CAS9، ونموذج إصلاح الكل في بلازميد واحد ، ويسمح لشاشات الطفرات المجمعة وإعادة تدوير النظام بسهولة لتحرير الجينات اللاحقة. الاستهداف ADE2 كدليل على صحة المفهوم ، أنتج نظام CRISPR هذا نجاحًا بنسبة 62 & # x0201371٪ ade2 المسوخ التي تمتلك تسلسل قالب إصلاح HDR ، بينما يمتلك الباقي طفرات indel نتيجة NHEJ (Vyas et al. ، 2018). تختلف الكفاءة بناءً على قيادة المروج CAS9 التعبير باستخدام C. البيض pENO1 أدى إلى ترددات أعلى من NHEJ وأحداث HDR أقل ، مقارنة باستخدام S. cerevisiae pTEF1. في الآونة الأخيرة ، تم إصدار نسخة معدلة من نظام Unified Solo CRISPR-Cas9 بتنسيق C. glabrata تم تطويره لوضعه CAS9 تحت C. glabrata MET3 المروج المحفز هذا البناء فصل تحويل البلازميد إلى خلايا من تحريض DSBs وآليات الإصلاح ، مما يسمح بتحليل أوثق لكل خطوة من هذه الخطوات (Zordan et al.، 2013 Maroc and Fairhead، 2019).

كريسبر في C. lusitaniae

تم أيضًا تنفيذ نظام CRISPR-Cas9 العابر لاضطراب الجينات في مسببات الأمراض الانتهازية الأخرى ، C. lusitaniae، وهو عضو أحادي العدد في الكانديدا كليد CTG (نورتون وآخرون ، 2017). هنا ، C. lusitaniae التأسيسي TDH3 المروج يدفع التعبير CAS9 على أحد البلازميد ، بينما يتم التعبير عن sgRNA بواسطة بلازميد آخر تحت مروج RNA polymerase III ، pSNR52. يتكون قالب الإصلاح لهذا النظام من علامة اختيار الدواء المُحسَّنة من قِبل الكودون SAT1 (Reuss et al. ، 2004) ، محاطًا إما بزوج قصير مكون من 80 قاعدة أو مناطق تماثل طويلة مكونة من 1000 زوج أساسي إلى موضع الجين المستهدف. كدليل على المفهوم ، تم اختبار طريقة حذف الجينات هذه على ADE2 الجين ، حيث ثبت أن مناطق التماثل القصيرة غير كافية لحذف الجين المعني. في غياب CRISPR-Cas9 ، أنتج نموذج الإصلاح بأذرع التماثل الطويلة بعضها ade2 المسوخات وكفاءة الاستهداف منخفضة نسبيًا (Norton et al. ، 2017). أثناء استخدام ملف C. البيض- لم يحسن نظام CRISPR-Cas9 المحسن معدل الحذف في الخلايا ثنائية الصبغيات ، فإن C. lusitaniae- عزز نظام CRISPR-Cas9 المُحسَّن التحويل وكفاءة الاستهداف بمقدار ضعفين و 20 ضعفًا ، على التوالي ، مقارنةً بقالب الإصلاح المستخدم بمفرده. وصلت نسبة الحذف في السلالة الفردية إلى 36٪ عند تحريرها باستخدام CRISPR-Cas9 ، & # x0007E4 أعلى من التحويل باستخدام قالب الإصلاح فقط وليس CRISPR-Cas9 (Norton et al. ، 2017).

الكفاءة المنخفضة نسبيًا لنظام CRISPR-Cas9 في C. lusitaniae يمكن أن يُعزى جزئيًا إلى أحداث NHEJ التي تتنافس مع HDR كآلية لإصلاح DSB المستند إلى CRISPR. لوحظ أن سلالات أحادية الصيغة الصبغية من C. lusitaniae تفتقر إلى الجينات المشاركة في NHEJ (KU70 و LIG4) زيادة ADE2 تردد حذف الجينات من 25 إلى 49٪ في كو 70 & # x02212 / & # x02212 mutant ، وما يصل إلى 81٪ في كو 70 & # x02212 / & # x02212 lig4 & # x02212 / & # x02212 متحولة مزدوجة (Norton et al. ، 2017). باستخدام طفرات NHEJ ، تم الحصول على عمليات حذف الهدف في مواقع أخرى ، مثل UME6بكفاءات تصل إلى 81٪. بينما ال C. lusitaniae تظهر طفرات NHEJ جنبًا إلى جنب مع آلات CRISPR-Cas9 واعدة ، وقد لا يكون هذا النموذج دائمًا نموذجًا قابلاً للتطبيق ، حيث يُعتقد أن إضعاف مسار NHEJ يقلل من ضراوة الفطريات (Goins et al. ، 2006 Morio et al. ، 2020).

كريسبر في جيم الشلل ، C. orthopilosis، و جيم الحؤول

مشابهه ل C. glabrata & # x0201CUnified Solo & # x0201D تصميم متجه ، تم تطوير نظام CRISPR-Cas9 القائم على البلازميد للاستخدام في C. الشلل، عامل مسبب آخر لداء المبيضات (Lombardi et al. ، 2017). حيث C. الشلل هو عضو آخر في الكانديدا CTG clade ، تم استخدام CAS9 المُحسّن من قبل الكودون تحت سيطرة C. الشلل pTEF1 ، جنبًا إلى جنب مع sgRNA ، الذي تم وضعه تحت سيطرة a C. الشلل مروج RNA polymerase II ، pGAPDH، محاطًا بتسلسل ريبوزيم ، رأس المطرقة (HH) ، وفيروس دلتا التهاب الكبد (HDV) ribozymes (Ng and Dean ، 2017). تم تجريب هذا البناء في البداية لإدراج أكواد الإيقاف في ملف ADE2 الجين المراسل ، مع أو بدون قالب إصلاح. في ظل وجود نموذج الإصلاح ، كان 80 & # x02013100٪ من المحولات الناتجة ذات لون وردي ، تم التأكد من أن عينة منها جميعها تمتلك المحولات الصحيحة ADE2 الطفرة ، بينما ، في حالة عدم وجود قالب الإصلاح ، لم يتم الحصول على مستعمرات وردية (Lombardi et al. ، 2017). ال C. الشلل أثبت نظام CRISPR-Cas9 فعاليته في العديد من الخلفيات الجينية ، بما في ذلك العزلات السريرية. ومع ذلك ، اعتمادًا على السلالة ، اختلف عدد المحولات بشكل كبير من 10 إلى 1000 ، كما اختلفت كفاءة تحرير الجينات أيضًا من غير ناجحة إلى 100٪. عندما كان قالب الإصلاح الذي يحتوي على مناطق تماثل زوجية مكونة من 40 قاعدة موجودًا ، فضل إصلاح DSB تقنية HDR ، بينما في غيابه ، كان NHEJ أكثر تكرارًا (Lombardi et al. ، 2017).

بشكل عام ، فإن نظام CRISPR-Cas9 بتنسيق C. الشلل واعد جدا. CAS9 يتم التعبير عن كلاهما وعلامة الاختيار على بلازميد يمكن إعادة تدويره للسماح بالتغييرات الجينية المتسلسلة ، مع تحقيق طفرات مزدوجة بكفاءة تصل إلى 100 ٪ (Lombardi et al. ، 2017). إن استخدام نظام عابر بعلامة اختيار الدواء يلغي الحاجة إلى استخدام السلالات المساعدة ، مما يسمح بالتلاعب بالعزلات السريرية. يزيد استخدام مروج RNA polymerase II بشكل كبير من كفاءة النظام ، ويحتمل أن يكون ذلك من خلال تعزيز مستويات التعبير الأعلى لـ sgRNA مقارنة بمحفز RNA polymerase III. بالإضافة إلى إدخال الطفرات الجينية ، فقد أظهر النظام أيضًا أنه يحث بدقة على حذف الجينات ويمكن استخدامه لتمييز الجينات (Lombardi et al. ، 2017).

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير تكييف لهذا النظام يبسط بروتوكول الاستنساخ لإدراج تسلسل sgRNA بين تسلسلين ريبوزيم في خطوة واحدة ، مما يجعله أكثر عملية للاستنساخ الفعال على العديد من التركيبات (Lombardi et al. ، 2019a). في النظام الأصلي ، كان تغيير تسلسل الدليل يعني أيضًا تغيير تسلسل الريبوزيم HH ، مما يجعل العملية مرهقة إذا تم التعامل مع العديد من الأهداف الجينية. للتحايل على هذه المشكلة ، تم استبدال HH بـ C. الشلل تم تصميم تسلسل الحمض الريبي النووي الريبي (tRNA) الذي لم يكن بحاجة إلى تغيير مع كل دليل جديد لإدخال sgRNAs أيضًا مع بروزات متراكبة تمتلك مواقع قطع إنزيم تقييد SapI المتوافقة مع موقع الإدراج في البناء. أظهر هذا التصميم الجديد كفاءة استهداف جينية مماثلة للنظام الأصلي ، وأظهر أيضًا أنه يمكن استخدام مناطق التماثل القصيرة في قالب الإصلاح لتحقيق HDR (Lombardi et al. ، 2019a). تم تصميم البلازميد الأصلي CRISPR-Cas9 من أجل C. الشلل تم التحقق من صحتها أيضًا كأداة لتمكين تحرير الجينوم في نوعين مرتبطين ارتباطًا وثيقًا: المبيضات العظام (زوبو وآخرون ، 2018) و داء المبيضات (لومباردي وآخرون ، 2019 أ).

كريسبر في C. الاستوائية

تطبيق نفس نظام CRISPR-Cas9 العابر المستخدم في C. الشلل إلى C. الاستوائية، تطلبت تعديلات على البلازميد لتشمل المكونات التي تم التأكد سابقًا من عملها في هذه الأنواع ذات الصلة سريريًا وصناعيًا (Defosse et al. ، 2018). تم تصميم بلازميد جديد يتم وضعه CAS9 تحت Meyerozyma guilliermondii pTEF1 ، SAT1 تحت C. dubliniensis pTEF1، واستخدم تسلسل tRNA-sgRNA-ribozyme ، والذي تم وضعه بين أشبيا جوسيبي pTEF1 و S. cerevisiae CYC1 فاصل. تحيط مواقع التقييد بكل من هذه المكونات ، مما يسمح بإجراء تعديلات على كل جانب من جوانب هذا البناء تقريبًا (Lombardi et al. ، 2019a). تراوحت الكفاءة من 88 & # x02013100٪ عند محاولة إدخال أكواد الإيقاف في ملف ADE2 الجين باستخدام قالب إصلاح HDR مع 60 زوجًا من أذرع التماثل. على غرار تحرير كريسبر بتنسيق C. الشلل، في غياب نموذج الإصلاح ، كان NHEJ عالي الكفاءة في C. الاستوائية (لومباردي وآخرون ، 2019 أ).

تم تطوير كل من نظام CRISPR-Cas9 التكاملي والبديل العابر بشكل متزامن للاستخدام في C. الاستوائية (تشانغ وآخرون ، 2020). تم فحص عدد من المروجين المرشحين للنشاط الفعال من C. الاستوائية الجينوم ، ومنها GAP1 و / أو FBA1 تم اختيار المروجين للتعبير CAS9 و sgRNA. حيث pGAP1 و pFBA1 هي محفزات RNA polymerase II ، متواليات الريبوزيم HH و HDV تحيط بـ sgRNA (Zhang et al. ، 2020). أدى اندماج قوالب إصلاح الحمض النووي إلى بنية CRISPR-Cas9 إلى ظهور طفرات جينية مفردة متماثلة اللواقح بكفاءة تبلغ 83 & # x02013100٪ عند استهداف جينات المراسل ADE2 و URA3، وما يصل إلى 32٪ للطفرات المزدوجة ذات الصلة. مثل أول نظام CRISPR-Cas9 القائم على البلازميد لـ C. الاستوائية، نادرًا ما يؤدي هذا النظام العابر إلى إحداث أحداث NHEJ في وجود قالب إصلاح ولا يتطلب دمج علامة اختيار في الجينوم (Zhang et al. ، 2020). لذلك ، تم تطوير كلا نظامي CRISPR-Cas9 من أجل C. الاستوائية يمكنه تعديل الجينوم بنجاح بكفاءات عالية.

كريسبر في C. أوريس

كظهور الممرض C. أوريس لا يزال مصدر قلق عالمي ، فقد تم استخدام أدوات CRISPR-Cas9 لفهم البيولوجيا الفريدة لهذا الأمر بشكل أفضل الكانديدا الأنواع ، وتحديد العوامل التي تسهم في ارتفاع معدل مقاومة الأدوية المتعددة (Jackson et al. ، 2019). بعد فترة وجيزة من تطوير CRISPR-Cas9 في C. البيض، تم استخدام نظام CRISPR-Cas9 الخالي من التعبير لاستهداف جين الكاتلاز المفترض في C. أوريس ونجحت في زيادة كفاءة حذف الجينات (Grahl et al. ، 2017). كعضو آخر في CTG clade ، ترجمة التكنولوجيا التي تم استخدامها سابقًا على الآخرين الكانديدا الأنواع لا تتطلب الكثير من التحسين الإضافي. ال C. البيض تم استخدام ماكينات CRISPR-Cas9 (Vyas et al. ، 2015) لتحل محل المروج الأصلي لـ HSP90 الجين الأساسي في C. أوريس مع محفز Tet-OFF للسماح بتنظيم تعبيره ، دون الحاجة إلى استخدام المنظمين الخاصين بالأنواع (Kim et al. ، 2019). لم يتم بعد تطبيق أدوات CRISPR-Cas9 على نطاق واسع في هذا العامل الممرض ، فقد يؤدي استخدام المنظمين الخاصين بالأنواع والتعديلات الأخرى إلى زيادة تحسين كفاءة التحرير المستند إلى CRISPR في هذا الممرض الناشئ.

كريسبر في الصناعية الكانديدا صنف

في حين أن أنظمة CRISPR الأكثر تميزًا موجودة في العديد من الأنظمة ذات الصلة من الناحية الطبية الكانديدا الأنواع ، تم تطبيق CRISPR أيضًا على أعضاء آخرين من الجنس. في مجال التكنولوجيا الحيوية ، تم تطبيق أنظمة CRISPR المشابهة للأنظمة الموصوفة أعلاه على أنواع مثل المبيضات aaseri و المبيضات الجلسرين (Zhu et al.، 2019 Ibrahim et al.، 2020). مع استمرار CRISPR-Cas9 في اكتساب مكانة بارزة لإمكاناتها الهندسية الأيضية المبسطة ، فإن عدد العناصر ذات الصلة بالصناعة الكانديدا من المرجح أن تستمر الأنواع ذات أنظمة CRISPR المحددة جيدًا في الزيادة.

توسيع تطبيقات CRISPR في الكانديدا صنف

زودت أنظمة CRISPR الموصوفة هنا الباحثين بمجموعة أدوات لإدخال طفرات قوية في جينوم العديد الكانديدا محيط. بالنظر إلى فائدة ومرونة أنظمة معالجة الجينوم المستندة إلى CRISPR ، يتم حاليًا استكشاف متغيرات جديدة لتقنيات CRISPR لزيادة تعزيز التعديلات الجينية الفعالة في هذه الأنواع (الشكل 3). تم حتى الآن تطبيق التقنيات الجديدة الموضحة في هذا القسم فقط في C. البيض، ولكن بلا شك تطبيقات مهمة أخرى الكانديدا الأنواع سوف تتبع.

الشكل 3. توسيع أنظمة CRISPR في C. البيض. (أ) تستفيد مصفوفة محرك الجينات CRISPR-Cas9 من اثنين من sgRNAs التي تستهدف المنبع والمصب للجين المعني ، مما يؤدي إلى حدوث فاصل مزدوج تقطعت به السبل. يستخدم هذا النظام بعد ذلك إصلاحًا موجهًا للتماثل لاستبدال جين النوع البري المستهدف (WT) بقالب إصلاح يحتوي على sgRNAs. (ب) عندما يتم تزاوج أحادي العدد الذي يحتوي على مجموعة محرك الجينات CRISPR-Cas9 مع WT أحادي الصيغة الصبغية ، يتم أيضًا حذف جين WT في ثنائية الصبغيات الناتجة حيث يستمر محرك الجينات في الانتشار. (ج) يمكن استخدام هذا النظام لإنشاء أحاديات مع محركات جينية تستهدف مواضع مميزة يمكن مزاوجتها لتشكيل عمليات حذف جينات مزدوجة اندماجية. يمكن استخدام هذه الطفرات المزدوجة لتقييم التفاعلات الجينية عند مقارنتها بنظيراتها أحادية الطور أو التحكم غير المستهدف. (د) يمكن دمج nuclease-dead Cas9 (dCas9) مع معدّلات النسخ من أجل معالجة التعبير الجيني. عند استهداف محفز الجينات ، يمكن لنظام CRISPR-dCas9 أن يقلل من التعبير الجيني عن طريق العائق الفراغي لمركب DNA-dCas9 الذي يمنع بوليميريز الحمض النووي الريبي من نسخ الجين بكفاءة. يمكن زيادة هذا القمع بإضافة كوابح مثل Mxi1 أو Nrg1. بدلاً من ذلك ، يمكن زيادة التعبير الجيني عن طريق المنشطات النسخية مثل VP64 التي تقوم بتجنيد بوليميرات الحمض النووي الريبي للجين المستهدف.

في عام 2018 ، شابيرو وآخرون. طورت منصة محرك الجينات المستندة إلى CRISPR-Cas9 لتوليد ملف C. البيض مكتبة حذف الجينات المزدوجة ، مع تطبيقات لتحليل التفاعل الجيني (Shapiro et al. ، 2018b). الاستفادة من C. البيض& # x00027 تميز مؤخرًا بقدرات التزاوج الفردية (Hickman et al. ، 2013) ، يستخدم هذا النظام عنصرًا وراثيًا أنانيًا ، يُطلق عليه محرك الجينات ، والذي يحذف الجين المستهدف في خلية أحادية الصيغة الصبغية ، والتي عند تزاوجها مع نوع بري خلية أحادية الصيغة الصبغية ، ستنتشر إلى المواقع البرية المتبقية من الجين المستهدف في ثنائية الصبغة الناتجة ، مما يؤدي إلى حذف متماثل اللواقح. تدمج التقنية بلازميد في نيوت 5 لتر locus التي تحتوي على CAS9، بالإضافة إلى اثنين من sgRNAs المحاطة بمناطق تماثل للجين المستهدف. يؤدي التعبير عن النظام إلى دمج اثنين من sgRNAs في الجين المستهدف من خلال HDR. عندما تتزاوج هذه السلالة الطافرة مع سلالة من النوع البري من نوع التزاوج المعاكس ، تظل جميع الآليات المطلوبة لتعطيل الأليل من النوع البري الثاني موجودة في الخلية ، مما يؤدي إلى حذف الجين المتماثل. يمكن تطبيق هذه التقنية لتوليد طفرات حذف الجينات المزدوجة متماثلة اللواقح بسرعة عن طريق تزاوج سلالات مع جينات مستهدفة مختلفة (شابيرو وآخرون ، 2018 ب). يمكن بعد ذلك مقارنة هذه الطفرات بسلالات حذف الجين الأبوي المفرد لتحديد التفاعلات الجينية المحتملة بين الجينات المستهدفة ، والبدء في النهاية في فهم الشبكات الجينية المعقدة في هذا الممرض الفطري (شابيرو وآخرون ، 2018 ب هالدر وآخرون ، 2019 ، 2020 ).

أدت التطورات الجديدة في تقنيات كريسبر أيضًا إلى تطوير أنظمة قادرة على معالجة نشاط الجينات دون تغيير التسلسل الجيني بشكل مباشر. تم إنشاء متغيرات CRISPR إما لقمع أو تنشيط التعبير الجيني: تداخل CRISPR (CRISPRi) وتفعيل CRISPR (CRISPRa) ، على التوالي. تستغل أنظمة تنظيم الجينات هذه استخدام إنزيم Cas9 الميت من نوكلياز (dCas9) الذي يتم إنتاجه من خلال طفرات خاصة بالموقع تم إجراؤها في مجالات نوكلياز RuvC و HNH في Cas9 (Qi et al. ، 2013). يحتفظ هذا dCas9 بقدرته على الاسترشاد بـ sgRNA ، لكنه لم يعد قادرًا على إحداث DSB. يمكن بعد ذلك التحكم في التعبير عن النصوص من الجين من خلال تصميم sgRNA لاستهداف محفز الجين المعني ، وإما للحث على القمع أو الإفراط في التعبير من خلال اندماج مثبط النسخ أو جزيئات المنشط إلى dCas9 ، على التوالي.

أول تطبيق لـ CRISPRi في أ الكانديدا تم عرض الأنواع باستخدام تصميمين مختلفين للتطبيقات في C. البيض (Rom & # x000E1n et al.، 2019a Wensing et al.، 2019). قام أحد تصميمات CRISPRi بدمج dCas9 في مجال مثبط النسخ للثدييات ، Mxi1. تمت مقارنة نظام القمع dCas9-Mxi مع dCas9 وحده باستخدام النسخ العكسي الكمي- PCR لقياس مستويات التعبير النسبي للجين المستهدف. ADE2. أظهرت النتائج & # x0007E20 قمع أضعاف في سلالات dCas9-Mxi1 مقارنة بقمع & # x0007E7 أضعاف في سلالات dCas9 (Wensing et al. ، 2019). هذا النهج CRISPRi مفيد أيضًا لدراسة الجينات الأساسية وقد تم تطبيقه للقمع HSP90، كوصيف جزيئي أساسي في C. البيض، وأثبتوا أن المستند إلى CRISPRi HSP90 يجعل القمع السلالات حساسة للعوامل المضادة للفطريات (Wensing et al. ، 2019) ، وفقًا للدراسات السابقة (كوين وليندكويست ، 2005). نفذ تصميم CRISPRi الثاني dCas9 مدمجًا مع Nrg1 ، وهو مثبط مشابه ثبت أنه يقمع الجينات الخيطية (Rom & # x000E1n et al. ، 2019a). للتحقق من صحة قمع الجينات ، تم تصميم sgRNAs لتوجيه مجمعات dCas9 و dCas9-Nrg1 إلى جين الكاتلاز ، CAT1، مما أدى إلى زيادة التعرض للمواد المؤكسدة مقارنة بالسلالة البرية. كان القمع الإجمالي الذي تم تحقيقه بين 40 & # x0201360 ٪ ، بناءً على قراءات قمع GFP (Rom & # x000E1n et al. ، 2019a). لذلك ، تعد CRISPRi تقنية مناسبة وفعالة لاستنفاد الجينات لاستخدامها في C. البيض (Rom & # x000E1n et al.، 2019a Wensing et al.، 2019).

يستخدم CRISPRa نفس عنصر dCas9 مثل CRISPRi ، ولكن بدلاً من ذلك يتم دمجه مع منشطات النسخ. رومان وآخرون. جربت هذه التقنية في C. البيض من خلال دمج مجال التنشيط النسخي لـ Gal4 أو VP64 في ملف C. البيض- محسن dCas9 ، مما أدى إلى زيادة 2 إلى 3 أضعاف في التعبير عن الجين المستهدف (Rom & # x000E1n et al. ، 2019a). سيمكن هذا النظام الباحثين من الإفراط في التعبير عن أي جين مهم في C. البيض الجينوم. تُظهر هذه التقنيات معًا تعدد استخدامات CRISPR & # x00027s بما يتجاوز تحرير الجينات ، مما يوفر بديلاً قابلاً للتطوير وبسيطًا نسبيًا للطرق السابقة المستخدمة في هذا المجال ، والتي من المحتمل أن ترى استخدامًا واسع النطاق في جميع أنحاء العالم. الكانديدا جنس.


يمكن أن يؤدي الفهم الجديد لأداة CRISPR-Cas9 إلى تحسين تحرير الجينات

هيكل ثلاثي الأبعاد لمحرر أساسي ، يتألف من بروتين Cas9 (أبيض ورمادي) ، والذي يرتبط بهدف الحمض النووي (اللولب الأزرق والأزرق) المكمل لدليل الحمض النووي الريبي (الأرجواني) ، وبروتينات نزع الأمين (الأحمر والوردي) ، التي تستبدل نوكليوتيد بآخر. (رسم جامعة كاليفورنيا في بيركلي لجافين نوت وأودرون لابينايت)

في غضون ثماني سنوات فقط ، أصبح CRISPR-Cas9 محرر الجينوم المفضل لكل من البحث الأساسي والعلاج الجيني. لكن CRISPR-Cas9 أنتج أيضًا أدوات أخرى يمكن أن تكون قوية لمعالجة الحمض النووي والتي يمكن أن تساعد في إصلاح الطفرات الجينية المسؤولة عن الأمراض الوراثية.

حصل الباحثون في جامعة كاليفورنيا ، بيركلي ، الآن على أول هيكل ثلاثي الأبعاد لواحدة من أكثر هذه الأدوات الواعدة: محررات القواعد ، التي ترتبط بالحمض النووي ، وبدلاً من القطع ، تحل محل نيوكليوتيد آخر بدقة.

تم إنشاؤه لأول مرة منذ أربع سنوات ، يتم استخدام المحررين الأساسيين بالفعل في محاولات لتصحيح طفرات النوكليوتيدات المفردة في الجينوم البشري. يمكن لمحرري القاعدة المتاحين الآن معالجة حوالي 60٪ من جميع الأمراض الجينية المعروفة - يحتمل أن يكون أكثر من 15000 اضطراب وراثي - ناجمة عن طفرة في نوكليوتيد واحد فقط.

الهيكل المفصل ثلاثي الأبعاد ، الوارد في عدد 31 يوليو من المجلة علم، يوفر خارطة طريق لتعديل المحررات الأساسية لجعلها أكثر تنوعًا ويمكن التحكم فيها لاستخدامها في المرضى.

قال جافين نوت ، زميل ما بعد الدكتوراه في جامعة كاليفورنيا في بيركلي: "تمكنا لأول مرة من مراقبة محرر قاعدة أثناء عمله". "الآن يمكننا أن نفهم ليس فقط متى يعمل ومتى لا يكون & # 8217t ، ولكن أيضًا نصمم الجيل التالي من المحررين الأساسيين لجعلهم أفضل وأكثر ملاءمة من الناحية السريرية."

المحرر الأساسي هو نوع من بروتين الانصهار Cas9 يستخدم Cas9 المعطل جزئيًا - يتم تعطيل مقصات القص الخاصة به بحيث تقطع خيطًا واحدًا فقط من الحمض النووي - وإنزيمًا ، على سبيل المثال ، ينشط الجين أو يسكته ، أو يعدل المناطق المجاورة من الحمض النووي. نظرًا لأن الدراسة الجديدة تشير إلى الهيكل الأول لبروتين الانصهار Cas9 ، فقد تساعد في توجيه اختراع عدد لا يحصى من أدوات تحرير الجينات الأخرى المستندة إلى Cas9.

قال Audrone Lapinaite ، وهو من جامعة كاليفورنيا بيركلي سابق زميل ما بعد الدكتوراه وهو الآن أستاذ مساعد في جامعة ولاية أريزونا في تيمبي. "الهياكل التي حصلنا عليها من هذا المحرر الأساسي المرتبط بهدفه يمنحنا حقًا طريقة للتفكير في بروتينات الانصهار Cas9 ، بشكل عام ، مما يمنحنا أفكارًا عن منطقة Cas9 الأكثر فائدة لدمج البروتينات الأخرى."

Lapinaite و Knott ، اللذان قبلا مؤخرًا منصب زميل باحث في جامعة موناش في أستراليا ، هما أول مؤلفي الورقة البحثية.

& # 8220 هذا الهيكل يساعدنا على فهم المحررين الأساسيين على مستوى أعمق بكثير ، "قالت كبيرة المؤلفين جينيفر دودنا ، أستاذة البيولوجيا الجزيئية والخلوية والكيمياء بجامعة كاليفورنيا في بيركلي ومحقق هوارد هيوز الطبي. "الآن بعد أن أصبح بإمكاننا رؤية ما نعمل معه ، يمكننا تطوير استراتيجيات مدروسة لتحسين النظام. & # 8221

تحرير قاعدة واحدة في كل مرة

في عام 2012 ، أظهر الباحثون لأول مرة كيفية إعادة هندسة إنزيم بكتيري ، Cas9 ، وتحويله إلى أداة لتعديل الجينات في جميع أنواع الخلايا ، من البكتيريا إلى الإنسان. من بنات أفكار دودنا وزميلتها الفرنسية ، إيمانويل شاربنتييه ، حولت تقنية CRISPR-Cas9 الأبحاث البيولوجية وجلبت العلاج الجيني إلى العيادة لأول مرة منذ عقود.

الهيكل الثلاثي الأبعاد لمحرر أساسي أثناء قيامه بتحرير امتداد DNA. (رسم جامعة كاليفورنيا في بيركلي لجافين نوت)

اختار العلماء بسرعة Cas9 لإنتاج عدد كبير من الأدوات الأخرى. بشكل أساسي عبارة عن مزيج من البروتين والحمض النووي الريبي ، يستهدف Cas9 بدقة امتدادًا معينًا من الحمض النووي ثم يقصه بدقة ، مثل المقص. ومع ذلك ، يمكن كسر وظيفة المقص ، مما يسمح لـ Cas9 باستهداف وربط الحمض النووي دون قطع. بهذه الطريقة ، يمكن لـ Cas9 نقل إنزيمات مختلفة إلى مناطق مستهدفة من الحمض النووي ، مما يسمح للإنزيمات بمعالجة الجينات.

في عام 2016 ، قام ديفيد ليو David Liu من جامعة هارفارد والمعهد الواسع لمعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وجامعة هارفارد بدمج Cas9 مع بروتين بكتيري آخر للسماح بالاستبدال الدقيق للنيوكليوتيدات بآخر: أول محرر أساسي.

بينما كان محرر قاعدة الأدينين المبكر بطيئًا ، فإن الإصدار الأحدث ، المسمى ABE8e ، سريع للغاية: فهو يكمل ما يقرب من 100٪ من التعديلات الأساسية المقصودة في 15 دقيقة. ومع ذلك ، قد يكون ABE8e أكثر عرضة لتحرير قطع غير مقصودة من الحمض النووي في أنبوب اختبار ، مما قد يؤدي إلى إنشاء ما يُعرف بالتأثيرات غير المستهدفة.

تم الحصول على الهيكل الذي تم الكشف عنه حديثًا باستخدام تقنية تصوير عالية الطاقة تسمى الفحص المجهري الإلكتروني (cryoEM). أظهرت فحوصات النشاط سبب كون ABE8e عرضة لإنشاء المزيد من التعديلات غير المستهدفة: إن بروتين نزع الأمين المندمج في Cas9 يكون نشطًا دائمًا. بينما يقفز Cas9 حول النواة ، فإنه يربط ويطلق مئات أو آلاف أجزاء الحمض النووي قبل أن يجد هدفه المقصود. إن نزع الأمين المرفق ، مثل المدفع السائب ، لا ينتظر تطابقًا مثاليًا وغالبًا ما يعدل قاعدة قبل أن يأتي Cas9 للراحة على هدفه النهائي.

يمكن أن تؤدي معرفة كيفية ارتباط مجال المستجيب و Cas9 إلى إعادة تصميم تجعل الإنزيم نشطًا فقط عندما يجد Cas9 هدفه.

"إذا كنت تريد حقًا تصميم بروتين اندماج محدد حقًا ، فعليك إيجاد طريقة لجعل المجال التحفيزي جزءًا من Cas9 ، بحيث يكون الأمر منطقيًا عندما يكون Cas9 على الهدف الصحيح وعندها فقط يتم تنشيطه ، بدلاً من أن يكون قال لابينايت.

تحدد بنية ABE8e أيضًا تغييرين محددين في بروتين deaminase مما يجعله يعمل بشكل أسرع من الإصدار الأول من المحرر الأساسي ABE7.10. تسمح هاتان الطفرات النقطية للبروتين بإمساك الحمض النووي بشكل أكثر إحكامًا واستبدال A بـ G.

"بصفتي عالم أحياء بنيوية ، أريد حقًا أن أنظر إلى جزيء ما وأفكر في طرق لتحسينه بشكل عقلاني. هذا الهيكل والكيمياء الحيوية المصاحبة تمنحنا حقًا تلك القوة "، أضاف نوت. "يمكننا الآن إجراء تنبؤات منطقية لكيفية تصرف هذا النظام في الخلية ، لأننا نستطيع رؤيته والتنبؤ بكيفية كسره أو توقع طرق لتحسينه."

قال ليو ، الذي حصل على درجة الدكتوراه: "في حين أن محرري القواعد يُستخدمون الآن على نطاق واسع لإدخال تغييرات دقيقة في الكائنات التي تتراوح من البكتيريا إلى النباتات إلى الرئيسيات ، لم يلاحظ أحد سابقًا التركيب الجزيئي ثلاثي الأبعاد لمحرر القاعدة". في عام 1999 من جامعة كاليفورنيا في بيركلي وهو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي. "يكشف هذا المشروع التعاوني عن التركيب الجزيئي الجميل لمحرر أساسي متطور وفعال للغاية - ABE8e - تم اكتشافه أثناء الاشتراك في موقع DNA مستهدف."

بالإضافة إلى Lapinaite و Knott و Doudna و Liu ، فإن المؤلفين المشاركين الآخرين هم كودي بالومبو وبيتر بيل من جامعة كاليفورنيا في ديفيس ، وإنريكي لين شياو من جامعة كاليفورنيا في بيركلي وميشيل ريشتر وكيفين جاو من معهد برود ، وهو تعاون بين جامعة هارفارد وجامعة كاليفورنيا. معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا.


نعرب عن امتناننا للدعم المالي المقدم من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي ، ومشروع Osteoimmune (منحة 289150) ، ومؤسسة التهاب المفاصل الهولندية (Reumafonds) (RF 11-1-305) ، والجمعيات الخيرية الأمريكية اللبنانية السورية (ALSAC).

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


التعديل الجيني وتحرير الجينوم وكريسبر

تحدد الدول والمنظمات المختلفة التعديل الجيني (GM) بشكل مختلف قليلاً. بشكل عام ، تشير GM إلى إجراء تغييرات على المعلومات الجينية للكائن الحي والتي ما كانت لتحدث بطريقة أخرى عن طريق التزاوج الطبيعي أو التكاثر. قد يتضمن ذلك عادةً استخدام طرق التكنولوجيا الحيوية ، مثل "الحمض النووي المؤتلف" ، أو "استهداف الجينات" ، أو "تحرير الجينوم" لإضافة أو حذف أو تغيير الحمض النووي للكائن. يمكن أن يتضمن التعديل الجيني أيضًا نقل المواد الجينية بين الأنواع.

لطالما استخدمت الكائنات المعدلة وراثيًا (GMOs) ، بما في ذلك الميكروبات والخلايا والنباتات والحيوانات ، في البحث العلمي والطبي كطريقة لفهم العمليات في علم الأحياء وكذلك آليات الأمراض. تمت محاولة استخدام التقنيات الجينية لعلاج الأمراض أو إجراء تعديلات أخرى على البشر ، تسمى "العلاج الجيني" ، منذ التسعينيات. تمت الموافقة على أقل من حفنة من هذه العلاجات حتى الآن من قبل وكالات السلامة والهيئات التنظيمية مثل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية.

لطالما كان استخدام العلاج الجيني لعلاج الأسباب الجينية للأمراض طموحًا للأطباء والعلماء والمرضى. بعض الأمراض ، مثل التليف الكيسي أو فقر الدم المنجلي ، يُفهم جيدًا نسبيًا أنها ناتجة عن متغيرات في جين واحد. في هذه الحالات ، هناك أمل في أنه إذا كان من الممكن تصحيح الجين المسبب للمرض أو استبداله ، فقد يكون من الممكن علاج الأفراد المصابين بالمرض أو على الأقل منع المرض من التدهور. ومع ذلك ، فإن العلاج الجيني أكثر صعوبة للحالات الأكثر تعقيدًا مثل أمراض القلب والسكري أو العديد من أشكال السرطان ، والتي تنتج عن التفاعل بين العديد من الجينات وبين الجينات والبيئة.

من أجل استخدام العلاج الجيني لعلاج الأمراض لدى الفرد بعد الولادة ، قد يلزم تعديل جزء كبير من الخلايا في الأنسجة أو الأعضاء ذات الصلة. يمثل هذا تحديات تقنية لتقديم آلية التعديل و / أو الإصدارات البديلة من الجينات بشكل آمن وفعال إلى الخلايا المستهدفة ، وإجراء التغييرات بنجاح على الخلايا & # 8217 الجينوم بأقل قدر من الأخطاء. إذا تم إجراء التعديل على "السلالة الجرثومية" (بما في ذلك الخلايا الإنجابية وكذلك الخلايا في أجنة المرحلة المبكرة) ، فإن جميع الخلايا في جسم الأجيال اللاحقة سوف ترث هذا التعديل ، بالإضافة إلى أي خطأ أو تغيير غير متوقع يحدث أثناء معالجة.

ما هي تقنية كريسبر؟

منذ أواخر العقد الأول من القرن الحادي والعشرين ، بدأ العلماء في تطوير تقنيات تُعرف باسم "تعديل الجينوم (أو تعديل الجينات)". يسمح تحرير الجينوم للعلماء بإجراء تغييرات على موقع "مستهدف" محدد في الجينوم. يُطلق على إحدى التقنيات التي أثارت أكبر قدر من الإثارة ، نظرًا لفعاليتها وسهولة استخدامها ، "كريسبر". ترمز CRISPR إلى "التكرارات القصيرة المتناوبة العنقودية المتباعدة بانتظام". أساس تقنية كريسبر هو نظام طورته البكتيريا لحماية نفسها من الفيروسات. أخذ العلماء الآن مكونات نظام كريسبر وصنعوه في أداة لتحرير الجينوم.

هناك مكونان لنظام كريسبر: جزيء يُعرف باسم "دليل الحمض النووي الريبي" (جرنا) ، والذي له نفس تسلسل الموقع المستهدف في الجينوم و "نوكلياز" (أي جزيء قطع الحمض النووي) يسمى Cas9 . عندما يتم تسليم كلا المكونين في خلية ، فإن gRNA سيرتبط بالموقع الجينومي المستهدف من خلال الاقتران الأساسي التكميلي (بمعنى أن A سوف ترتبط بـ T و G سوف ترتبط بـ C & # 8217s). في هذه العملية ، تساعد جرنا في جلب Cas9 إلى الموقع المستهدف لعمل قطع في الحلزون المزدوج للحمض النووي. ستعمل آلية إصلاح الحمض النووي الطبيعية للخلية على سد هذه الفجوة ، ولكن نظرًا لأن العملية ليست مثالية ، ستتم إضافة أو حذف بعض قواعد الحمض النووي. هذا يجعل الجين الأصلي & # 8211 ، على سبيل المثال ، متغير جيني مرتبط بالسرطان ، أو متغير مرتبط بعدوى فيروس العوز المناعي البشري - غير وظيفي. بدلاً من ذلك ، يمكن وضع نسخة مختلفة من الجين المستهدف في الخلية جنبًا إلى جنب مع gRNA و Cas9. ستستخدم الخلية بعد ذلك هذا التسلسل البديل "كقالب" لإصلاح الحمض النووي المكسور ، ونسخه ودمجه في الجينوم. قد يؤدي القيام بذلك إلى السماح باستبدال نسخة غير مرغوب فيها من الجين بالنسخة المرغوبة.

لقد أتاحت الاكتشافات العلمية الحديثة إمكانية "تحرير" الجينوم لإصلاح المتغيرات الجينية المسببة للأمراض. في حين أن الوقت لا يزال مبكرًا ، فإن الأمل هو أن تقنيات تعديل الجينات قد توفر يومًا ما علاجًا للأمراض الوراثية مثل فقر الدم المنجلي أو التليف الكيسي أو مرض هنتنغتون ، وتمكين الناس من مكافحة العدوى الفيروسية بشكل أفضل (مثل فيروس نقص المناعة البشرية).

كريسبر وتحرير الخط الجرثومي

استخدم الباحثون تقنية كريسبر في خلايا من الإنسان والنباتات والحيوانات في الواقع ، وقد عملت كريسبر في جميع الأنواع التي تم فحصها حتى الآن. والجدير بالذكر أن تقنية كريسبر قد استخدمت لعكس الأعراض لدى فأر بالغ مصاب باضطراب في الكبد ولتغيير الحمض النووي في الرئيسيات غير البشرية - وهي خطوات مهمة نحو تطوير علاجات جينية جديدة في البشر. في حين أن التغييرات الجينية التي يتم إدخالها على خلية الكبد لن يتم توريثها في جينوم أي من نسل الفرد المستقبلي ، يمكن أن تنتقل تعديلات الحمض النووي التي يتم إدخالها في الخلايا التي ستصبح بويضة أو نطفة ، أو الخلايا في المرحلة المبكرة من الأجنة. للأجيال القادمة. يُعرف هذا باسم تحرير الخط الجرثومي ، وقد أدت آفاقه إلى مناقشة ومناقشة في جميع أنحاء العالم حول ما إذا كان التعديل الجيني للخطوط الجرثومية في البشر مناسبًا ، وما إذا كان يجب على المجتمع المضي قدمًا في مثل هذا البحث والتطبيق المحتمل أم لا.

من ناحية ، يؤكد النقاد على كل من القضايا الفنية والأخلاقية مع إجراء تغييرات على الجينوم التي يمكن أن تنتقل إلى الأبناء. هناك مخاوف من أن أي تأثير غير متوقع في عملية التحرير يمكن أن يصبح موروثًا. يتم طرح أسئلة أخرى - هل لدينا الحق في تغيير جينوم أجيالنا القادمة؟ هل سيؤدي تحرير بعض الأمراض أو الإعاقات إلى وصم الأشخاص الذين يعيشون مع تلك الظروف؟ ومن الذي يقرر ما يعتبر أمراضًا أو إعاقات يجب تعديلها؟ في الوقت نفسه ، يجادل المؤيدون بأن تعديل الخط الجرثومي يمكن أن يقضي على أمراض مثل مرض هنتنغتون ، وهي حالة عصبية منهكة ناجمة عن متغير جيني واحد. كما يجادلون بأن البشر ظلوا منذ فترة طويلة يغيرون حياة وجينات نسلنا دون موافقتهم الصريحة ، من خلال إجراءات مثل الاستشارة الوراثية والتشخيص الجيني قبل الزرع.

في ديسمبر 2015 ، دعت الأكاديميات الوطنية الأمريكية ، والأكاديمية الملكية البريطانية ، والأكاديمية الصينية للعلوم ، العلماء وعلماء الاجتماع وعلماء الأخلاق وأصحاب المصلحة الآخرين إلى قمة دولية حول تحرير الجينات البشرية في واشنطن العاصمة. أكد بيان صدر في نهاية القمة أنه سيكون من "غير المسؤول" في هذا الوقت المضي قدمًا في الاستخدام السريري لتعديل الخط الجرثومي ، لكنه لم يوصِ بحظر هذه التقنية ، وبدلاً من ذلك اقترح استمرار البحث. في فبراير 2017 ، أصدرت لجنة الخبراء التابعة للأكاديميات الوطنية الأمريكية & # 8217 بشأن تحرير الجينوم البشري تقريرها ، وأوصت بضرورة استمرار البحث حول تحرير الجينوم الجسدي واستخدامه للعلاج الطبي بموجب الإطار التنظيمي الحالي ، ولكن يجب أن يكون هناك & # 8220 مساهمة عامة واسعة & # 8221 قبل توسيع التكنولوجيا & # 8217 تطبيق & # 8220 التحسين الجيني. & # 8221 في الوقت نفسه ، يوصي التقرير بإجراء التجارب السريرية لتحرير جينوم السلالة الجرثومية لعلاج & # 8220 الأمراض الخطيرة أو الإعاقات & # 8221 يجب أن تستمر فقط بعد المزيد من البحث ، وفقط عندما يتم استيفاء المعايير الفنية والأخلاقية الصارمة. للمضي قدمًا ، يؤكد التقرير على الحاجة إلى استمرار المشاركة العامة ومناقشة السياسات.

حاليًا ، يعد التعديل الوراثي للخط الجرثومي غير قانوني في العديد من البلدان الأوروبية وفي كندا ، ولا يمكن استخدام التمويل الفيدرالي في الولايات المتحدة لمثل هذا العمل. اعتبارًا من يناير 2017 ، تلقى الباحثون في المملكة المتحدة والسويد والصين الموافقة على إجراء تعديل الجينات في الأجنة البشرية لأغراض البحث فقط (بالإضافة إلى ذلك ، لا تسمح القوانين أو الإرشادات الحالية في هذه البلدان إلا بالبحث على الأجنة حتى 14 يومًا بعد الإخصاب) .

في نوفمبر 2018 ، ظهرت تقارير إخبارية تفيد بأن الأطفال الأوائل الذين تم تحرير جينوماتهم باستخدام تقنية كريسبر خلال المرحلة الجنينية ، توأمان ، وُلِدوا في الصين. في حين أن الادعاءات لم يتم التحقق منها بشكل مستقل أو نشرها في المجلات التي يراجعها الأقران ، فقد أثارت الادعاءات جدلًا كبيرًا. في عام 2019 ، يواصل العلماء وعلماء الأخلاق والمجتمع الأوسع نقاشًا حول المسار إلى الأمام.

كريسبر والبيئة

كما فتحت كريسبر طريقًا لهندسة العالم من حولنا لصالح صحة الإنسان وبيئتنا. تشمل التطبيقات إمكانية تعديل أو حتى القضاء على الحشرات التي تنتشر الأمراض ، مثل البعوض. قد يكون من الممكن أيضًا إعادة تكوين حيوانات منقرضة منذ فترة طويلة ، مثل الماموث الصوفي ، لتجوب الأرض مرة أخرى ، وهو ما يعتقد بعض العلماء أنه قد يساعد في معالجة تغير المناخ. ومع ذلك ، لا يتفق الجميع على أن هذه التطبيقات ستكون بالضرورة "فائدة" ، بينما يشعر الآخرون بالقلق من العواقب غير المقصودة لهذه الإجراءات التي تغير النظام البيئي.

الطريق إلى الأمام

التحرير الجيني لديه إمكانات كبيرة لإفادة صحة الإنسان. في الوقت نفسه ، يثير أسئلة عميقة تتطلب مداولات عامة - ماذا لو قمنا بإجراء تعديلات نأسف لها؟ ماذا لو ثبت أن التغييرات الجينية التي تبدو آمنة لها عواقب غير مقصودة؟ ما هي معايير السلامة حيث يسعى المجتمع الطبي لاستكشاف هذه الأدوات في محاولة لتقليل المعاناة؟ بالإضافة إلى ذلك ، إذا اتفقنا كمجتمع على أن استخدام تحرير الجينوم مقبول ، فكيف نضمن أن جميع الأفراد على دراية بإمكانيات هذه التقنيات ، وأن كل من يريد الوصول إلى هذه التقنيات يمكنه تحمل تكاليفها؟ دعا الباحثون وخبراء الأخلاقيات الحيوية وواضعو السياسات ، بما في ذلك عدد من العلماء الذين ابتكروا كريسبر ، إلى توخي الحذر والحاجة إلى التشاور العام والحوار الذي يشمل أيضًا القادة الدينيين والنشطاء البيئيين ودعاة المرضى والأشخاص ذوي الإعاقة. بينما يسعى المجتمع إلى تحقيق توازن بين الرغبة في تحقيق فوائد تحرير الجينات ومجموعة متنوعة من الاهتمامات الأخرى ، تأمل شركة pgEd أن تلعب دورًا في تسهيل المحادثات الواسعة التي تشرك جميع المجتمعات وتضمن سماع القيم والأصوات المتنوعة.


محتويات

تحرير التسلسلات المتكررة

حدث اكتشاف تكرار الحمض النووي العنقودي بشكل مستقل في ثلاثة أجزاء من العالم. الوصف الأول لما سيطلق عليه لاحقًا CRISPR هو من الباحث في جامعة أوساكا يوشيزومي إيشينو وزملاؤه في عام 1987. لقد استنسخوا عن طريق الخطأ جزءًا من تسلسل CRISPR مع "IAP " (تحويل isozyme من الفوسفاتيز القلوي) من جينوم الإشريكية القولونية [14] [15] كان هذا هو هدفهم. كان تنظيم التكرارات غير عادي. عادة ما يتم ترتيب المتواليات المتكررة بشكل متتالي ، دون تشتيت تسلسلات مختلفة. [15] [11] لم يعرفوا وظيفة التكرارات العنقودية المتقطعة.

في عام 1993 ، باحثون من السل الفطري في هولندا ، مقالتين حول مجموعة من التكرارات المباشرة المتقطعة (DR) في تلك البكتيريا. لقد أدركوا تنوع التسلسلات التي تدخلت في التكرارات المباشرة بين سلالات مختلفة من مرض السل [16] واستخدمت هذه الخاصية لتصميم طريقة كتابة تم تسميتها التنميط، والذي لا يزال قيد الاستخدام حتى اليوم. [17] [18]

درس فرانسيسكو موخيكا من جامعة أليكانتي بإسبانيا التكرارات التي لوحظت في الكائنات البدائية هالوفيراكس و هالواركولا الأنواع ووظائفها. اعتقد مشرف Mojica في ذلك الوقت أن التكرارات العنقودية لها دور في الفصل الصحيح للحمض النووي المكرر في الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية لأن البلازميدات والكروموسومات ذات المصفوفات المتكررة المتماثلة لا يمكن أن تتعايش في هالوفيراكس فولكاني. كما لوحظ نسخ التكرارات المتقطعة لأول مرة ، وكان هذا أول توصيف كامل لـ CRISPR. [18] [19] بحلول عام 2000 ، أجرى موخيكا مسحًا للأدب العلمي وأجرى أحد طلابه بحثًا في الجينوم المنشور ببرنامج ابتكره بنفسه. حددوا التكرارات المتقطعة في 20 نوعًا من الميكروبات على أنها تنتمي إلى نفس العائلة. [20] في عام 2001 ، اقترح Mojica و Ruud Jansen ، اللذان كانا يبحثان عن تكرارات متقطعة إضافية ، الاختصار CRISPR (التكرارات المتقطعة القصيرة المتباعدة بشكل منتظم) لتخفيف الارتباك الناجم عن الاختصارات العديدة المستخدمة لوصف التسلسلات في الأدبيات العلمية. [19] [21] في عام 2002 ، تانغ وآخرون. أظهر دليلًا على أن كريسبر يكرر مناطق من جينوم Archaeoglobus fulgidus تم نسخها إلى جزيئات RNA طويلة تمت معالجتها لاحقًا إلى وحدات RNA صغيرة بطول الوحدة ، بالإضافة إلى بعض الأشكال الأطول من 2 أو 3 أو أكثر من وحدات تكرار المباعدة. [22] [23]

في عام 2005 ، اكتشف الباحث الزبادي رودولف بارانجو ذلك العقدية الحرارية، بعد تحديات الملتهمة التكرارية ، تطور مقاومة الملتهمة المتزايدة ، وترجع هذه المقاومة المعززة إلى دمج تسلسلات فواصل كريسبر الإضافية. [24] ثم طورت شركة دانيسكو للأغذية الدنماركية ، والتي كان يعمل بها بارانجو في ذلك الوقت ، مقاومة لاقمات البكتيريا S. ثيرموفيلوس سلالات لاستخدامها في إنتاج الزبادي. تم شراء Danisco لاحقًا بواسطة DuPont ، التي "تمتلك حوالي 50 في المائة من سوق ثقافة منتجات الألبان العالمية" وأصبحت التكنولوجيا سائدة. [25]

تعديل الأنظمة المرتبطة بـ CRISPR

جاءت إضافة رئيسية لفهم كريسبر مع ملاحظة يانسن أن مجموعة تكرار بدائيات النوى كانت مصحوبة بمجموعة من الجينات المتماثلة التي تشكل الأنظمة المرتبطة بـ CRISPR أو كاس الجينات. أربعة كاس الجينات (كاس 1-4) في البداية. أظهرت بروتينات Cas زخارف هيلياز ونوكلياز ، مما يشير إلى دور في الهيكل الديناميكي لمواقع كريسبر. [26] في هذا المنشور ، تم استخدام الاختصار كريسبر كاسم عالمي لهذا النمط. ومع ذلك ، ظلت وظيفة كريسبر غامضة.

في عام 2005 ، أظهرت ثلاث مجموعات بحثية مستقلة أن بعض فواصل كريسبر مشتقة من دنا الملتهمة والحمض النووي خارج الصبغيات مثل البلازميدات. [30] [31] [32] في الواقع ، الفواصل عبارة عن شظايا من الحمض النووي التي تم جمعها من الفيروسات التي حاولت في السابق مهاجمة الخلية. كان مصدر الفواصل علامة على أن كريسبر /كاس يمكن أن يكون للنظام دور في المناعة التكيفية في البكتيريا. [27] [33] تم رفض جميع الدراسات الثلاث التي اقترحت هذه الفكرة في البداية من قبل المجلات رفيعة المستوى ، لكنها ظهرت في نهاية المطاف في مجلات أخرى. [34]

المنشور الأول [31] الذي يقترح دور CRISPR-Cas في المناعة الميكروبية ، من قبل Mojica والمتعاونين في جامعة Alicante ، تنبأ بدور لنسخة RNA للفواصل في التعرف على الهدف في آلية يمكن أن تكون مماثلة لتدخل RNA نظام تستخدمه الخلايا حقيقية النواة. وسع كونين وزملاؤه فرضية تداخل الحمض النووي الريبي هذه من خلال اقتراح آليات عمل لأنواع فرعية مختلفة من كريسبر-كاس وفقًا للوظيفة المتوقعة لبروتيناتهم. [35]

كشف العمل التجريبي الذي قامت به عدة مجموعات عن الآليات الأساسية لمناعة CRISPR-Cas. في عام 2007 ، نُشر أول دليل تجريبي على أن كريسبر جهاز مناعي تكيفي. [11] [4] منطقة كريسبر في العقدية الحرارية الفواصل المكتسبة من الحمض النووي لجراثيم مسبب للعدوى. تلاعب الباحثون بمقاومة S. ثيرموفيلوس لأنواع مختلفة من الملتهمة عن طريق إضافة وحذف الفواصل التي يتطابق تسلسلها مع تلك الموجودة في العاثيات المختبرة. [36] [37] في عام 2008 ، حدد Brouns و Van der Oost مركبًا من بروتينات Cas (يُسمى Cascade) في بكتريا قولونية قطع سلائف CRISPR RNA داخل التكرارات إلى جزيئات RNA ناضجة تحتوي على مباعد تسمى CRISPR RNA (crRNA) ، والتي ظلت مرتبطة بمركب البروتين. [38] علاوة على ذلك ، فقد وجد أن Cascade و crRNA و Helicase / nuclease (Cas3) كانت مطلوبة لتزويد مضيف بكتيري بمناعة ضد العدوى بفيروس DNA. من خلال تصميم CRISPR المضاد للفيروسات ، أظهروا أن اتجاهين من crRNA (بمعنى / مضاد للدلالة) يوفران مناعة ، مما يشير إلى أن أدلة crRNA كانت تستهدف dsDNA. في ذلك العام أكد كل من Marraffini و Sontheimer أن تسلسل CRISPR لـ S. البشرة تستهدف الحمض النووي وليس RNA لمنع الاقتران. كان هذا الاكتشاف مخالفًا للآلية المقترحة لتداخل الحمض النووي الريبي لمناعة CRISPR-Cas ، على الرغم من وجود نظام CRISPR-Cas الذي يستهدف الحمض النووي الريبي الأجنبي في وقت لاحق. Pyrococcus furiosus. [11] [36] أظهرت دراسة أجريت عام 2010 أن كريسبر-كاس يقطع كلا من خيطي العاثية والبلازميد في S. ثيرموفيلوس. [39]

تحرير Cas9

درس الباحثون نظام CRISPR أبسط من الأبراج العقدية الذي يعتمد على بروتين Cas9. نوكلياز Cas9 عبارة عن نظام مكون من أربعة مكونات يشتمل على جزيئين صغيرين: crRNA و CRISPR RNA المنشط عبر (tracrRNA). [40] [41] أعادت جينيفر دودنا وإيمانويل شاربنتير هندسة نوكلياز Cas9 إلى نظام مكون من مكونين أكثر قابلية للإدارة من خلال دمج جزيئي الحمض النووي الريبي في "الحمض النووي الريبي أحادي الدليل" والذي ، عند دمجه مع Cas9 ، يمكن أن يجد ويقطع هدف الحمض النووي المحدد بواسطة دليل RNA. كانت هذه المساهمة مهمة للغاية لدرجة أنها اعترفت بها جائزة نوبل في الكيمياء في عام 2020. من خلال التلاعب في تسلسل النيوكليوتيدات لتوجيه الحمض النووي الريبي ، يمكن برمجة نظام Cas9 الاصطناعي لاستهداف أي تسلسل DNA للانقسام. [42] مجموعة أخرى من المتعاونين تضم فيرجينيوس تشيكشنيز مع جاسيناس وبارانجو وهورفاث أظهرت أن Cas9 من S. ثيرموفيلوس يمكن أيضًا إعادة برمجة نظام CRISPR لاستهداف موقع من اختيارهم عن طريق تغيير تسلسل crRNA الخاص به. غذت هذه التطورات الجهود لتحرير الجينوم باستخدام نظام CRISPR-Cas9 المعدل. [18]

نشرت المجموعات بقيادة Feng Zhang و George Church أوصافًا لتحرير الجينوم في مزارع الخلايا البشرية باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 للمرة الأولى. [11] [43] [44] ومنذ ذلك الحين تم استخدامه في مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، بما في ذلك خميرة الخباز (خميرة الخميرة) ، [45] [46] [47] الممرض الانتهازي المبيضات البيض، [48] [49] الزرد (دانيو ريريو) ، [50] ذباب الفاكهة (ذبابة الفاكهة سوداء البطن) ، [51] [52] النمل (مملح Harpegnathos [53] و Ooceraea biroi [54]) ، البعوض (الزاعجة المصرية [55]) ، الديدان الخيطية (أنواع معينة انيقة) ، [56] النباتات ، [57] الفئران ، [58] [59] القرود [60] والأجنة البشرية. [61]

تم تعديل كريسبر لعمل عوامل نسخ قابلة للبرمجة تسمح للعلماء باستهداف جينات معينة وتنشيطها أو إسكاتها. [62]

أظهر نظام CRISPR-Cas9 أنه يقوم بإجراء تعديلات جينية فعالة في الزيجوتات ثلاثية النواة البشرية التي تم وصفها لأول مرة في ورقة عام 2015 من قبل العلماء الصينيين P. Liang و Y. Xu. نجح النظام في إجراء انقسام ناجح لطفرة بيتا هيموغلوبين (HBB) في 28 من أصل 54 جنينًا. تم بنجاح إعادة تجميع 4 من 28 جنينًا باستخدام نموذج مانح قدمه العلماء. أظهر العلماء أنه أثناء إعادة تركيب الحمض النووي للخيط المشقوق ، يتنافس التسلسل الداخلي المتماثل HBD مع قالب المتبرع الخارجي. إن إصلاح الحمض النووي في الأجنة البشرية أكثر تعقيدًا وخصوصية من الخلايا الجذعية المشتقة. [63]

Cas12a (Cpf1 سابقًا) تحرير

في عام 2015 ، تم تمييز نوكلياز Cas12a (المعروف سابقًا باسم Cpf1 [64]) في نظام CRISPR / Cpf1 للبكتيريا فرانسيسيلا نوفيسيدا. [65] [66] اسمها الأصلي ، من تعريف عائلة بروتين TIGRFAMs الذي تم بناؤه في عام 2012 ، يعكس انتشار النوع الفرعي CRISPR-Cas في بريفوتيلا و فرانسيسيلا الأنساب. أظهر Cas12a العديد من الاختلافات الرئيسية عن Cas9 بما في ذلك: التسبب في قطع "متداخلة" في الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بدلاً من القطع "الحاد" الذي ينتجه Cas9 ، بالاعتماد على PAM "T rich" (توفير مواقع استهداف بديلة لـ Cas9) ويتطلب فقط CRISPR RNA (crRNA) لاستهداف ناجح. على النقيض من ذلك ، يتطلب Cas9 كلاً من crRNA و crRNA للمعاملات (tracrRNA).

قد تمنح هذه الاختلافات Cas12a بعض المزايا مقارنة بـ Cas9. على سبيل المثال ، تعد crRNAs الصغيرة لـ Cas12a مثالية لتحرير الجينوم متعدد الإرسال ، حيث يمكن حزم عدد أكبر منها في ناقل واحد أكثر مما يمكن لـ sgRNAs الخاصة بـ Cas9. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الأجزاء اللزجة 5 ′ التي خلفها Cas12a لتجميع الحمض النووي الذي يكون أكثر تحديدًا للهدف من استنساخ إنزيم التقييد التقليدي. [67] أخيرًا ، يشق Cas12a أزواجًا قاعدية من الحمض النووي 18-23 في اتجاه مجرى النهر من موقع PAM. هذا يعني أنه لا يوجد اضطراب في تسلسل التعرف بعد الإصلاح ، وبالتالي يتيح Cas12a جولات متعددة من انقسام الحمض النووي. على النقيض من ذلك ، نظرًا لأن Cas9 يقطع 3 أزواج أساسية فقط في الجزء العلوي من موقع PAM ، فإن مسار NHEJ ينتج عنه طفرات indel التي تدمر تسلسل التعرف ، وبالتالي منع المزيد من جولات القطع. من الناحية النظرية ، يجب أن تتسبب الجولات المتكررة من انقسام الحمض النووي في زيادة فرصة حدوث التحرير الجيني المطلوب. [68] من السمات المميزة لـ Cas12a ، مقارنةً بـ Cas9 ، أنه بعد قطع هدفه ، يظل Cas12a مرتبطًا بالهدف ثم يشق جزيئات ssDNA الأخرى دون تمييز.[69] تسمى هذه الخاصية نشاط "الانقسام الجانبي" أو نشاط "الانقسام العابر" وقد تم استغلالها لتطوير تقنيات التشخيص المختلفة. [70] [71]

Cas13 (C2c2 سابقًا) تحرير

في عام 2016 ، كان نوكلياز Cas13a (المعروف سابقًا باسم C2c2) من البكتيريا ليبتوتريشيا شاهي تميزت. Cas13 هو نوكلياز داخلي من الحمض النووي الريبي RNA الموجه ، مما يعني أنه لا يشق الحمض النووي ، ولكن فقط الحمض النووي الريبي أحادي الجديلة. يتم توجيه Cas13 من خلال crRNA الخاص به إلى هدف ssRNA ويربط الهدف ويشقّه. على غرار Cas12a ، يظل Cas13 مرتبطًا بالهدف ثم يشق جزيئات ssRNA الأخرى دون تمييز. [72] تم استغلال خاصية الانقسام الجانبي هذه لتطوير تقنيات التشخيص المختلفة. [73] [74] [75]

يكرر والفواصل تحرير

تتكون مصفوفة كريسبر من تسلسل قائد غني بالآلية متبوعًا بتكرارات قصيرة مفصولة بفواصل فريدة. [76] عادةً ما يتراوح حجم تكرار CRISPR من 28 إلى 37 زوجًا أساسيًا (bps) ، على الرغم من أنه يمكن أن يكون هناك أقل من 23 زوجًا أساسًا وما يصل إلى 55 زوجًا أساسًا. [77] يُظهر البعض تناظر ثنائي ، مما يعني تكوين بنية ثانوية مثل حلقة جذعية ("دبوس الشعر") في الحمض النووي الريبي ، بينما تم تصميم البعض الآخر ليكون غير منظم. يتراوح حجم الفواصل في مصفوفات CRISPR المختلفة عادةً من 32 إلى 38 نقطة أساس (النطاق من 21 إلى 72 نقطة أساس). [77] يمكن أن تظهر الفواصل الجديدة بسرعة كجزء من الاستجابة المناعية لعدوى العاثيات. [78] عادة ما يكون هناك أقل من 50 وحدة من تسلسل المباعد المتكرر في مصفوفة كريسبر. [77]

تعديل هياكل CRISPR RNA

تعديل جينات Cas والأنواع الفرعية لـ CRISPR

مجموعات صغيرة من كاس غالبًا ما توجد الجينات بجوار مصفوفات المباعد المتكررة CRISPR. مجتمعة 93 كاس يتم تجميع الجينات في 35 عائلة بناءً على تشابه تسلسل البروتينات المشفرة. 11 من 35 عائلة تشكل كاس الأساسية ، والتي تشمل عائلات البروتين Cas1 من خلال Cas9. يحتوي موضع CRISPR-Cas الكامل على جين واحد على الأقل ينتمي إلى كاس جوهر. [79]

تنقسم أنظمة CRISPR-Cas إلى فئتين. تستخدم أنظمة الفئة 1 مركبًا من عدة بروتينات كاس لتقليل الأحماض النووية الأجنبية. تستخدم أنظمة الفئة 2 بروتين Cas كبير واحد لنفس الغرض. تنقسم الفئة 1 إلى أنواع I و III و IV وتنقسم الفئة 2 إلى أنواع II و V و VI. [80] تنقسم أنواع الأنظمة الستة إلى 19 نوعًا فرعيًا. [81] يتميز كل نوع ومعظم الأنواع الفرعية بـ "جين التوقيع" الموجود بشكل حصري تقريبًا في هذه الفئة. يعتمد التصنيف أيضًا على تكملة كاس الجينات الموجودة. تحتوي معظم أنظمة CRISPR-Cas على بروتين Cas1. تتوافق سلالة بروتينات Cas1 بشكل عام مع نظام التصنيف. [79] تحتوي العديد من الكائنات الحية على العديد من أنظمة CRISPR-Cas مما يشير إلى أنها متوافقة وقد تشترك في المكونات. [82] [83] يشير التوزيع المتقطع للأنواع الفرعية لـ CRISPR / Cas إلى أن نظام CRISPR / Cas يخضع لنقل الجينات الأفقي أثناء التطور الميكروبي.

مناعة CRISPR-Cas هي عملية طبيعية للبكتيريا والعتائق. [98] يمنع كريسبر-كاس عدوى العاثيات ، الاقتران والتحول الطبيعي عن طريق تحطيم الأحماض النووية الأجنبية التي تدخل الخلية. [36]

تحرير الحصول على فاصل

عندما يتم غزو ميكروب من قبل العاثية ، فإن المرحلة الأولى من الاستجابة المناعية هي التقاط الحمض النووي للعاثية وإدخاله في موضع كريسبر على شكل فاصل. تم العثور على Cas1 و Cas2 في كلا النوعين من أنظمة المناعة CRISPR-Cas ، مما يشير إلى أنهما متورطان في اكتساب المباعد. أكدت دراسات الطفرات هذه الفرضية ، حيث أظهرت أن إزالة كاس 1 أو كاس 2 أوقف اكتساب المباعد ، دون التأثير على استجابة كريسبر المناعية. [99] [100] [101] [102] [103]

تم تمييز العديد من بروتينات Cas1 وحل بنياتها. [104] [105] [106] تحتوي بروتينات Cas1 على متواليات مختلفة من الأحماض الأمينية. ومع ذلك ، فإن هياكلها البلورية متشابهة وجميع بروتينات Cas1 المنقاة عبارة عن نوكليازات / عبارات متكاملة تعتمد على المعادن وترتبط بالحمض النووي بطريقة مستقلة عن التسلسل. [82] تم توصيف بروتينات Cas2 التمثيلية وتمتلك إما (خيط مفرد) ssRNA- [107] أو (خيط مزدوج) dsDNA- [108] [109] نشاط نووي نوكلياز داخلي محدد.

في نظام I-E من بكتريا قولونية يشكل Cas1 و Cas2 معقدًا حيث يقوم Cas2 dimer بجسر اثنين من ثنائيات Cas1. [110] في هذا المركب ، يؤدي Cas2 دور سقالة غير إنزيمي ، [110] ربط شظايا مزدوجة الجديلة من الحمض النووي الغازي ، بينما يربط Cas1 الأجنحة المفردة من الحمض النووي ويحفز اندماجها في مصفوفات CRISPR. [111] [112] [113] عادة ما يتم إضافة فواصل جديدة في بداية كريسبر بجانب التسلسل الرئيسي لإنشاء سجل كرونولوجي للعدوى الفيروسية. [114] في بكتريا قولونية إن بروتين شبيه بالهيستون يسمى عامل مضيف التكامل (IHF) ، والذي يرتبط بتسلسل القائد ، هو المسؤول عن دقة هذا التكامل. [115] يعزز IHF أيضًا كفاءة التكامل في نظام I-F من بكتوبكتيريوم atrosepticum. [116] ولكن في أنظمة أخرى قد تكون هناك حاجة إلى عوامل مضيفة مختلفة [117]

تحرير الزخارف المجاورة Protospacer

كشف تحليل المعلومات الحيوية لمناطق جينومات الملتهمة التي تم استئصالها كفواصل (تسمى الفواصل الأولية) أنه لم يتم اختيارها عشوائياً ولكن بدلاً من ذلك تم العثور عليها بالقرب من تسلسل الحمض النووي القصير (3-5 بي بي) الذي يطلق عليه الزخارف المجاورة الأولية (PAM). أظهر تحليل أنظمة CRISPR-Cas أن PAMs مهمة للنوع الأول والنوع الثاني ، ولكن ليس لأنظمة النوع الثالث أثناء الاستحواذ. [32] [118] [119] [120] [121] [122] في أنظمة النوع الأول والنوع الثاني ، يتم استئصال الفواصل الأولية في المواضع المجاورة لتسلسل PAM ، مع قطع الطرف الآخر من المباعد باستخدام آلية المسطرة ، وبالتالي الحفاظ على انتظام حجم المباعد في مصفوفة كريسبر. [123] [124] يختلف الحفاظ على تسلسل PAM بين أنظمة CRISPR-Cas ويبدو أنه مرتبط تطوريًا بـ Cas1 وتسلسل القائد. [122] [125]

تتم إضافة فواصل جديدة إلى مصفوفة كريسبر بطريقة اتجاهية ، [30] تحدث بشكل تفضيلي ، [78] [118] [119] [126] [127] ولكن ليس حصريًا ، بجوار [121] [124] تسلسل القائد. تحليل نوع نظام I-E من بكتريا قولونية أظهر أن التكرار المباشر الأول المجاور للتسلسل الرئيسي ، تم نسخه ، مع إدخال الفاصل المكتسب حديثًا بين التكرارات المباشرة الأولى والثانية. [102] [123]

يبدو أن تسلسل PAM مهم أثناء إدخال المباعد في أنظمة النوع I-E. يحتوي هذا التسلسل على نيوكليوتيد نهائي محفوظ بقوة (nt) بجوار أول nt من protospacer. يصبح هذا nt القاعدة النهائية في أول تكرار مباشر. [103] [128] [129] يشير هذا إلى أن آلية الحصول على المباعد تولد أفروقة مفردة الجديلة في الموضع من الثاني إلى الأخير للتكرار المباشر وفي PAM أثناء إدخال المباعد. ومع ذلك ، لا يبدو أن جميع أنظمة CRISPR-Cas تشترك في هذه الآلية لأن PAMs في الكائنات الحية الأخرى لا تظهر نفس مستوى الحفظ في الموضع النهائي. [125] من المحتمل أنه في تلك الأنظمة ، يتم إنشاء نهاية حادة في نهاية التكرار المباشر والفاقم الأولي أثناء الاستحواذ.

متغيرات الإدراج تحرير

تحليل Sulfolobus solfataricus كشفت CRISPRs عن مزيد من التعقيدات للنموذج الكنسي لإدخال المباعد ، حيث قام أحد مواضع CRISPR الستة بإدخال فواصل جديدة بشكل عشوائي عبر مصفوفة CRISPR ، بدلاً من إدخال أقرب تسلسل للقائد. [124]

تحتوي كريسبر المتعددة على العديد من الفواصل لنفس العاثية. تم اكتشاف الآلية التي تسبب هذه الظاهرة في نظام النوع I-E بكتريا قولونية. تم الكشف عن تحسين كبير في الحصول على المباعد حيث تستهدف الفواصل بالفعل الملتهمة ، وحتى عدم التطابق مع الفاصل الأولي. يتطلب هذا "التمهيدي" أن تتفاعل بروتينات Cas المشاركة في كل من الاكتساب والتداخل مع بعضها البعض. توجد دائمًا الفواصل التي تم الحصول عليها حديثًا والتي تنتج عن آلية التحضير على نفس الشريط مثل مباعد التمهيدي. [103] [128] [129] أدت هذه الملاحظة إلى فرضية أن آلية الاكتساب تنزلق على طول الحمض النووي الغريب بعد التحضير للعثور على بروتوسفاسر جديد. [129]

تحرير التكوين الحيوي

يجب إنشاء CRISPR-RNA (crRNA) ، الذي يوجه لاحقًا نوكلياز Cas إلى الهدف أثناء خطوة التداخل ، من تسلسل CRISPR. يتم نسخ crRNA في البداية كجزء من نسخة طويلة واحدة تشمل الكثير من مصفوفة CRISPR. [28] يتم بعد ذلك شق هذه النسخة بواسطة بروتينات كاس لتشكيل crRNAs. تختلف آلية إنتاج crRNAs بين أنظمة CRISPR / Cas. في أنظمة النوع I-E والنوع I-F ، يتعرف البروتينان Cas6e و Cas6f على التوالي على الحلقات الجذعية [130] [131] [132] التي تم إنشاؤها عن طريق اقتران التكرارات المتطابقة التي تحيط بالـ crRNA. [133] تشق بروتينات Cas هذه النسخة الأطول عند حافة المنطقة المقترنة ، تاركة كرنا منفردًا مع بقايا صغيرة من منطقة التكرار المزدوجة.

تستخدم أنظمة النوع الثالث أيضًا Cas6 ، ولكن تكرارها لا ينتج حلقات جذعية. يحدث الانقسام بدلاً من ذلك عن طريق التفاف النص الأطول حول Cas6 للسماح بالانقسام فقط في بداية تسلسل التكرار. [134] [135] [136]

تفتقر أنظمة النوع الثاني إلى الجين Cas6 وبدلاً من ذلك تستخدم RNaseIII للانقسام. تقوم أنظمة النوع الثاني الوظيفية بتشفير الحمض النووي الريبي (RNA) الصغير الإضافي الذي يكمل تسلسل التكرار ، والمعروف باسم crRNA المنشط عبر (tracrRNA). [40] ينتج عن نسخ tracrRNA ونسخة كريسبر الأولية الاقتران الأساسي وتكوين الرنا المزدوج الجديلة في تسلسل التكرار ، والذي يتم استهدافه لاحقًا بواسطة RNaseIII لإنتاج crRNAs. على عكس النظامين الآخرين ، لا يحتوي crRNA على فاصل كامل ، والذي يتم قطعه في أحد طرفيه. [91]

ترتبط CrRNAs ببروتينات Cas لتشكيل مجمعات ريبونوكليوتيد تتعرف على الأحماض النووية الأجنبية. لا تُظهر CrRNAs أي تفضيل بين السلاسل المشفرة وغير المشفرة ، مما يدل على نظام استهداف الحمض النووي الريبي الموجه. [5] [39] [99] [103] [137] [138] [139] يتطلب معقد النوع I-E (يشار إليه عادة باسم Cascade) خمسة بروتينات Cas مرتبطة بـ crRNA واحد. [140] [141]

تحرير التدخل

أثناء مرحلة التداخل في أنظمة النوع الأول ، يتم التعرف على تسلسل PAM على الشريط التكميلي crRNA وهو مطلوب جنبًا إلى جنب مع التلدين crRNA. في أنظمة النوع الأول ، يشير الاقتران الأساسي الصحيح بين crRNA و protospacer إلى تغيير توافقي في Cascade الذي يجند Cas3 لتدهور الحمض النووي.

تعتمد أنظمة النوع الثاني على بروتين واحد متعدد الوظائف ، Cas9 ، لخطوة التداخل. [91] يتطلب Cas9 كلاً من crRNA و tracrRNA لتعمل وتشق الحمض النووي باستخدام نطاقات نوكلياز داخلية شبيهة بـ HNH و RuvC / RNaseH. مطلوب تقوية الأساس بين PAM وجينوم الملتهمة في أنظمة النوع الثاني. ومع ذلك ، يتم التعرف على PAM على نفس الخيط مثل crRNA (الخيط المعاكس لأنظمة النوع الأول).

تتطلب أنظمة النوع الثالث ، مثل النوع الأول ، ستة أو سبعة بروتينات Cas مرتبطة بـ crRNAs. [142] [143] تم تحليل أنظمة النوع الثالث من S. solfataricus و P. furiosus كلاهما يستهدف الرنا المرسال للعاقمات بدلًا من جينوم دنا العاثيات ، [83] [143] مما قد يجعل هذه الأنظمة قادرة بشكل فريد على استهداف جينومات العاثيات القائمة على الحمض النووي الريبي. [82] تم العثور أيضًا على أنظمة من النوع الثالث تستهدف الحمض النووي بالإضافة إلى الحمض النووي الريبي باستخدام بروتين Cas مختلف في المركب ، Cas10. [144] تبين أن انقسام الحمض النووي يعتمد على النسخ. [145]

إن آلية تمييز الذات عن الحمض النووي الغريب أثناء التداخل مبنية في crRNAs ومن ثم فمن المحتمل أن تكون مشتركة بين جميع الأنظمة الثلاثة. خلال عملية النضج المميزة لكل نوع رئيسي ، تحتوي جميع crRNAs على تسلسل مباعد وجزء من التكرار في أحد الطرفين أو كلاهما. إنه تسلسل التكرار الجزئي الذي يمنع نظام CRISPR-Cas من استهداف الكروموسوم كاقتران أساسي يتجاوز إشارات تسلسل المباعد الذاتية ويمنع انقسام الحمض النووي. [146] تم تصنيف إنزيمات CRISPR الموجهة بالـ RNA على أنها إنزيمات تقييد من النوع الخامس.

يُعتقد أن جينات cas في المهايئ ووحدات المستجيب لنظام CRISPR-Cas قد تطورت من وحدتين مختلفتين عن الأسلاف. تم إدخال عنصر شبيه باللينقول يسمى casposon يشفر التكامل الشبيه بـ Cas1 والمكونات الأخرى المحتملة لوحدة التكيف بجانب وحدة المستجيب السلفي ، والتي من المحتمل أن تعمل كنظام مناعي فطري مستقل. [147] تطورت جينات cas1 و cas2 المحفوظة بشكل كبير لوحدة المحول من الوحدة السلفية بينما تطورت مجموعة متنوعة من جينات C المستجيب من الفئة 1 من وحدة المستجيب السلفي. تم توجيه تطور هذه الجينات المختلفة لوحدات المستجيب من الفئة 1 بآليات مختلفة ، مثل أحداث الازدواجية. [149] من ناحية أخرى ، نشأ كل نوع من وحدات المستجيب من الفئة 2 من عمليات إدخال مستقلة لاحقة لعناصر وراثية متحركة. [150] حلت هذه العناصر الوراثية المتنقلة محل وحدات المستجيب الجيني المتعددة لإنشاء وحدات مستجيبة جينية واحدة تنتج بروتينات كبيرة تؤدي جميع المهام الضرورية لوحدة المستجيب. [150] يتم أخذ مناطق المباعدة لأنظمة CRISPR-Cas مباشرة من العناصر الوراثية المتنقلة الأجنبية وبالتالي يصعب تتبع تطورها على المدى الطويل. [151] وُجد أن التطور غير العشوائي لمناطق المباعدة هذه يعتمد بشكل كبير على البيئة والعناصر الوراثية الأجنبية المتنقلة الخاصة التي تحتوي عليها. [152]

يمكن لـ CRISPR / Cas تحصين البكتيريا ضد بعض العاثيات وبالتالي إيقاف انتقال العدوى. لهذا السبب ، وصف كونين كريسبر / كاس كآلية لاماركية للميراث. [153] ومع ذلك ، فقد اعترض أحد النقاد على هذا الأمر حيث قال: "يجب أن نتذكر [لامارك] لما قدمه من خير في العلم ، وليس للأشياء التي تشبه نظريته بشكل سطحي فقط. في الواقع ، التفكير في كريسبر والظواهر الأخرى على أنها لاماركية فقط يحجب الطريقة البسيطة والأنيقة التي يعمل بها التطور حقًا ". [154] ولكن مع إجراء المزيد من الدراسات الحديثة ، أصبح من الواضح أن مناطق المباعدة المكتسبة لأنظمة CRISPR-Cas هي بالفعل شكل من أشكال تطور لامارك لأنها طفرات جينية يتم اكتسابها ثم نقلها. [155] من ناحية أخرى ، فإن تطور آلية جين كاس التي تسهل النظام يتطور من خلال التطور الدارويني الكلاسيكي. [155]

تحرير Coevolution

كشف تحليل تسلسل كريسبر عن التطور المشترك للجينوم المضيف والفيروسي. [156] بروتينات Cas9 غنية بالبكتيريا المسببة للأمراض والبكتيريا المتعايشة. قد يساهم تنظيم الجينات بوساطة كريسبر / كاس في تنظيم الجينات البكتيرية الذاتية ، خاصة أثناء التفاعل مع مضيفات حقيقية النواة. على سبيل المثال، فرانسيسيلا نوفيسيدا يستخدم فريدًا وصغيرًا من الحمض النووي الريبي المرتبط بـ CRISPR / Cas (scaRNA) لقمع نسخة داخلية ترميز البروتين الدهني البكتيري الضروري لـ F. نوفيسيدا لتثبيط استجابة المضيف وتعزيز الفوعة. [157]

النموذج الأساسي لتطور كريسبر هو فواصل مدمجة حديثًا تدفع العاثيات إلى تحور جينوماتها لتجنب الاستجابة المناعية البكتيرية ، مما يخلق التنوع في كل من العاثيات والمجموعات المضيفة. لمقاومة عدوى الملتهمة ، يجب أن يتوافق تسلسل فاصل CRISPR تمامًا مع تسلسل جين فج الهدف. يمكن أن تستمر العاثيات في إصابة مضيفيها عند حدوث طفرات نقطية في المباعد. [146] مطلوب صرامة مماثلة في PAM أو تظل السلالة البكتيرية حساسة للعاثية. [119] [146]

تعديل الأسعار

دراسة 124 S. ثيرموفيلوس أظهرت السلالات أن 26٪ من جميع الفواصل كانت فريدة وأن مواضع CRISPR المختلفة أظهرت معدلات مختلفة لاكتساب المباعد. [118] تتطور بعض مواقع كريسبر بسرعة أكبر من غيرها ، مما سمح بتحديد علاقات تطور السلالات. أظهر تحليل الجينوم المقارن ذلك بكتريا قولونية و S. المعوية تتطور بشكل أبطأ بكثير من S. ثيرموفيلوس. سلالات الأخيرة التي تباعدت قبل 250 ألف عام لا تزال تحتوي على نفس المكمل الفاصل. [158]

أظهر التحليل الميتاجينومي لاثنين من الأغشية الحيوية لتصريف الألغام الحمضية أن أحد كريسبر الذي تم تحليله يحتوي على عمليات حذف واسعة وإضافات مباعدة مقابل الأغشية الحيوية الأخرى ، مما يشير إلى نشاط / انتشار عاثيات أعلى في مجتمع واحد عن الآخر. [78] في تجويف الفم ، حددت دراسة زمنية أن 7-22٪ من المباعدات تمت مشاركتها على مدى 17 شهرًا مع الفرد بينما أقل من 2٪ تمت مشاركتها بين الأفراد. [127]

من نفس البيئة تم تتبع سلالة واحدة باستخدام بادئات PCR الخاصة بنظام CRISPR الخاص بها. أظهرت النتائج واسعة النطاق لوجود / غياب المباعد تنوعًا كبيرًا. ومع ذلك ، أضافت كريسبر 3 فواصل على مدار 17 شهرًا ، [127] مما يشير إلى أنه حتى في بيئة ذات تنوع كريسبر كبير ، فإن بعض المواقع تتطور ببطء.

تم تحليل كريسبر من الميتاجينومات المنتجة لمشروع الميكروبيوم البشري. [159] على الرغم من أن معظمها كانت خاصة بموقع الجسم ، إلا أن بعضها داخل موقع الجسم يتم مشاركته على نطاق واسع بين الأفراد. نشأ أحد هذه المواقع من أنواع العقديات واحتوت على ≈15000 مباعد ، 50 ٪ منها كانت فريدة من نوعها. على غرار الدراسات المستهدفة لتجويف الفم ، أظهر البعض تطورًا طفيفًا بمرور الوقت. [159]

تمت دراسة تطور كريسبر في الكيموستات باستخدام S. ثيرموفيلوس لفحص معدلات اقتناء المباعد مباشرة. في أسبوع واحد، S. ثيرموفيلوس اكتسبت السلالات ما يصل إلى ثلاثة فواصل عند الطعن بعاثة واحدة. [160] خلال نفس الفترة الزمنية ، طورت العاثية تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة التي أصبحت ثابتة في المجتمع ، مما يشير إلى أن الاستهداف منع تكاثر العاثيات في غياب هذه الطفرات. [160]

اخر S. ثيرموفيلوس أظهرت التجربة أن العاثيات يمكن أن تصيب وتتكاثر في العوائل التي لديها فاصل استهداف واحد فقط. أظهر آخر أن العوائل الحساسة يمكن أن توجد في بيئات ذات عيارات عالية من العاثيات. [161] تشير الدراسات القائمة على النظام الكيميائي والمراقبة إلى العديد من الفروق الدقيقة لتطور كريسبر والعاثية (المشترك).

تتوزع كريسبر على نطاق واسع بين البكتيريا والعتائق [87] وتظهر بعض أوجه التشابه في التسلسل. [133] وأبرز ما يميزها هو تكرار الفواصل وتكرارها المباشر. هذه الخاصية تجعل من السهل التعرف على كريسبر في تسلسلات طويلة من الحمض النووي ، لأن عدد التكرارات يقلل من احتمالية التطابق الإيجابي الخاطئ. [162]

يعد تحليل CRISPRs في البيانات metagenomic أكثر صعوبة ، حيث لا يتم تجميع مواقع CRISPR عادةً ، بسبب طبيعتها المتكررة أو من خلال تباين الإجهاد ، مما يخلط بين خوارزميات التجميع. في حالة توفر العديد من الجينومات المرجعية ، يمكن استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لتضخيم مصفوفات CRISPR وتحليل محتوى المباعد. [118] [127] [163] [164] [165] [166] ومع ذلك ، فإن هذا النهج ينتج معلومات فقط عن CRISPRs المستهدفة على وجه التحديد والكائنات الحية ذات التمثيل الكافي في قواعد البيانات العامة لتصميم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يمكن استخدام البادئات المنحلة الخاصة بالتكرار لتضخيم فواصل كريسبر مباشرة من العينات البيئية ، ويمكن بعد ذلك تجميع الأمبليكونات التي تحتوي على فواصل أو ثلاثة فواصل حسابية لإعادة بناء مصفوفات كريسبر الطويلة. [166]

البديل هو استخراج وإعادة بناء مصفوفات كريسبر من بيانات ميتاجينوميات البندقية. يعد هذا أكثر صعوبة من الناحية الحسابية ، خاصة مع تقنيات تسلسل الجيل الثاني (على سبيل المثال 454 ، Illumina) ، حيث تمنع أطوال القراءة القصيرة ظهور أكثر من وحدتين أو ثلاث وحدات متكررة في قراءة واحدة. تم تحقيق تحديد CRISPR في القراءات الأولية باستخدام بحت من جديد تحديد [167] أو باستخدام متواليات التكرار المباشر في مصفوفات CRISPR المجمعة جزئيًا من contigs (مقاطع DNA المتداخلة التي تمثل معًا منطقة إجماع من DNA) [159] وتسلسلات التكرار المباشر من الجينومات المنشورة [168] كخطاف لتحديد التكرارات المباشرة في القراءات الفردية.

هناك طريقة أخرى للبكتيريا للدفاع ضد عدوى العاثيات وهي امتلاك جزر صبغية. نوع فرعي من جزر الكروموسومات يسمى جزيرة الكروموسومات المحرضة بالعاثية (PICI) يتم استئصاله من كروموسوم بكتيري عند الإصابة بالعاثية ويمكن أن يمنع تكاثر العاثيات. [169] يتم تحريض PICIs ، واستئصالها ، وتكرارها ، ثم تعبئتها أخيرًا في كبسولات صغيرة بواسطة عاثيات معتدلة من المكورات العنقودية. تستخدم PICIs عدة آليات لمنع تكاثر الملتهمة. في الآلية الأولى ، تقوم Ppi المشفرة بواسطة PICI بشكل تفاضلي بحظر نضج الملتهمة عن طريق الارتباط أو التفاعل بشكل خاص مع Phage TerS ، وبالتالي يحجب تكوين معقد TerS / TerL المسؤول عن تعبئة الحمض النووي للعاثية. في الآلية الثانية ، تقوم PICI CpmAB بإعادة توجيه البروتين المورفوجيني لقفيصة الملتهمة لجعل 95٪ من الحمض النووي للقفيصة والعاثية بحجم SaPI يمكن أن يحزم فقط ثلث جينومهما في هذه القفيصة الصغيرة ومن ثم تصبح فجّة غير قابلة للحياة. [170] تتضمن الآلية الثالثة بروتينين ، PtiA و PtiB ، يستهدفان بروتين LtrC المسؤول عن إنتاج بروتينات الفيريون والتحلل. يتم تعديل آلية التداخل هذه بواسطة بروتين تعديل ، PtiM ، يرتبط بأحد البروتينات الوسيطة للتداخل ، PtiA ، وبالتالي تحقيق المستوى المطلوب من التداخل. [171]

أظهرت إحدى الدراسات أن الملتهمة ICP1 lytic ، والتي تستهدف على وجه التحديد ضمة الكوليرا حصلت مجموعة serogroup O1 على نظام CRISPR / Cas الذي يستهدف a ضمة الكوليرا عنصر يشبه PICI. يحتوي النظام على 2 CRISPR loci و 9 جينات Cas. يبدو أنه متماثل مع نظام IF الموجود في يرسينيا بيستيس. علاوة على ذلك ، مثل نظام CRISPR / Cas البكتيري ، يمكن لـ ICP1 CRISPR / Cas الحصول على تسلسلات جديدة ، مما يسمح للعاثية والمضيف بالتطور المشترك. [172]

ثبت أن بعض الفيروسات البدائية تحمل مصفوفات CRISPR المصغرة التي تحتوي على فاصل واحد أو اثنين. لقد ثبت أن الفواصل الموجودة داخل مصفوفات CRISPR المحمولة بالفيروسات تستهدف فيروسات وبلازميدات أخرى ، مما يشير إلى أن مصفوفات CRISPR المصغرة تمثل آلية لاستبعاد العدوى الفوقية غير المتجانسة والمشاركة في التعارضات البينية. [166]

تحرير الجينات كريسبر

تم تطبيق تقنية كريسبر في الصناعات الغذائية والزراعية لهندسة مزارع الكائنات الحية المجهرية وتحصين الثقافات الصناعية (مثل الزبادي) ضد العدوى. كما يتم استخدامه في المحاصيل لتعزيز الغلة وتحمل الجفاف والقيمة الغذائية. [173]

بحلول نهاية عام 2014 ، تم نشر حوالي 1000 ورقة بحثية ذكرت تقنية كريسبر. [174] [175] تم استخدام التكنولوجيا لتعطيل الجينات وظيفيًا في خطوط وخلايا الخلايا البشرية ، للدراسة المبيضات البيض، لتعديل الخمائر المستخدمة في صنع الوقود الحيوي ولتعديل سلالات المحاصيل وراثيًا. [175] صرح هسو وزملاؤه أن القدرة على معالجة التسلسل الجيني تسمح بالهندسة العكسية التي يمكن أن تؤثر إيجابًا على إنتاج الوقود الحيوي [176] كما يمكن استخدام كريسبر لتغيير البعوض حتى لا يتمكن من نقل أمراض مثل الملاريا. [177] تم مؤخرًا استخدام المناهج المستندة إلى كريسبر والتي تستخدم Cas12a في التعديل الناجح لعدد كبير من أنواع النباتات. [178]

في يوليو 2019 ، تم استخدام تقنية كريسبر بشكل تجريبي لعلاج مريض مصاب باضطراب وراثي. كانت المريضة تبلغ من العمر 34 عامًا مصابة بمرض فقر الدم المنجلي. [179]

في فبراير 2020 ، تم إحراز تقدم في علاجات فيروس نقص المناعة البشرية مع إزالة 60-80 ٪ من الحمض النووي في الفئران وبعضها خالي تمامًا من الفيروس بعد تعديلات شملت كل من LASER ART ، وعلاج جديد مضاد للفيروسات ، و CRISPR. [180]

في مارس 2020 ، تم حقن فيروس معدّل بتقنية CRISPR في عين المريض في محاولة لعلاج مرض ليبر الخلقي. [181]

في المستقبل ، يمكن استخدام تحرير الجينات CRISPR لإنشاء أنواع جديدة أو إحياء الأنواع المنقرضة من الأنواع وثيقة الصلة. [182]

أدت عمليات إعادة التقييم المستندة إلى CRISPR للادعاءات المتعلقة بعلاقات الأمراض الجينية إلى اكتشاف حالات شذوذ يحتمل أن تكون مهمة. [183]

كريسبر كأداة تشخيص تحرير

أظهرت النيوكليزات المرتبطة بـ CRISPR أنها مفيدة كأداة للاختبار الجزيئي نظرًا لقدرتها على استهداف تسلسل الحمض النووي على وجه التحديد في خلفية عالية من التسلسلات غير المستهدفة. في عام 2016 ، تم استخدام نوكلياز Cas9 لاستنفاد تسلسلات النوكليوتيدات غير المرغوب فيها في مكتبات تسلسل الجيل التالي بينما تتطلب 250 بيكوغرامًا فقط من إدخال الحمض النووي الريبي الأولي. [184] وابتداءً من عام 2017 ، تم استخدام نوكليازات كريسبر المرتبطة أيضًا للاختبار التشخيصي المباشر للأحماض النووية ، وصولاً إلى حساسية الجزيء الواحد. [185] [186]

من خلال اقتران التشخيصات القائمة على كريسبر بعمليات إنزيمية إضافية ، يمكن اكتشاف الجزيئات التي تتجاوز الأحماض النووية. أحد الأمثلة على التكنولوجيا المقترنة هو التنميط المستند إلى SHERLOCK للنسخ في المختبر (SPRINT). يمكن استخدام SPRINT للكشف عن مجموعة متنوعة من المواد ، مثل المستقلبات في عينات المرضى أو الملوثات في العينات البيئية ، ذات الإنتاجية العالية أو مع أجهزة نقطة الرعاية المحمولة. [187] يتم أيضًا استكشاف منصات كريسبر / كاس للكشف [188] [189] [190] [191] [192] وتعطيل فيروس SARS-CoV-2 ، الفيروس الذي يسبب COVID-19. [193]


الانتماءات

مركز مؤسسة نوفو نورديسك للاستدامة الحيوية ، جامعة الدنمارك التقنية ، لينجبي ، الدنمارك

ياوجون تونج ، كريستوفر إم.ويتفورد ، كاي بلين ، تو إس يورجنسن ، تيلمان ويبر وأمبير سانغ يوب لي

مختبر الأبحاث الوطني للهندسة الأيضية والجزيئية الحيوية ، قسم الهندسة الكيميائية والجزيئية الحيوية (برنامج BK21 Plus) ، مركز الأنظمة والتكنولوجيا الحيوية الاصطناعية ، معهد BioCentury ، المعهد الكوري المتقدم للعلوم والتكنولوجيا (KAIST) ، دايجون ، جمهورية كوريا


شاهد الفيديو: المقطع الثاني. سلالات الحمض النووي DNA و سلالة اهل البيت وكذب انتساب سادة الشيعة و الصوفية لهم (أغسطس 2022).