معلومة

14.3: حركة العوامل الممرضة - علم الأحياء


في حين أن مسببات الأمراض المجهرية ليست متحركة بشكل مستقل ، فإن مضيفيها كذلك ، وقد طورت مسببات الأمراض طرقًا بارعة لتعديل سلوك المضيف لتمكين نقلها إلى مضيف آخر.

العطس والسعال ردود الفعل ، على سبيل المثال ، هي ردود فعل قديمة لإزالة العوائق من الأنف والحلق ، وبعض مسببات الأمراض تحفز بشكل خادع هذه الاستجابات لمسار الخروج (الشكل ( PageIndex {1} )). ما نسميه "أعراض المرض" ليس ، إذن ، آثارًا عشوائية لمرض ما ، ولكن يمكن أن يكون غالبًا وسيلة للمرض للخروج من بركة ، إذا جاز التعبير ، إلى أخرى. أي من المسارات المدرجة في الفصل 14.1 يمكن أن يستغلها العامل الممرض ، مما قد يزعج هذه المسارات ويسبب ضائقة كبيرة للمضيف.

شكل ( PageIndex {2} ). العين الوردية والقروح الباردة.

بعض مسببات الأمراض ، على سبيل المثال ، تدخل في عينيك وتبكي وتتسبب بشكل خادع في الحكة والألم (الشكل ( PageIndex {2} ) ، على اليسار) ، مما يدفعك لفرك عينيك ونقل مسببات الأمراض إلى أصابعك. وهذا بدوره يمكن أن ينقلهم بنجاح إلى مواقع أخرى مثل الطعام ، والتي يمكنهم من خلالها الدخول إلى مضيف آخر عن طريق المسار الشفوي.

يمكن لمسببات الأمراض الأخرى أن تكسر الجلد وتخرج من الجسم بمفردها. قروح البرد (الشكل ( PageIndex {2} ) ، على اليمين) ، شكل من أشكال الهربس الفموي ، يتشكل حول الفم والأنف ، وينتقل إلى ما يلمس القرحة. ينتقل الهربس التناسلي ذو الصلة عن طريق الاتصال الجنسي ، على الرغم من استمرار التطور وأصبح الشكل التناسلي الآن قادرًا على إصابة الشكل الفموي والأعضاء التناسلية. هذه الأمراض وغيرها من الأمراض التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي تتزايد منذ حوالي منتصف القرن العشرين.

يعد الجدري أحد أكثر مسببات الأمراض نجاحًا في استخدام الرئتين والجلد كمسارات للخروج من الجسم (الشكل ( PageIndex {3} )). يترك مضيفه بندوب دائمة ، غالبًا على الجسم بالكامل. يعد الجدري مرضًا قديمًا ، يعود تاريخه إلى ما قبل الأهرامات ، ويمكن أن يقتل غالبية من يصيبهم ، ويمكن أن يصيب في بعض الأحيان غالبية السكان.

الشكل ( PageIndex {3} ). الجدري هو أول مرض ينقرض بوعي من العالم الطبيعي.

كان نجاح ورعب الجدري جزءًا من تدميره النهائي - كان القضاء عليه أول انتصار كامل في قهر المرض. بفضل الاهتمام الدؤوب المطول في جميع أنحاء العالم ، وبالطبع اختراع اللقاح ، انقرض الجدري في العالم الطبيعي. (نقول "عالم طبيعي" لأنه يتم الاحتفاظ بالعينات المختبرية).

قال ويليام فويج ، وهو لاعب رئيسي في تنظيم انقراض الجدري ، إنه يمكننا التغلب على المرض لأننا نتطور بسرعة أكبر بكثير من المرض. قد يكون من المذهل سماع هذا ، بالنظر إلى أن تطورنا الفسيولوجي أبطأ بكثير من تطور الفيروسات أو البكتيريا. لكنه أوضح ، نظرًا لأننا نتطور اجتماعيًا بسرعة أكبر بكثير من قدرة المرض على التطور بيولوجيًا ، فنحن قادرون على "التغلب على المرض".

كان الطاعون البقري ، وهو مرض فيروسي يتسبب في ارتفاع معدلات وفيات الماشية والثدييات البرية ، ثاني مرض أعلن انقراضه في العالم الطبيعي. قد يتبعه قريبًا مرض آخر - مثل شلل الأطفال ومرض دودة غينيا - على الرغم من أن هذا الأخير قد يتم استئصاله ببساطة من السكان من خلال عزلتنا المستمرة عن مصادر العدوى.

يمكن للأمراض أن تستغل الطفيليات الماصة للدم للانتقال مباشرة من مجرى الدم لمضيف إلى آخر. مرض لايم (الشكل ( PageIndex {4} ) ، يسار) ، على سبيل المثال ، ينتشر عن طريق القراد ، الذي يثقب الجلد للحصول على وجبة دم لأنفسهم ولكن في هذه العملية يمكن أن ينقل مسببات الأمراض. ويغادر الإيبولا (الشكل ( PageIndex {4} ) ، على اليمين) من كل بوابة خروج مدرجة تقريبًا ، مما يؤدي إلى تدمير هذه البوابات عن طريق نقل ليس فقط العامل الممرض ولكن قطعًا من الرئة أو الأمعاء أو الجلد أثناء العملية.

الشكل ( PageIndex {4} ). داء لايم (يسار) وشكل واحد من الإيبولا (يمين).

أعداد السكان كبيرة وكثيفة لدرجة أنه حتى مسببات الأمراض غير الفعالة نسبيًا يمكن أن تكون ناجحة. والأمراض ، بالطبع ، تؤثر أيضًا على الحيوانات البرية والداجنة وكذلك المحاصيل والنباتات الأخرى.

كما يوضح الفصل التالي ، يمكن أن تتطور العديد من الأمراض لتصبح غير ضارة نسبيًا بمضيفيها ، مما يعزز انتقال المرض ويسمح بانتشار المرض. عدوى فطر الصدأ ، على سبيل المثال ، شائعة في العديد من أنواع النباتات ، ولكنها نادرًا ما تؤدي إلى موت المضيف. مسحوق العفن على نبات البراري ناسور موناردا منتشر لدرجة أنه يتم استخدامه في كتب تعريف النباتات كطريقة لتحديد الأنواع (الشكل ( PageIndex {5} ) ، على اليمين).

يمكن لمسببات الأمراض أن تغير سلوك الحيوان بشكل كبير. ينتقل داء الكلب أولاً عبر الغدد اللعابية إلى لعاب المضيف المصاب. ثم تؤدي التغييرات الفسيولوجية إلى جعل الحيوان المضيف يسيل لعابه بغزارة - برغوة من الفم - بينما تجعله التغييرات النفسية يبدو مجنونًا وغاضبًا. ثم يعض الحيوان من خلال جلد حيوان آخر ، وينقل العامل الممرض إلى مجرى دم ذلك الحيوان ، وتستمر الدورة. كل من التغيرات الفسيولوجية والنفسية ناتجة عن العامل الممرض وتسمح له بالانتشار ، حتى بعد وفاة المضيف الأولي.

شكل ( PageIndex {5} ). Prarie Bush Clover و Monarda fistulosa.

وبالتالي ، فإن "سلوك الكلب المجنون" ليس نتيجة عرضية للمرض ، ولكنه على وجه التحديد الوسيلة التي طورها العامل الممرض للانتقال ، إذا جاز التعبير ، من بركة إلى أخرى.

من المفيد محاولة التفكير في جميع الطرق التي قد يغير بها العامل الممرض سلوك مضيفه لإجبار المضيف على نقل العامل الممرض. هذا ليس مجرد تمرين فكري ، ولكن يمكن أن يساعد في تحديد إمكانية ظهور أمراض جديدة. على سبيل المثال ، ما الذي يجب أن يفعله مرض ينتقل عن طريق الاتصال الجنسي بمضيفه من أجل الانتشار بشكل أسرع؟ يجب أن تجعل مضيفه أكثر نشاطا جنسيا! وهذا يحدث بالفعل. عادة ما تتزاوج أنثى الشمبانزي كل عامين أو نحو ذلك ، بعد الولادة وإرضاع صغارها إلى درجة الفطام. لكن إناث الشمبانزي المصابة بـ SIV (فيروس نقص المناعة القردى) تصل إلى شبق كل شهر أو نحو ذلك ، ولا تتصور. يغير العامل الممرض سلوك التزاوج الخاص به لينتشر بنفسه بسرعة أكبر مما يمكن أن ينتشر.

بإلهام للتفكير بهذه الطريقة ، ابتكر أحد الطلاب فكرة جديدة: تخيل مرضًا يمكنه الهروب من خلال الغدد العرقية دون الإضرار بمضيفه. كتعديل سلوكي ، فإنه يجعل المضيفين المصابين يرغبون في الخضوع لممارسة التمارين الشاقة في مجموعات ، كما هو الحال في الصالات الرياضية - وبالتالي يفسر ظاهرة التمرين الحديثة بأكملها على أنها مرض! (قد يصاب الجربوع أيضًا بهذا المرض).


يكشف تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية عن عدم تجانس خاص بالمقصورة وليونة الخلايا الدبقية الصغيرة

الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا ضامة مقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) في كل مكان تحافظ على توازن الأنسجة العصبية وتحميها من هجمات مسببات الأمراض. ومع ذلك ، فإن تمايزهم في أقسام مختلفة لا يزال بعيد المنال. أجرينا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية لمقارنة الأنواع الفرعية الدبقية الدبقية في القشرة والنخاع الشوكي. تم إجراء تحليل مقارن متعدد الاتجاهات على عينات من الفئران المعدلة وراثيا C57 / BL و HIV gp120 في عمر شهرين وأربعة وثمانية أشهر. كشفت النتائج متداخلة ولكن متميزة من الخلايا الدبقية الصغيرة في القشرة والنخاع الشوكي. تم اقتراح عدم التجانس التفاضلي للخلايا الدبقية الصغيرة في مناطق الجهاز العصبي المركزي هذه من خلال تباينها في اللدونة استجابة لتطور مدى الحياة والبروتين الممرض HIV-1 gp120. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن الخلايا الدبقية الصغيرة في حجرات مختلفة من الجهاز العصبي المركزي تتكيف مع بيئاتها المحلية للوفاء بالوظائف البيولوجية الخاصة بالمنطقة.

الكلمات الدالة: علم الأحياء التنموي علم المناعة.

بيان تضارب المصالح

لم يتم الإبلاغ عن أي إفصاحات.

الأرقام

كشف تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) ...

كشف تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) عن أنواع فرعية دبقية صغيرة خاصة بالمنطقة من النوع البري البالغ من العمر شهرين (Wt) ...

اللدونة الزمنية المختلفة للفأر ...

اللدونة الزمنية المختلفة للتغاير القشري الدبقي الشوكي والقشرة الشوكية للفأر (أ) الصدغي ...

تغاير الخلايا الدبقية الصغيرة الخاصة بالمنطقة في عمر شهرين ...

تغاير الخلايا الدبقية الصغيرة الخاصة بالمنطقة في الفئران المعدلة وراثيًا HIV-1 gp120 (Tg) البالغة من العمر شهرين (A و B) ...

مقارنة الملامح الزمنية ...

مقارنة بين الملامح الزمنية للتغاير القشري الدبقي الصغير للوزن و gp120 ...

التحقق من MYE-M في ...

التحقق من MYE-M في النسيج الشوكي والقشري Wt و Tg لـ ...

مقارنة الملامح الزمنية ...

مقارنة الملامح الزمنية لعدم تجانس الخلايا الدبقية الشوكية للوزن و gp120 ...

التحقق من INF-M في ...

التحقق من INF-M في الأنسجة الشوكية والقشرية بالوزن والقشرة لـ ...

تأثير HIV-1 gp120 على مسارات الإشارات العصبية القشرية والعمودية الدبقية الدبقية ...

يظهر مخطط دائري ملخص…

يُظهر مخطط دائري ملخص النسب النسبية للأنواع الفرعية الفردية الدبقية الصغيرة في ...


آلية التعرف على بروتين السارس- CoV-2 ببروتينات نوكليوكابسيد بواسطة البروتينات البشرية 14-3-3

يتحكم بروتين نوكليوكابسيد لفيروس كورونا (N) في عبوات الجينوم الفيروسي ويحتوي على العديد من مواقع الفسفرة الموجودة داخل مناطق غير منظمة. تم الإبلاغ عن ارتباط SARS-CoV N الفسفوري بالبروتين المضيف 14-3-3 في السيتوبلازم لتنظيم النقل المكوكي N nucleocytoplasmic. جميع الأشكال الإسوية السبعة للإنسان 14-3-3 موجودة بكثرة في الأنسجة المعرضة لـ SARS-CoV-2 ، حيث يمكن أن يشكل N ما يصل إلى

1٪ من البروتينات المعبر عنها أثناء الإصابة. على الرغم من أن الارتباط بين بروتينات 14-3-3 وبروتينات SARS-CoV-2 N يمكن أن يمثل أحد التفاعلات الرئيسية بين المضيف والممرض ، إلا أن آليته الجزيئية والفوسفوسفات الحرجة المحددة غير معروفة. هنا ، نوضح أن ثنائيات بروتين SARS-CoV-2 N (pN) الفسفرة ، المعاد تكوينها عن طريق التعبير المشترك البكتيري مع بروتين كيناز A ، ترتبط مباشرة ، بطريقة تعتمد على الفسفرة ، بالبروتين القاتم 14-3-3 ، ولكن ليس مع متحولة أحادية. نظهر أن pN معترف بها من قبل جميع الأشكال الإسوية البشرية السبعة 14-3-3 بكفاءات مختلفة واستنتاج K الظاهرد إلى الأشكال الإسوية المختارة ، مما يدل على أن هذه في نطاق ميكرومولار منخفض. حددت الاقتطاعات التسلسلية موقع الفسفرة الحرج إلى Ser197 ، والذي يتم حفظه بين فيروسات كورونا حيوانية المصدر ذات الصلة ويقع داخل المنطقة المهمة وظيفيًا والغنية بـ SR في N. N عن طريق انسداد المنطقة الغنية بـ SR ، ويمكن أيضًا اختطاف المسارات الخلوية بحبس 14-3-3. على هذا النحو ، قد يمثل التجمع هدفًا قيمًا للتدخل العلاجي.

الكلمات الدالة: تفاعلات العائل والممرضات الخلوية النوى الفسفرة البروتين - البروتين المركب القياس المتكافئ.

حقوق النشر © 2021 المؤلف (المؤلفون). تم النشر بواسطة Elsevier Ltd .. جميع الحقوق محفوظة.

بيان تضارب المصالح

إعلان عن تضارب المصالح يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل الوارد في هذه الورقة.


الكشف عن الأهمية المتساوية لبروتينين 14-3-3 من أجل التشكل ، والتشكيل ، وتحمل الإجهاد ، وضراوة مسببات الأمراض الحشرية

اثنين من البروتينات المحفوظة 14-3-3 المتعامدة مع Saccharomyces cerevisiae Bmh1 / 2 غير مفهومة جيدًا في الفطريات الخيطية. نوضح هنا أن Bmh1 و Bmh2 يساهمان بالتساوي في علم الأحياء الأساسي وعلم وظائف الأعضاء في Beauveria bassiana من خلال استهداف مجموعات عديدة من البروتينات / الإنزيمات. تسبب الحذف المفرد لـ Bmh في تنظيم مماثل لآخر. أدت تعبيرات ضربة قاضية ممتازة (∼91٪) لـ Bmh1 في Bmh2 و Bmh2 في Bmh1 إلى عيوب متعددة الأنماط أكثر شدة من عمليات الحذف المفردة ، بما في ذلك انتقال G2 / M ، وحجم المتفجرات ، واستخدام الكربون / النيتروجين ، والكونيدية ، والإنبات ، والتفاوتات البؤرية إلى عالية الأسمولية والأكسدة وإجهاد جدار الخلية ودرجة الحرارة العالية والإشعاع فوق البنفسجي. أظهرت جميع طفرات الحذف والحذف / الضربة القاضية عيوبًا متشابهة في إنتاجية الأبواغ المتفجرة وكثافتها ، وانفصال النخاع وحجم الخلية ، والاستجابات الخيطية لمعظم الضغوط الكيميائية والفوعة. كانت جميع العيوب واضحة من خلال النسخ المعدلة للجينات المرتبطة بالنمط الظاهري واستعادتها جيدًا بواسطة كل مكمل لـ Bmh. كشفت النسخ الخاصة بنا الخاصة بـ Bmh1 و Bmh2 التي تم إنشاؤها تحت الضغوط التناضحية والتأكسدية عن ما يصل إلى 6 ٪ من الجينات المعبر عنها تفاضليًا بمقدار ضعفين على الأقل في الجينوم الفطري. كان العديد من هؤلاء مكتئبين بشكل كبير أو يعانون من الاكتئاب المشترك في Bmh1 و Bmh2. توفر النتائج التي توصلنا إليها نظرة ثاقبة للوظائف والتأثيرات التكميلية للبروتينين 14-3-3 في مسببات الأمراض الخيطية.


البيولوجيا الجزيئية والسيطرة المناعية للمزمن التوكسوبلازما عدوى

قسم الأحياء الدقيقة والمناعة وبيولوجيا السرطان ومركز كارتر للمناعة ، كلية الطب بجامعة فيرجينيا ، شارلوتسفيل ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

عنوان المراسلات إلى: Sarah E.Ewald، Carter Immunology Center MR-63706، University of Virginia School of Medicine، Charlottesville، Virginia 22908، USA. الهاتف: 434.924.1925 البريد الإلكتروني: [email protected]

اعثر على مقالات بواسطة Zhao، X. في: JCI | PubMed | الباحث العلمي من Google | />

قسم الأحياء الدقيقة والمناعة وبيولوجيا السرطان ومركز كارتر للمناعة ، كلية الطب بجامعة فيرجينيا ، شارلوتسفيل ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

عنوان المراسلات إلى: Sarah E.Ewald، Carter Immunology Center MR-63706، University of Virginia School of Medicine، Charlottesville، Virginia 22908، USA. الهاتف: 434.924.1925 البريد الإلكتروني: [email protected]

التوكسوبلازما هو طفيلي ناجح بشكل لا يصدق ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى قدرته على البقاء داخل الخلايا طوال حياة المضيف. بشكل ملحوظ ، ما لا يقل عن 350 نوعا مضيفا من T. جوندي تم وصفه حتى الآن ، ويقدر أن 30 ٪ من سكان العالم مصابون بشكل مزمن. أهمية T. جوندي في صحة الإنسان مع التقارير الأولى عن داء المقوسات الخلقي في الأربعينيات. ومع ذلك ، كشفت أزمة الإيدز في الثمانينيات عن انتشار العدوى المزمنة ، حيث ظهر على المرضى داء المقوسات المزمن المعاد تنشيطه ، مما يؤكد أهمية وجود نظام مناعي سليم للسيطرة على الطفيليات. في السنوات الأربعين الماضية ، كان هناك تقدم هائل نحو فهم بيولوجيا T. جوندي العدوى باستخدام نماذج القوارض والأنظمة التجريبية للخلايا البشرية والبيانات السريرية. ومع ذلك ، لا تزال هناك ثغرات كبيرة في فهمنا T. جوندي علم الأحياء ، بما في ذلك الجينات التي تتحكم في تطور الطفيليات ، وآليات المناعة الذاتية للخلية T. جوندي في الدماغ والعضلات ، والتأثيرات طويلة المدى للعدوى على التوازن المضيف. تم التأكيد على الحاجة إلى فهم بيولوجيا العدوى المزمنة بشكل أفضل من خلال الارتفاع الأخير في أمراض العين المرتبطة بالأنماط الفردية الناشئة من T. جوندي وعدم وجود علاجات فعالة لتعقيم العدوى المزمنة. تناقش هذه المراجعة أنواع الخلايا والوسطاء الجزيئي ، سواء المضيف أو الطفيلي ، التي تسهل الثبات T. جوندي عدوى. نسلط الضوء على عواقب العدوى المزمنة لعلم الأمراض الخاص بالأنسجة ونحدد الأسئلة المفتوحة في هذا المجال من المضيف-التوكسوبلازما التفاعلات.

التوكسوبلازما هو طفيلي وحيد الخلية ملزم داخل الخلايا يتم اكتسابه عن طريق تناول الأطعمة الملوثة. أنواع القطط T. جونديالمضيفين النهائيين ، مما يعني أن القطط تسهل إعادة التركيب الجنسي للطفيلي وتلقي الملايين من البويضات شديدة العدوى والمستقرة بيئيًا (1). T. جوندي فريد من نوعه في نطاق مضيفه الوسيط الواسع بشكل لا يصدق ، والذي يشمل البشر والماشية (الأغنام والخنازير مهمة بشكل خاص لانتقال الإنسان) والطيور والقوارض ، من بين أمور أخرى (2). تدعم هذه العوائل الوسيطة أشكال كيس الأنسجة اللاجنسي tachyzoite و bradyzoite للطفيلي. الرخويات ، التي تركز البويضات عن طريق تصفية المياه الملوثة ، هي ناقل إضافي للانتقال إلى البشر (3). بعد استهلاك كيسات نسيج البراديزويت أو البويضات ، T. جوندي يغزو الأمعاء الدقيقة لمضيفه (4 ، 5). يشير العمل الأخير من مختبر Laura Knoll إلى أن الطفيل قد يشعر بحمض اللينوليك في أمعاء القطط كإشارة حاسمة لتمايز المرحلة الجنسية في هذه الأنواع (6). يمنح المرور عبر القط فائدة هائلة للطفيلي من حيث التنوع الجيني وتوسيع النطاق ، ويبدو أن تسهيل الانتقال إلى القطط يمثل ضغطًا كبيرًا يقود تطور الطفيلي. نظرًا لأهمية دورة المفترس والفريسة بين القوارض والقطط ، فقد تكون القوارض مضيفًا مهمًا بشكل خاص T. جوندي. كما سيتم مناقشته ، هذا الاستنتاج مدعوم بالملاحظات التي T. جوندي يعبر عن كادر متطور من المؤثرات التي تتقاطع مع الإشارات المناعية للفأر (7-9) وأن القوارض المصابة تفقد نفورها الطبيعي من بول القطط (10 ، 11) ويمكن أن تصبح ضائعة بشدة (12-14) ، وكلها قد تسهل الانتقال عبر افتراس مضيف القوارض.

معدلات الإنسان T. جوندي تتراوح الإصابة من 10٪ في الولايات المتحدة إلى أكثر من 50٪ في فرنسا وكولومبيا والبرازيل (15-17). يمكن أن تسبب العدوى الحادة أعراضًا شبيهة بأعراض الأنفلونزا ، ومع ذلك ، فإن الأفراد المؤهلين للمناعة يزيلون غالبية الطفيليات أثناء العدوى الحادة. تستمر الطفيليات الباقية على قيد الحياة كخراجات أنسجة براديزويت بطيئة النمو ، وأكثرها وفرة في الأنسجة ذات المراقبة المناعية المحدودة ، بما في ذلك الدماغ والعين والقلب والعضلات الهيكلية (18). المقاولات T. جوندي أثناء الحمل يمكن أن تكون قاتلة للجنين ، الذي لديه أيضًا الحد الأدنى من جهاز المناعة (19). الأنسجة التي لم تكن تُعتبر تقليديًا "ذات امتياز مناعي" تأوي أيضًا الطفيليات ، بناءً على ملاحظة أن متلقي الكلى أو الكبد أو القلب أو الرئة قد أصيبوا بداء المقوسات من متبرع مصاب (20-24). ومع ذلك ، فإن العدوى المزمنة في هذه الأنسجة تكاد تكون غير مدروسة ، حيث أن تواتر الطفيليات منخفض بشكل لا يصدق. الاستجابة المناعية ل T. جوندي يستمر طوال فترة العدوى المزمنة ، وهذا واضح في ارتفاعه T. جوندي- IgG محدد و IFN-في المصل ، وكلاهما ضروري للحد من الطفيليات (25). إذا تم قمع جهاز المناعة أثناء العلاج الكيميائي أو زرع الأعضاء أو الإيدز ، على سبيل المثال ، T. جوندي يمكن أن تعود إلى تكرار tachyzoite (26 ، 27). يمكن أن تكون هذه العملية ، المعروفة باسم الانتكاس ، مميتة إذا لم يتم السيطرة على طفيليات الدم بالأدوية. النظم العلاجية الأكثر شيوعًا هي البيريميثامين الممزوج بالسلفاديازين أو الكليندامايسين تريميثوبريم بالاشتراك مع السلفاميثوكسازول يمكن استخدامه كبديل (28). ومع ذلك ، فإن هذه العلاجات المضادة للطفيليات لا يمكن تحملها بشكل جيد ، كما أن فرط الحساسية لعقاقير السلفا شائعة بشكل خاص. في الوقت الحالي ، لم يتم تطوير أي علاجات لتكيسات الأنسجة الشفافة ، ربما بسبب النمو البطيء للبراديزوات ، وعزلها داخل الخلايا العصبية ، و / أو صعوبة تطوير الأدوية التي تعبر الحاجز الدموي الدماغي. هذه منطقة ذات حاجة ماسة ، مثل أنماط الفردانية الجديدة T. جوندي الناشئة التي ترتبط بأمراض العين الشديدة في المرضى المؤهلين للمناعة (29 ، 30).

في أمريكا الشمالية وأوروبا ، العزلات البيئية T. جوندي تنتمي في الغالب إلى ثلاثة سلالات أو أنواع رئيسية: النوع الأول والنوع الثاني والنوع الثالث. هذه الأنواع ملحوظة في تلك الفوعة ، المقاسة بالجرعة المميتة (LD) ، تختلف بعدة سجلات في سلالات فطرية من الفئران (على سبيل المثال ، C57BL / 6 ، CBA / J ، BALB / c). النوع الأول هو الأكثر ضراوة (LD100 من 1-10 tachyzoites) ، مقارنة مع النوع الثاني (LD50 من 100-1000) والنوع الثالث (LD50 من

100000 إلى 1 مليون) ، وهي أقل عدوانية في الجسم الحي (31 ، 32). يسيطر النوع الثاني على العدوى البشرية في أمريكا الشمالية وأوروبا ، ومع ذلك ، تم عزل النوع الرابع ، هابلوغروب 12 ، مؤخرًا من مرضى أمريكا الشمالية والحيوانات البرية (33). في آسيا وأفريقيا ، تم أيضًا عزل الأنساب النسيليّة الخاصة بالمنطقة (34). تم تحديد السلالات التي لا تتناسب مع نمط توسع النسب النسيلي في أمريكا الجنوبية التي تنتمي إلى مجموعات هابلوغروبس من 4 إلى 15 (35 - 37). يشير تسلسل الجينوم الكامل إلى أن الاختلاط الجيني وإعادة التركيب بين عدد محدود من سلالات الأجداد يفسر T. جونديالتنوع الجيني. تم تحديد العلاقة بين السلالات من خلال مقارنة نمط الوراثة للكتل الفردية الجينية الكبيرة. تقوم هذه الكتل الفردية بتشفير البروتينات المستجيبة للطفيليات المرتبطة بالفوعة ، مما يشير إلى أن التشكيلة الفريدة من الأليلات المستجيب قد تتحكم أيضًا في التسبب في المرض و / أو معدلات الانتقال (38). الأهم من ذلك ، هناك دليل على التطور المشترك بين الأنماط الفردية الخبيثة وجينات GTPase (IRG) المرتبطة بالمناعة التي تحفز على الفئران ، والتي تعد وسطاء مهمين لقتل الطفيليات الداخلية في الخلايا في نماذج الفئران (39 ، 40).

يعد تنشيط الاستجابة المناعية القوية أمرًا بالغ الأهمية لبقاء العائل والطفيلي على قيد الحياة. أكياس البراديزويت مقاومة للبروتياز الهضمي ، لكن tachyzoites ليست كذلك: إذا مات العائل قبل حدوث العدوى المزمنة ، لا يحدث انتقال الطفيلي. تمشيا مع هذا النموذج ، طور الطفيل مؤثرات تنشط بشكل انتقائي إشارات الخلايا المناعية المضيفة بالإضافة إلى استراتيجيات لتجنب تعقيم المناعة. في حالات العدوى الحادة والمزمنة ، T. جوندي ينمو ويستمر داخل غشاء فجوة طفيلي (PVM). يتم إنشاء PVM من غشاء البلازما المضيف حيث يشق الطفيل طريقه إلى الخلية باستخدام بروتينات الطفيل المحقونة. تتجنب هذه العملية البيئة اللاحلوية للمقصورات الداخلية / الليزوزومية وتفسر قدرة الطفيلي الرائعة على إصابة أي نوع من الخلايا المنواة تقريبًا في المختبر (41). ومع ذلك ، في الجسم الحي ، تكون أنواع الخلايا التي تؤوي الطفيلي أكثر محدودية. بعد تناول كيس طفيلي ، T. جوندي يغزو الصائم البعيدة من الأمعاء الدقيقة في الفئران (42 ، 43). أنواع الخلايا المضيفة الدقيقة التي تتوسط الغزو (على سبيل المثال ، الخلايا M ، الخلايا الظهارية) غير واضحة ، T. جوندي وقد لوحظت sporozoites و tachyzoites في الخلايا الظهارية المعوية (44). كما لوحظ وجود Tachyzoites داخل الخلايا المناعية المتسللة (43-45). يعد المحور الكيميائي CCL2 / CCR2 آلية محفوظة لتجنيد الخلايا الأحادية في الفئران والبشر (46). المستجيبات الطفيلي تيراغرام14-3-3 و تيراغراملقد ثبت أن WIP لتعزيز فرط الحركة في الخلايا التغصنية البشرية والفأرية المصابة (47 ، 48). لوحظ فرط حركة الخلايا المتغصنة في الجسم الحي ، مما يشير إلى أنها قد تكون آلية خفية تسهل انتشار الطفيلي مع تجنب الكشف عن طريق تعميم المؤثرات المناعية (49 ، 50).

العلاقة التطورية الطويلة بين T. جوندي ومضيفات الثدييات واضحة في تحليل المسارات التي تستخدمها الخلايا المصابة للكشف عن الطفيلي والقضاء عليه (39). تم وصف ثلاثة أذرع رئيسية للاستشعار المناعي الفطري في T. جوندي العدوى: المستقبلات الشبيهة بالرصد (TLRs) ، و GTPases المحرضة IFN ، والأمراض الالتهابية. تُعد إشارات مستقبل TLR و IL-1 (IL-1R) من خلال MyD88 وسيطًا مركزيًا لإفراز IL-12 والاستجابة الواقية من Th1 لـ T. جوندي (51). في الفئران المصابة داخل الصفاق T. جوندي، فإن البروفيلين البروتين الطفيلي يرتبط مباشرة وينشط TLR11 ، مما يساهم في إنتاج IL-12 وتقييد الطفيليات (52). ومع ذلك ، فإن البروفيلين عبارة عن بروتين معدّل للأكتين يتم عزله داخل الطفيليات وإشارات TLR11 من الأجزاء الداخلية ، مما يشير إلى أن هذا المسار قد يتم تنشيطه في الغالب عن طريق الطفيليات الملتهمة أو الميتة أو المختلة وظيفيًا (الشكل 1). تمشيا مع هذا النموذج ، بعد الإصابة بالفم ، كان لدى الفئران التي تعاني من نقص TLR11 عيوب طفيفة في استجابتها Th1 مقارنة بالفئران التي تعاني من نقص في MyD88 أو TLR2 و TLR4 و TLR9 ، ومع ذلك ، عالجت الفئران التي تعاني من نقص TLR11 بالمضادات الحيوية الفئران التي تعاني من نقص MyD88 (53 ، 54). تشير هذه البيانات إلى أن الجراثيم المتعايشة في الأمعاء يمكن أن تؤدي إلى استجابة مناعية واقية T. جوندي مستقلة عن التعرف على الطفيليات بواسطة TLR11. من الجدير بالملاحظة أن TLR11 البشري هو جين زائف ، يشير إلى آليات استشعار فطرية بديلة لاكتشاف وتدمير T. جوندي في الخلايا البشرية.

تأشير المناعة الفطرية وتأثير الطفيليات. T. جوندي ينمو داخل غشاء فجوي طفيلي (PVM) يحمي الطفيلي من أجهزة استشعار المناعة الخلوية ويتجنب الاندماج مع الأجزاء الداخلية التي تحتوي على مستقبلات تشبه Toll (TLRs). في الماوس ، يتعرف TLR11 تيراغرام البروفيلين ، وهو بروتين معدّل للأكتين يتم كشفه بمجرد موت الطفيليات أو تلفها. TLR11 هو جين زائف في البشر. تيراغراميمكن لـ GRA15 تعزيز الفسفرة NF-B المضيفة والانتقال النووي. في الفئران ، يعد تحفيز NF-B ضروريًا لتنظيم النسخ لمكونات الجسيمات الالتهابية NLRP1 و NLRP3 و IL-1 ، ومع ذلك ، يمكن أن تشتبك حيدات الإنسان في التهاب NLRP3 بشكل مستقل عن التحفيز المسبق لـ NF-B. لا تزال الآلية التفصيلية للتنشيط الالتهابي ، وقتل الطفيليات ، وموت الخلايا المضيفة بعيدة المنال ، لا سيما فيما يتعلق بتكامل الإشارة مع IFN-. تحفز إشارات IFN-انتقال STAT1 إلى النواة وتنظيم الجينات المستجيبة لـ IFN ، بما في ذلك GTPases المرتبطة بالمناعة (IRGs ، الماوس) وبروتينات ربط الغوانيلات (GBPs ، الإنسان والفأر) ، والتي تعمل على مهاجمة فجوة الطفيليات ، مما يؤدي إلى قتل الطفيليات وموت الخلايا المضيفة. في الخلايا البشرية ، يعتبر الجنيه الإسترليني 1 ضروريًا لهذه العملية ، مما يؤدي إلى تنشيط AIM2 لمسار موت الخلايا المبرمج البديل. النوع الأول من بروتينات الطفيل rhoptry ، تيراغراميمكن لـ ROP5 و 17 و 18 تفكيك وظيفة الفأر IRGa6 و IRGb6 في PVM ، مما يؤدي إلى تعطيل هجوم الجنيه الإسترليني وقتل الطفيليات. المستجيب الحبيبي كثيف الطفيل تيراغرامIST هو مثبط نووي لنسخ STAT1. تيراغرامROP16 هو كيناز يعمل على الفسفرة وينشط المضيف STAT3 و STAT6. تيراغراميؤثر EGGR على التعبير الجيني للمضيف من خلال التعديلات الوراثية فوق الجينية E2F3- و E2F4. في الخلايا الوحيدة المصابة والخلايا التغصنية (DCs) ، تيراغرامتعمل بروتينات WIP و14-3-3 على تعزيز حركة الخلايا ، وهي آلية مفترضة لانتشار الطفيلي داخل الخلايا في الجسم الحي.

يربط الجسيم الملتهب اكتشاف المكونات الميكروبية أو تلف الخلايا المرتبط بالعدوى بإفراز السيتوكينات لعائلة IL-1 وفي كثير من الأحيان موت الخلايا الالتهابية. في حين أن الاستجابة الالتهابية للبروتوزوا لم تُدرس جيدًا بالمقارنة مع مسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية ، فما هو معروف عن T. جوندي يقترح الاعتراف اختلافات كبيرة (55 ، 56). لقد ثبت أن مستشعرات الجسيمات الالتهابية NLRP1 (في الفئران) و NLRP3 (في الفئران والبشر) تعالج وتحرر IL-1β استجابةً لـ T. جوندي العدوى (الشكل 1 والمراجع 57-59). الفئران التي تعاني من نقص في NLRP3 و / أو caspase-1 و / أو caspase-11 لديها عبء طفيلي أعلى في الجسم الحي (57 ، 58 ، 60). ومع ذلك ، على عكس محفزات الجراثيم الالتهابية التي تمت دراستها بشكل أفضل (على سبيل المثال ، NLRP1 الأنثراكس الأنثراكس القاتل أو مسببات الأمراض البكتيرية التي تنشط NLRP3) ، لا يُلاحظ موت الخلايا المضيفة في الفئران أو الخلايا البشرية (57-59). على عكس البلاعم الفأرية ، يتم تنشيط الجسيم الملتهب NLRP3 في حيدات الإنسان بشكل مستقل عن مسار TLR عبر إشارات Syk و CARD9 وإطلاق IL-1β مستقل عن غازديرمين D المكون للمسام (59 ، 61-63). أسئلة مفتوحة في الآلية الجزيئية للاستجابة الالتهابية ل T. جوندي تشمل إشارات الطفيلي التي تنشط الجسيم الملتهب ، ولماذا لا يعمل الجحوظ ، وما إذا كان هذا نتيجة للتلاعب النشط بالطفيلي.

تشير البيانات الحديثة أيضًا إلى الحديث المتبادل بين الجسيم الملتهب و GTPases المحرضة لـ IFN ، وهو مسار يقوم بمسح الخلية للأغشية الأجنبية أو التالفة ويستهدفها لإزالة IFN-في اتجاه مجرى النهر. في الخلايا البشرية ، يترجم بروتين ربط الغوانيلات 1 (GBP1) لعائلة الدينامين الفائقة إلى PVM ، مما يؤدي إلى إطلاق الحمض النووي للطفيلي في العصارة الخلوية للخلية المضيفة ، حيث يتم اكتشافه بواسطة مستشعر الالتهاب AIM2 (الشكل 1 والمراجع 63 ، 64) . لأسباب لا تزال غير واضحة ، لم يتم تفعيل استجابة الجسيم الالتهابي الحركي بدلاً من ذلك ، يتم تنشيط مسار موت الخلايا المبرمج البديل لموت الخلايا المضيفة (63 ، 64). على عكس النظام البشري ، تعتمد الفئران على عائلة موسعة من p47 IRGs لاكتشاف فجوة الطفيلي في اتجاه مجرى IFN-. ينظم الماوس IRGM1 و IRGM3 التفاعل بين IRGa6 و IRGb6 و phospholipids في PVM (65). تم التورط في نطاق أوسع من الجنيه الاسترليني بالماوس T. جوندي ومع ذلك ، فإن آلية قتل الطفيليات وموت الخلايا المضيفة في خلايا الفئران غير معروفة (66 - 68). تم التأكيد على أهمية نظام IRG في إزالة الطفيليات من خلال ملاحظة أن الطفيليات من النوع الأول تعبر عن ثالوث من المؤثرات المفرزة ، بروتين rhoptry 5 (ROP5) ، ROP17 ، و ROP18 ، التي ترتبط وتعطل وظيفة GTPase في IRGa6 و IRGb6 ( 69 ، 70). هذا التثبيط هو آلية رئيسية لضراوة النوع المحدد ، حيث تعبر الطفيليات من النوع الثاني والثالث عن أليلات من Rop5 أو Rop18، على التوالي ، لا يمكن أن يخرب بشكل فعال هجوم قوات الحرس. على الرغم من إحراز تقدم هائل نحو تحديد فئات الإشارات المناعية الخلوية المستقلة استجابةً لذلك T. جوندي، يفتقر المجال إلى نموذج متكامل للاستشعار الذاتي للخلية عبر هذه المسارات لكل من الفئران والأنظمة البشرية ، لا سيما في أنواع الخلايا الأخرى غير الخلايا الليفية والوحيدات والبلاعم.

ت.جوندي يؤدي التعرف عن طريق أجهزة الاستشعار المناعية الفطرية إلى استجابة مناعية مستقطبة من النوع Th1 تعتمد على الخلايا التائية CD8 + والتي تكون ضرورية لبقاء العائل على قيد الحياة. هناك العديد من المراجعات الممتازة حول البيولوجيا المناعية للعدوى (7 ، 8 ، 71 ، 72) ، لذلك سنتطرق بإيجاز إلى جوانب الاستجابة المناعية الحادة الضرورية لتطور العدوى المزمنة. تموت الفئران التي تعاني من نقص في IL-12 و TNF-α و IFN-γ أو مسارات الإشارات الخاصة بها من فرط نمو الطفيلي في العدوى الحادة (73 - 76). يعد نقص IFN-γ و IL-12 نادرًا في البشر ولم يتم ربطه بزيادة القابلية للإصابة بداء المقوسات ، ومع ذلك ، فإن الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدات من IFNGR1- فشل المرضى الذين يعانون من نقص في التقييد T. جوندي بعد تحفيز IFN-مقارنةً بالضعم المتبرع بصحة جيدة (77 ، 78). الفئران التي تعاني من نقص في مسار IL-6 تفشل في تكوين استجابة واقية للخلايا البائية وتموت في العدوى المزمنة المبكرة (79). يلعب IL-10 والخلايا التائية التنظيمية دورًا مهمًا بنفس القدر في بقاء المضيف عن طريق الحد من حجم الاستجابة الالتهابية وتلف المتفرج (80-85).

عدد متزايد من T. جوندي تم تحديد المؤثرات التي يتم إفرازها في الخلية المضيفة للتحكم في الإشارات المناعية. يتم إطلاق هذه المؤثرات من العضيات الإفرازية المعروفة باسم rhoptries (ROP) والحبيبات الكثيفة (GRA) ، والعديد من المستجيبات متعددة الأشكال عبر السلالات وتلعب دورًا في الفوعة (الشكل 1). ينشط GRA15 NF-B ، وينشط GRA24 مسار p38 MAPK لتعزيز التعبير عن IL-12 و IL-18 ، وهما المنظمان الأوليان لتنشيط خلايا IFN-γ و T (86 ، 87). ROP16 عبارة عن سيرين ثريونين كيناز الذي يفسفر مباشرة STAT3 و STAT6 ويثبط إنتاج IL-12 ، والذي قد يكون متسقًا مع المفهوم القائل بأن ضبط الاستجابة المناعية ضروري لبقاء المضيف وانتقال الطفيليات (88 ، 89). ومع ذلك ، فإن المستجيب تيراغرامتم تحديد IST مؤخرًا كمثبط لإشارات مستقبلات IFN. تيراغرامIST binds STAT1 and forms an inhibitory complex with the nucleosome remodeling deacetylase (Mi-2/NuRD) complex. This suppresses transcription of IRF1-dependent cytokines, MHC class II expression and antigen presentation, and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression, which kills parasites by producing reactive nitrogen species ( 90 , 91 ). بصورة مماثلة، TgTEEGR interacts with E2F3 and E2F4 transcription factors, and forms a nuclear complex with a catalytic subunit of polycomb repressor complex to block NF-κB–mediated expression of proinflammatory cytokines like IL-1β and IL-6 ( 92 ). These effectors are among 200–300 predicted secreted effector proteins in the parasite genome, the majority of which have not been characterized, particularly in the context of chronic infection.

In chronic infection, the central nervous system contains the highest frequency of parasites per gram of tissue. The potential implications of neural infection for host behavior and homeostasis have led to great interest in understanding the biology of T. gondii infection in the brain. Our understanding of chronic central nervous system infection is almost exclusively based on murine models of infection. There are many open questions, beginning with how the parasite traverses the blood-brain barrier (BBB). Using intravital microscopy, T. gondii has been imaged replicating within brain endothelial cells and then directly entering the brain ( 93 ). Mice infected intravenously with the T. gondii RH strain had a higher brain parasite load than mice infected with the CPS strain, which cannot replicate in vivo, suggesting that T. gondii growth within vascular endothelial cells may be an important stopover before direct entry into the brain (Figure 2A and ref. 93 ). Perfusion of Evans blue dye shows increased BBB permeability during chronic T. gondii infection, accompanied by reduced blood flow and capillary rarefication which may permit immune cell entry into the brain ( 94 ). Using intravital microscopy, CCR2 + monocytes are found to accumulate, exhibiting rolling and cradling behavior at the BBB ( 95 ). This observation, coupled with the high frequency of infection of dendritic cells and their hypermotility phenotype, has led to the Trojan horse hypothesis: that parasites traverse the BBB within immune cells (Figure 2A and refs. 49 , 96 ). Although direct evidence for this model is lacking, antibody depletion of CD11b + leukocytes correlated with reduced brain parasite load and adoptive transfer of T. gondii–infected CD11c + or CD11b + cells into naive mice led to neural infection ( 97 ).

T. gondii entry and control of persistent infection in the brain. (أ) In acute infection, T. gondii is frequently observed in immune cells, including monocytes and dendritic cells, with hypermigratory behavior. During infection, blood-brain barrier (BBB) permeability increases and monocytes accumulate in the endothelial lumen, interacting with endothelial cells. These observations have led to the hypothesis that migratory immune cells deliver T. gondii to the BBB and, perhaps, smuggle them into the brain. Replicating parasites are also observed in brain endothelial cells, whose subsequent lysis may be a mechanism of T. gondii entry into the brain. (ب) During acute infection parasites are observed infecting neurons, astrocytes, microglia, and infiltrating immune cells. Astrocytes and microglia as well as peripheral monocytes can clear parasites with cell-autonomous immune pathways. (ج) As chronic infection progresses, infected astrocytes and microglia or the parasites within them are cleared and cysts are primarily observed within neurons. Most parasite cysts are not associated with immune infiltrate however, individual parasites or parasite debris can be observed colocalizing with immune infiltrate.

Analysis of mouse brain sections and an extremely limited number of healthy human brain samples indicates that most intracellular cysts are not associated with immune infiltration ( 98 ). However, within the same brain section, inflammatory foci can be observed containing parasites or parasite debris, activated microglia, macrophages, and T cells ( 99 ). Depleting IFN-γ or CD4 + and CD8 + T cells leads to parasite recrudescence ( 100 ). Taken together these data suggest that intracellular cysts are relatively immunologically silent however, cysts that lyse (spontaneously or through recrudescence) are recognized and quickly contained by infiltrating immune cells (Figure 2C).

Experiments using parasites engineered to secrete Cre recombinase in Cre reporter mice have demonstrated that neurons are the major cell type interacting with the parasite in the brain, although T cells, monocytes or macrophages, microglia, and astrocytes are reporter-positive early in brain infection (Figure 2B and refs. 101 – 103 ). These data also suggest that rather than having a tropism for neurons, T. gondii is cleared from non-neuronal cell types in the brain. Consistent with this model, disabling the IFN-γ signaling in mouse astrocytes by knocking out the transcription factor STAT1 led to greater incidence of cysts within astrocytes ( 104 ) and IFN-γ depletion increased the percentage of infected astrocytes ( 102 ). Subsequently, the ability of mouse astrocytes to restrict T. gondii growth in response to IFN-γ was shown to depend on IRGM3 (IGTP), not iNOS IRGM3 and IRGa6 disrupted the PVM and, in one study, led to parasite egress ( 105 – 107 ). In human astrocytes, IL-1β in combination with IFN-γ induced iNOS-dependent killing of T. gondii ( 108 ), whereas TNF- and IFN-γ limited T. gondii growth by tryptophan starvation via upregulated indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) ( 109 ). The parasite effector TgGRA15 has been shown to limit IDO-mediated parasite restriction in cultured glioblastoma and neuroblastoma cell lines ( 110 ). IFN-γ in combination with TNF-α or LPS has also been shown to activate parasite killing functions of human and murine microglia through iNOS-dependent and -independent mechanisms ( 111 – 113 ). Microglia can also produce IFN-γ and TNF-α, which are critical for central nervous system restriction of the infection ( 114 ) IFN-γ, in particular, has been shown to induce adhesion molecule expression on vascular endothelial cells and promote the expression of CXCL9, CXCL10, and CCL5, which recruit peripheral immune cells to the brain ( 115 , 116 ). Most of these data are from in vitro experiments, and better tools to study microglia and astrocyte function in vivo will be important to clarify which pathways control central nervous system infection.

While brain-resident immune cells contribute to T. gondii restriction, the role of cell-autonomous immunity in neurons is less clear. A recent study using OVA-expressing parasites and conditional MHC class I–deficient mice demonstrated that neurons can present T. gondii–derived antigens to initiate a CD8 + T cell response ( 117 ) however, whether endogenous parasite epitopes are efficiently presented on neurons is yet to be examined. Brain-infiltrating CD8 + T cells have been shown to control cyst burden indirectly through IFN-γ secretion, and, to a lesser extent, via perforin-dependent killing of infected cells ( 118 – 120 ). It is notable that perforin has been shown to trigger parasite egress in vitro, suggesting that perforin may limit parasite growth but other cells are responsible for parasite killing, potentially through cell-autonomous immunity ( 121 ). A minimal reliance on perforin-mediated T. gondii clearance also fits a model wherein cellular cytotoxicity should be limited in the brain to promote survival of neurons, which have an extremely limited regenerative capacity.

Currently there are no therapeutic tools that effectively target bradyzoite cysts and sterilize chronic infection. Our understanding of bradyzoite biology is weaker than our understanding of tachyzoite biology. This is linked to long-standing technical challenges associated with genetic manipulation of bradyzoite-specific genes that are required to perform “necessary and sufficient” experiments. However, the recent bloom in CRISPR/Cas9 tools has led to gains in this arena ( 122 , 123 ).

The transition between tachyzoite and bradyzoite has commonly been referred to as “switching” however, recent studies suggest that stage conversion is a continuum under epigenetic and transcriptional regulation rather than a finite life stage. Bradyzoite polarization can be induced by cell stressors including alkaline media, heat shock, and oxidative stress (refs. 124 – 126 and Figure 3). IFN-γ treatment has been shown to induce bradyzoite gene expression in infected macrophages but not fibroblasts, suggesting that cell type–specific differentiation signals may also exist ( 127 ). Compared with fibroblasts, infected neuronal or skeletal muscle cells support a stronger expression of bradyzoite markers and a higher frequency of cyst development ( 128 ). It is worth noting that neurons and muscle cell types are historically difficult to culture, suggesting that cell stress signals may be relevant to bradyzoite development in these models. However, terminally differentiated myotubes are reported to support a higher frequency of bradyzoites compared with dividing myoblast progenitor cells, suggesting that cell cycle may provide developmental cues for the parasite development as well ( 129 ).

Environmental and host cell–specific pressures driving the T. gondiitachyzoite to bradyzoite transition. Left: T. gondii tachyzoites can invade almost any nucleated host cell type and grow within the PVM formed from host plasma membrane. في المختبر, a range of tissue culture stress conditions can upregulate bradyzoite-specific genes. As parasites polarize to a bradyzoite transcriptional profile, they synthesize a heavily glycosylated cyst wall beneath the PVM. The frequency and rate of bradyzoite differentiation are also influenced by the host cell type, cell cycle status, the host cell lifespan, and inflammatory signals in vitro. In vivo, cysts are most frequently observed in neurons, cardiac muscle, skeletal muscle, and retinal pigment epithelial cells. If the host is immune-suppressed, parasites shift toward a replicative tachyzoite form in a process referred to as recrudescence, which is associated with tissue damage, particularly in the eye.

Although the precise signals are unclear, histone methylation and acetylation are important epigenetic regulators of bradyzoite differentiation. Treating tachyzoites with arginine methyltransferase inhibitor, AMI-I, induces a reduction of histone H3R17 methylation and bradyzoite differentiation in vitro ( 130 ). ال T. gondii histone acetyltransferase TgGCN5a is enriched at promoter regions of bradyzoite-specific genes, and TgGCN5a-deficient parasites fail to upregulate the bradyzoite markers Bag1 و Ldh2 under stress ( 131 ). Treating infected cells with the histone deacetylase inhibitor FR235222 induces bradyzoite differentiation through inhibiting TgHDAC3 ( 132 ). Phosphorylation of the T. gondii eukaryotic initiation factor 2 α subunit (TgeIF2α) is enhanced under stress conditions and is necessary for bradyzoite differentiation ( 133 ). Guanabenz, an eIF2α dephosphorylation inhibitor, has been shown to impair tachyzoite proliferation and promote bradyzoite differentiation in vitro ( 134 ).

The ApiAP2 family of transcription factors are emerging as central regulators of bradyzoite differentiation. This family consists of 67 genes, many of which are associated with bradyzoite stage–specific expression. Specifically, AP2XI-4– and AP2IV-3–knockout parasites have reduced expression of bradyzoite-specific genes after in vitro switch and AP2XI-4–null T. gondii forms fewer cysts in mice ( 135 , 136 ). AP2IV-4 knockouts express some bradyzoite-specific genes under tachyzoite culture, but had fewer brain cysts in mice ( 137 ). Using a CRISPR/Cas9 guide RNA library targeting mostly AP2 domain–containing proteins and predicted nucleic acid–binding proteins, bradyzoite formation deficient 1 (BFD1), a Myb-like transcription factor, was recently identified as a key regulator of bradyzoite differentiation in vitro and in vivo in mice. ومن المثير للاهتمام، Bfd1 mRNA is expressed in tachyzoites however, protein expression is only induced by stress conditions ( 138 ). It remains to be seen whether immunosuppression induces any parasite recrudescence in mice infected with BFD1-deficient parasites and how BFD1- and AP2-family proteins coordinate bradyzoite differentiation.

T.gondii bradyzoite cysts are often defined by formation of a cyst wall consisting of heavily glycosylated proteins underneath the PVM ( 139 ). The cyst wall is essential for transmission, protecting the parasite from gastric proteases and the low pH of the stomach. Parasites deficient in the cyst wall–localized bradyzoite pseudokinase 1 (BPK1) were more sensitive to pepsin digestion and less orally infectious than WT parasites ( 140 ). Parasites that were rendered genetically deficient in cyst glycoproteins, including loss of the nucleotide-sugar transporter TgNST1 or the heavily glycosylated cyst wall protein TgCST1, have defects in cyst number, cyst stability, and infectivity during oral infection ( 141 – 143 ). The cyst wall may also protect bradyzoites from enzymatic attack during chronic infection. The Wilson laboratory demonstrated that chitinase-expressing, alternatively activated (M2) macrophages were able to recognize and degrade chitin-like polysaccharides in the cyst wall ( 144 ). Consistent with this observation, a GWAS identified single-nucleotide polymorphisms in the intergenic region of the human CHIA locus, which expresses chitinase, that were significantly associated with T. gondii infection ( 145 ).

T.gondii infection is the most frequent cause of posterior uveitis, also referred to as chorioretinitis or inflammation of the retina and choroid (pigmented vascular coat of the eye) ( 30 ). This is one area of T. gondii infection that has been more extensively studied in patients than in animal models, which have been limited until recently. Type II strains, most frequently associated with infection in Europe and North America, are associated with chorioretinitis ( 146 , 147 ). Historically, ocular toxoplasmosis was associated with congenital infection however, rates of disease associated with postnatal infection are rising and associated with new T. gondii strains ( 148 ). Over 70% of patients presenting with acute ocular toxoplasmosis already have ocular scars, suggesting that disease progression is driven by the inflammatory response to recrudescent T. gondii leading to the accumulation of tissue damage over time ( 149 ). Immune-competent individuals are able to control ocular infection, but early antiparasitic treatment is critical to limit the extent of retinal damage ( 150 ). Human retinal vascular endothelial cells are more sensitive to infection than other endothelial cell types, suggesting a potential mechanism of entry into the eye ( 151 ). T. gondii cysts have been observed in retinal pigmented epithelial cells ( 152 ). In a mouse model of ocular toxoplasmosis, retinal pigment epithelial cells and infiltrating immune cells expressed the T cell inhibitory ligand PD-L1 ( 153 ). This may be an important mechanism to limit tissue pathology, although the parasites may exploit this axis for persistence. IFN-γ and IL-6, which are both critical in restricting systematic parasitemia ( 79 , 100 ), were elevated in the vitreous humor of mice with ocular lesions. However, intraocular injection of an IFN-γ–blocking antibody impaired parasite control and worsened tissue damage, while, perhaps counterintuitively, injection of an IL-6–blocking antibody improved parasite control and minimized ocular damage ( 154 – 156 ). Patients infected with virulent South American haplotypes of T. gondii, which have been associated with aggressive chorioretinitis, had less IFN-γ and IL-17 but higher IL-13 and IL-6 levels in the eye compared with European patients infected with virulent type I ( 157 ). However, it is currently not clear whether these differences in immune regulation control ocular disease severity.

In mice and rats, infection with T. gondii leads to a well-established loss of innate aversion behavior to felines, which has been proposed to benefit the parasite by facilitating transmission via predation ( 11 , 158 , 159 ). Whether these behavioral phenotypes are driven by specific changes in neural activity or a more general effect of inflammation is an open question. The observation that T. gondii expresses two aromatic amino acid hydrolases that produce l -DOPA, AAH1, and AAH2 led to the hypothesis that the parasite could modulate dopaminergic neuron function. However, deletion of AAH2 failed to alter brain dopamine levels, neuroinflammation, or behavioral alterations in T. gondii–infected mice ( 160 , 161 ), although these genes are necessary for oocyst development in the cat ( 162 ). Notably, mice infected with an avirulent mutant of type I T. gondii or the related organism Neospora caninum, which are cleared before establishing chronic infection, exhibit loss of aversion behavior even though chronic infection is not sustained ( 163 ). These data suggest that acute inflammation may be sufficient to trigger sustained behavioral changes, although the molecular bases for behavioral changes in T. gondii infection are unclear. Recently, the olfactory GPCR trace amine-associated receptor 4 (TAAR4) was shown to recognize 2-phenylethylamine, a metabolite enriched in urine of predators, including feline species. There is no homolog of TAAR4 in humans, but mice deficient in TAAR4 do not engage in avoidance behavior to bobcat and mountain lion urine ( 164 ). That the olfactory neurons expressing TAAR4 are altered or damaged during T. gondii infection is a compelling hypothesis that remains to be tested.

Sustained interaction with the immune system is a hallmark of T. gondii infection: throughout chronic infection humans and mice have high titers of T. gondii–specific IgG and sera cytokines. There is growing evidence that T. gondii infection is associated with cachexia in mice, an immune-metabolic disease of sustained muscle wasting. Cachexia positively correlates with parasite load and inflammation severity however, hypermetabolic weight loss cannot be rescued by diet supplementation ( 13 , 165 – 167 ). In oral infection, intestinal barrier inflammation resolves during chronic infection, but commensal dysbiosis does not ( 14 , 168 ) however, dysbiosis is not sufficient for cachexia, as uninfected cage mates experienced a similar microbial shift but did not develop cachexia ( 14 ). Chronically infected mice have sustained changes in splenic and lymph node architecture and are more susceptible to acute viral challenge ( 169 ). Moreover, cachectic mice were more susceptible to LPS challenge than mice that recovered weight ( 170 ). Recently, mice deficient in the IL-1R axis were shown to recover from acute cachectic weight loss, although chronic parasite burden was similar to that in wild-type mice ( 171 ). A study from the Wohlfert laboratory showed that infection-induced myositis could be reversed by depletion of regulatory T cells, which were enriched in skeletal muscle ( 172 ). Parasite biology that promotes behavior modification and cachexia in rodent hosts may provide a selective advantage to T. gondii by increasing the likelihood of predation and transmission to feline hosts. It is important to note that there is currently no evidence of cachexia in immune-competent humans with chronic T. gondii infection. However, cachexia is a predictor of mortality in almost every chronic human disease with limited experimental tools to probe sustained disease. The interaction between T. gondii and mice is proving an informative model to understand the pathophysiology of cachexia, which can be applied to understand other disease settings.

T.gondii’s ability to establish a persistent chronic infection is essential for parasite transmission. However, there is much to learn about this stage of infection in animal and human hosts. Deep sequencing has unraveled a far greater diversity in T. gondii gene assortment than originally thought, which has opened the door to understanding how parasite genetics influences pathology associated with chronic infection. CRISPR/Cas9 tools are expanding our ability to manipulate the T. gondii genome to understand how gene expression in bradyzoites controls differentiation, cyst stability, and oral infectivity of the parasite. Bradyzoite biology is intimately linked to the immune response during chronic infection. The coming decades will likely reveal mechanisms of cell-autonomous immunity to chronic T. gondii infection in the brain and other chronically infected tissues, as well as reveal the costs of the chronic inflammatory response for host homeostasis. A better understanding of this biology is needed to develop therapeutic strategies that effectively target bradyzoite cysts. Given the long evolutionary relationship between mammalian hosts and T. gondii, such studies are likely to discover important information about the regulation of immune functions during chronic inflammation more broadly.

تضارب المصالح: أعلن الكتاب أنه لا يوجد تضارب في المصالح.


المواد والأساليب

Antibodies and reagents

Antibodies used were: mouse anti-Flag mAb (Sigma), mouse anti-GFP mAb (Roche), goat anti-GST pAb (GE Healthcare), mouse anti-GluGlu mAb (Hiss Diagnostics), rabbit anti-14-3-3 pAb (K19), mouse anti-14-3-3 mAb (H8), rabbit anti-GFP pAb (FL) and mouse anti-Rho mAb (26C4) (Santa Cruz Biotechnology), mouse anti-DLC1 mAb (BD), mouse anti-α-tubulin mAb (Sigma). Mouse anti-Myc mAb, clone 9E10, and mouse anti-HA mAb, clone 12CA5, were kindly provided by Heiner Böttinger (University of Stuttgart, Germany). HRP-labeled secondary anti-mouse and anti-rabbit IgG antibodies were from Amersham, HRP-labeled secondary anti-goat IgG antibody was from Santa Cruz Biotechnology alkaline-phosphatase-labeled secondary anti-goat IgG antibody was from Sigma Alexa Fluor 546-labeled secondary anti-mouse IgG antibody was from Molecular Probes. Staurosporine and okadaic acid were from Alexis Gö6983, Gö6976, PDBu and doxycycline were from Calbiochem, and LMB was from Biomol.

DNA constructs

pCS2+MT-DLC1 encoding Myc-tagged DLC1 was kindly provided by Irene Ng (The University of Hong Kong, China). Full-length DLC1 cDNA was amplified by PCR using pCS2+MT-DLC1 as a template with primers containing BamHI restriction sites (DLC1-for, 5′-cgcggatcc tgcagaaagaagccggaccc-3′ and DLC1-rev, 5′-cgcggatcctcacctagatttggtgtctttgg-3′) and cloned into Flag-pEFrPGKpuro, pEGFPC1, and pcDNA5/FRT/TO-GFP (see below) vectors. Truncated DLC1 variants were generated by PCR amplification using the following primers: DLC1-ΔSAM (5′-cgcggatccattagtcctcatcggaaacgaag-3′ and DLC1-rev) DLC1-ΔStart (DLC1-for and 5′-cgcggatcctcacaggtgcccgagtgcttc-3′) DLC1-ΔC (DLC1-for and 5′-cgcggatcctcacatgaacttgggcacggcc-3′) DLC-ΔN (5′-cgcggatccaagaggatcaaggttccagac-3′ and DLC1-rev). DLC1 point mutants were generated by QuikChange site-directed PCR mutagenesis according to the manufacturer's instructions (Stratagene). The forward primers used were: S236A-for (5′-gctgaaacggatggaggccctgaagctcaagagc-3′) S327A-for (5′-gttacgaggacccgggccctcagtgcgtgc-3′) S419A-for (5′-cctcaggagggaaaacgctagcgacagccccaagg-3′) S431A-for (5′-ctgaagagacgcaatgcttccagctccatgagc-3′) R415/416G-for (5′-gccacatcagcctcgggggggaaaacagtagcg-3′) R428/429G-for (5′-cccaaggaactgaagggaggcaattcttccagctcc-3′). To generate the inducible DLC1 expression vector pcDNA5/FRT/TO-GFP-DLC1, the enhanced GFP cDNA was excised from the pEGFPC1 vector with Eco47III and KspA1 and ligated with pcDNA5/FRT/TO digested with MssI. The DLC1 cDNA was then inserted in frame as a BamHI fragment. All amplified cDNAs were verified by sequencing. Oligonucleotides were purchased from MWG Biotech. pEGFPN1-PKD1, pGEX-14-3-3τ WT and R56/60, HA-tagged 14-3-3τ and EE-tagged 14-3-3γ and ζ in pEF vectors have been described previously (Hausser et al., 2005 Hausser et al., 2006 Olayioye et al., 2003). pGEX-DLC1(aa242-569)-WT, pGEX-DLC1-S327/431A and pGEX-DLC1-S327/419/431A constructs were generated by subcloning of Ecl136II fragments from the respective full-length constructs into the pGEX6P1 vector linearized with SmaI.

Cell culture and transfection

HEK293T, COS7, MCF7 and MDAMB231 cells were grown in RPMI containing 10% FCS in a humidified atmosphere containing 5% CO2. HEK293T cells were transfected using TransIT293 reagent (Mirus). For immunofluorescence, MCF7 and COS7 cells were grown on glass coverslips and transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Flp-In T-Rex HEK293 cells (Invitrogen) were grown in DMEM containing 10% FCS, 100 μg/ml zeocin and 15 μg/ml blasticidin. These cells stably express the Tet repressor and contain a single Flp Recombination Target (FRT) site and were used to generate the Flp-In-DLC1 line. Cells were cotransfected with pcDNA5/FRT/TO-GFP-DLC1 and the Flp recombinase expression plasmid pOG44 at a ratio of 1:10 and then selected with 100 μg/ml hygromycin. Stable MCF7 lines were generated by transfection of vectors encoding Flag-tagged DLC1 wild type and S327/431, or empty vector as a control, followed by selection with 1.5 μg/ml puromycin for 10 days.

Immunofluorescence microscopy

Cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 minutes, washed and incubated with PBS containing 0.1 M glycine for 15 minutes. Cells were permeabilized with PBS containing 0.1% Triton for 5 minutes and blocked with 5% goat serum in PBS containing 0.1% Tween-20 for 30 minutes. Cells were then incubated with primary antibody diluted in blocking buffer for 2 hours, followed by incubation with secondary antibody diluted in blocking buffer for 1 hour. Coverslips were mounted in Fluoromount G (Southern Biotechnology) and analyzed on a confocal laser-scanning microscope (TCS SL, Leica) using 488 nm and 543 nm excitation and a 40.0/1.25 HCX PL APO objective lens.

Bacterial expression of GST proteins

بكتريا قولونية were transformed with pGEX vectors encoding GST-14-3-3 proteins, DLC1(aa 242-569) variants or GST alone and expression was induced with 0.1 mM IPTG for 4 hours at 37°C. The bacterial cultures were harvested and pellets were resuspended in PBS containing Complete protease inhibitors (Roche). The suspension was then sonicated 3× for 10 seconds on ice, Triton X-100 was added to a final concentration of 1% and the lysate centrifuged for 10 minutes at 8000 ز. Purification of GST-tagged proteins was performed with glutathione resin (GE Healthcare). The resin was washed with PBS and the purity and amount of bound GST proteins was then determined by SDS-PAGE and Coomassie blue staining.

Pull-downs, immunoprecipitation and western blotting

Whole-cell extracts were obtained by solubilizing cells in Triton X-100 extraction buffer (TEB) (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM sodium orthovanadate, 10 mM sodium fluoride, and 20 mM β-glycerophosphate plus Complete protease inhibitors). Lysates were clarified by centrifugation at 16,000 ز for 10 minutes. Pull-downs were performed by incubating whole-cell extracts with immobilized GST proteins for 2 hours. Beads were washed three times with TEB. For immunoprecipitations, equal amounts of protein were incubated with specific antibodies for 2 hours on ice. Immune complexes were collected with protein-G-Sepharose (GE Healthcare) and washed three times with TEB. In the case of stably expressed Flag-DLC1, precipitation was overnight and washes were with TEB containing 0.5% Triton X-100. Precipitated proteins were released by boiling in sample buffer, subjected to SDS-PAGE and blotted onto PVDF membranes (Roth). After blocking with 0.5% blocking reagent (Roche) in PBS containing 0.1% Tween 20, filters were probed with specific antibodies. Proteins were visualized with HRP-coupled secondary antibody using the ECL detection system (Pierce) or alkaline phosphatase-coupled secondary antibody and NBT/BCIP as a substrate.

Kinase assays

Equal amounts of the purified GST-DLC1(aa242-569) proteins were mixed with kinase buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT) containing 2 μCi [γ- 32 P]ATP and incubated for 5 minutes at 37°C in the presence or absence of 50 ng purified Myc-PKD1 (Dieterich et al., 1996). Samples were then resolved by SDS-PAGE, transferred to membrane and analyzed on a PhosphoImager (Molecular Dynamics), followed by immunoblotting.

Luciferase reporter assays

HEK293 Flp-In-DLC1 cells were grown on collagen-coated 24-well dishes and transfected with 50 ng each of the 3DA.Luc firefly luciferase reporter containing three SRF binding elements, pRL-TK, a Renilla luciferase plasmid under the control of the thymidine kinase promoter, and pEF-HA-14-3-3τ. After serum starvation overnight, DLC1 expression was switched on by addition of 10 ng/ml doxycycline and, 4 hours later, cells were stimulated with 100 nM PDBu for 4 hours. Cells were lysed with 300 μl passive lysis buffer (Promega) and luciferase activities in 10 μl lysate were measured by addition of 50 μl firefly substrate (470 μM D-luciferin, 530 μM ATP, 270 μM coenzyme A, 33 mM DTT, 20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, pH 7.8), followed by addition of 100 μl Renilla substrate (0.7 μM coelenterazine, 2.2 mM Na2EDTA, 0.44 mg/ml bovine serum albumin, 1.1 M NaCl, 1.3 mM NaN3, 0.22 M potassium phosphate buffer, pH 5.0). Luminescence was measured with a Tecan Infinite 200M plate reader.

Rho activity measurements

HEK293T cells transiently expressing the Raichu-RhoA biosensor were lysed in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium fluoride and 0.5% Triton X-100 and debris was removed by centrifugation at 16,000 ز for 10 minutes. Emission ratios (FRET/CFP) were determined by measuring CFP and YFP fluorescence after background subtraction at 475 and 530 nm, respectively, using a Tecan Infinite 200M plate reader (excitation, 433 nm).

MTT assays

Approximately 2000 cells in 150 μl medium were plated into 96-well plates (ن=5) and incubated with 15 μl of 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl-)2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) solution (5 mg/ml) for 2 hours. Cells were lysed in 100 μl 50% dimethylformamide containing 10% SDS and absorbance at 595 nm was determined with background subtraction at 655 nm and absorbance of medium alone using a SpectraMax 340PC 384 reader (Molecular Devices).


Phosphoproteomics combined with quantitative 14-3-3-affinity capture identifies SIRT1 and RAI as novel regulators of cytosolic double-stranded RNA recognition pathway

N1 - Copyright © 2014, The American Society for Biochemistry and Molecular Biology.

N2 - Viral double-stranded RNA (dsRNA) is the most important viral structure recognized by cytosolic pattern-recognition receptors of the innate immune system, and its recognition results in the activation of signaling cascades that stimulate the production of antiviral cytokines and apoptosis of infected cells. 14-3-3 proteins are ubiquitously expressed regulatory molecules that participate in a variety of cellular processes, and 14-3-3 protein-mediated signaling pathways are activated by cytoplasmic dsRNA in human keratinocytes. However, the functional role of 14-3-3 protein-mediated interactions during viral dsRNA stimulation has remained uncharacterized. Here, we used functional proteomics to identify proteins whose phosphorylation and interaction with 14-3-3 is modulated by dsRNA and to characterize the signaling pathways activated during cytosolic dsRNA-induced innate immune response in human HaCaT keratinocytes. Phosphoproteome analysis showed that several MAPK- and immune-response-related signaling pathways were activated after dsRNA stimulation. Interactome analysis identified RelAassociated inhibitor, high-mobility group proteins, and several proteins associated with host responses to viral infection as novel 14-3-3 target proteins. Functional studies showed that RelA-associated inhibitor regulated dsRNA-induced apoptosis and TNF production. Integrated network analyses of proteomic data revealed that sirtuin1 was a central molecule regulated by 14-3-3s during dsRNA stimulation. Further experiments showed that sirtuin 1 negatively regulated dsRNA-induced NF?B transcriptional activity, suppressed expression of antiviral cytokines, and protected cells from apoptosis in dsRNA-stimulated and encephalomyocar-ditis-virus-infected keratinocytes. In conclusion, our data highlight the importance of 14-3-3 proteins in antiviral responses and identify RelA-associated inhibitor and sirtuin 1 as novel regulators of antiviral innate immune responses.

AB - Viral double-stranded RNA (dsRNA) is the most important viral structure recognized by cytosolic pattern-recognition receptors of the innate immune system, and its recognition results in the activation of signaling cascades that stimulate the production of antiviral cytokines and apoptosis of infected cells. 14-3-3 proteins are ubiquitously expressed regulatory molecules that participate in a variety of cellular processes, and 14-3-3 protein-mediated signaling pathways are activated by cytoplasmic dsRNA in human keratinocytes. However, the functional role of 14-3-3 protein-mediated interactions during viral dsRNA stimulation has remained uncharacterized. Here, we used functional proteomics to identify proteins whose phosphorylation and interaction with 14-3-3 is modulated by dsRNA and to characterize the signaling pathways activated during cytosolic dsRNA-induced innate immune response in human HaCaT keratinocytes. Phosphoproteome analysis showed that several MAPK- and immune-response-related signaling pathways were activated after dsRNA stimulation. Interactome analysis identified RelAassociated inhibitor, high-mobility group proteins, and several proteins associated with host responses to viral infection as novel 14-3-3 target proteins. Functional studies showed that RelA-associated inhibitor regulated dsRNA-induced apoptosis and TNF production. Integrated network analyses of proteomic data revealed that sirtuin1 was a central molecule regulated by 14-3-3s during dsRNA stimulation. Further experiments showed that sirtuin 1 negatively regulated dsRNA-induced NF?B transcriptional activity, suppressed expression of antiviral cytokines, and protected cells from apoptosis in dsRNA-stimulated and encephalomyocar-ditis-virus-infected keratinocytes. In conclusion, our data highlight the importance of 14-3-3 proteins in antiviral responses and identify RelA-associated inhibitor and sirtuin 1 as novel regulators of antiviral innate immune responses.


Construction of arabinose inducible ExoS derivatives and infection of cells

To ensure protein stability of ExoS derivatives, mutant alleles were coexpressed with orf1, encoding the cognate nonsecreted chaperone of ExoS [ [38, 42] ]. In all cases, DNA was amplified by PCR using conditions described previously [ [43] ]. pMF366 was constructed from amplified DNA from pTS103 [ [38] ] harbouring wild-type orf1, which was cloned into the NcoI/XhoI (shown in italic type) sites of pBAD/Myc-His under the control of an arabinose inducible promoter using the orf1 specific primers porf1a (forward): 5′-GCCGCCTCCATGGACTCGGAACACGCC-3′ and porf1b (reverse): 5′-TCGCCCGACTCGAGTCAGCGTAGCTCTTC-3′. Wild-type exoS sequence was cloned into the XhoI/KpnI (shown in italic type) sites of pMF366 to generate the plasmid pMF384, using DNA amplified from pTS103 with the exoS specific primer pair pexoSa (forward): 5′-CGGAGAAACTCGAGGAGAAGGCAACCATC-3′, pexoSb (reverse): 5′-GTCTTTCTGGTACCACCGGTCAGGCCAGA-3′. pMF419 and pMF420 were obtained by replacing the C-terminal ClaI/KpnI fragment from pMF384 with DNA amplified and restriction enzyme cut with ClaI/KpnI from pGEX-2TK-ExoS(SΔ) and pGEX-2TK-ExoS (S3), respectively, using the exoS specific primers, pexoSseq3 (position 973–991 forward): 5′-AAGTGATGGCGCTTGGTCT-3′ and pexoSd (reverse): 5′-ATGCATGGTACCTCAGGCCAGATCAAGGCCGCG-3′. All constructs were confirmed by sequence analysis. Stable induction of protein expression in strains grown in the presence of 0.02% l (+) arabinose was confirmed by Western analysis as described previously [ [44] ], using polyclonal rabbit anti-ExoS [ [38] ]. Bacterial infection of cells was performed in the presence of 0.1% l (+)arabinose as described previously [ [45] ].


Phosphorylation-related modification at the dimer interface of 14-3-3ω dramatically alters monomer interaction dynamics

14-3-3 proteins are generally believed to function as dimers in a broad range of eukaryotic signaling pathways. The consequences of altering dimer stability are not fully understood. Phosphorylation at Ser58 in the dimer interface of mammalian 14-3-3 isoforms has been reported to destabilise dimers. An equivalent residue, Ser62, is present across most Arabidopsis isoforms but the effects of phosphorylation have not been studied in plants. Here, we assessed the effects of phosphorylation at the dimer interface of Arabidopsis 14-3-3ω. Protein kinase A phosphorylated 14-3-3ω at Ser62 and also at a previously unreported residue, Ser67, resulting in a monomer-sized band on native-PAGE. Phosphorylation at Ser62 alone, or with additional Ser67 phosphorylation, was investigated using phosphomimetic versions of 14-3-3ω. In electrophoretic and chromatographic analyses, these mutants showed mobilities intermediate between dimers and monomers. Mobility was increased by detergents, by reducing protein concentration, or by increasing pH or temperature. Urea gradient gels showed complex structural transitions associated with alterations of dimer stability, including a previously unreported 14-3-3 aggregation phenomenon. Overall, our analyses showed that dimer interface modifications such as phosphorylation reduce dimer stability, dramatically affecting the monomer-dimer equilibrium and denaturation trajectory. These findings may have dramatic implications for 14-3-3 structure and function in vivo.

Keywords: 14-3-3 Protein Dimerisation Dynamic equilibrium Monomer Phosphomimetic mutation Phosphorylation.


Bacterial Pathogenesis

Pathogenesis is defined as the origination and development of a disease. Insights into disease etiology and progression, the two major aspects of pathogenesis, are paramount in the prevention, management and treatment of various diseases. In many cases the mechanical properties of the tissue or cellular environment contribute to disease progression or its onset, and this is also true in diseases arising from bacterial infection. For instance, the ability of a bacteria to invade a cell or tissue, to establish an infection within the body and to avoid or even exploit the immune response is often dependent on the bacteria&rsquos ability to manipulate the host cytoskeleton, and exploit various biochemical pathways that respond to changes in mechanical stimuli.

The mechanobiology of infection and bacterial pathogenesis

During an infection, an external virulent agent like bacteria, virus or fungi, invades into body tissues and proliferates, causing disease. These pathogens employ multiple mechanisms of invasion, evasion of host immune responses and survival or replication within the host. While some molecular mechanisms may be unique to a particular pathogen, some may be conserved across species. A component of the host cell that is modulated by pathogens, both extracellular and intracellular, is the plasma membrane , being the first point of contact between the pathogen and host cell. The nature and outcome of membrane modulation differs depending on the pathogen, for instance, some pathogenic bacteria produce pore-forming toxins that modulate the membrane, whereas some hijack the membrane trafficking pathways. Membrane modulation often leads to rearrangement of the host cell cytoskeleton that enables entry, transport and survival of the pathogens in the host cell.

The nature of cytoskeletal modification varies with the pathogen and stage of infection. While extracellular pathogens like Yersinia spp activate Rho GTPases to cause cell rounding and inhibition of phagocytosis , intracellular pathogens like السل الفطري (MTb) exploit phagocytosis by alveolar macrophages for its entry into the host. In the case of the bacteriae Samonella typhimurium و شيغيلا فلكسنري, effectors of Type III secretion system 1 (T3SS-1), trigger host signaling pathways that rearrange the host actin cytoskeleton to induce membrane ruffling , thus invoking macropinocytosis and engulfment of the bacteria. The precise molecular mechanisms underlying bacterial uptake are not clear, although a mechanism involving direct activation of Rho GTPases leading to actin polymerization either through Arp2/3- or formin-dependent pathways is likely in the case of Salmonella [1] . Some bacteria like L. monocytogenes, S. flexneri, Ricketssia spp., use actin tails to move within and between cells [2] . Other cytoskeletal components like microtubules (Salmonella), intermediate filaments (الكلاميديا) and septins are also recruited/altered for pathogenesis.

Once internalized, bacteria thrive within vacuoles formed both in phagocytic and non-phagocytic host cells. The Salmonella Containing Vacuole (SCV) is integrated with the early endocytic pathway, but they escape lysosomal fusion and lysis [3] . During SCV maturation, an F-actin meshwork is formed around bacterial vacuoles in a process known as vacuole-associated actin polymerization (VAP) that reinforces the integrity of the vacuolar membrane. Mature SCVs are found in a perinuclear position, proximal to the Golgi apparatus. Salmonellae within SCVs also induce the formation of tubular aggregates along a scaffold of microtubules called Salmonella-induced filaments (SIFs) that extend from SCVs throughout the cell. Therefore, an intricate link exists between the host cytoskeleton and Salmonella pathogenesis at various stages. Other intracellular bacteria like الفطريات, Coxiella, Legionella، و Brucella also reside within vacuoles and exploit different components of the endocytic and secretory pathways for pathogenesis.

ال enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) modulate the membrane and cytoskeleton through yet another unique mechanism. The EPEC T3SS encodes the translocated intimin receptor (Tir), which localizes to the plasma membrane to induce actin polymerization. This results in the formation of a pedestal structure beneath the bacterium [4] . ال enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) also forms actin pedestals through a molecular mechanism distinct from that of EPEC [5] .

تقوم الفيروسات أيضًا بإعادة تكوين وإعادة تنظيم الأكتين عند دخولها إلى الخلايا المضيفة [6]. قد يكون لفيروسات الورم مثل الفيروس المضخم للخلايا البشري (HCMV) دور في التعديل اعتمادًا على حالة الأشكال الإسوية Rho GTPase [7]. تستغل العديد من الفيروسات أيضًا فلوبوديا للدخول إلى خلية مضيفة وللانتقال الأفقي بين الخلايا [8]. الفطريات الممرضة المبيضات البيض تعديل الأكتين وتغيير هجرة الخلايا لغزو الأنسجة [9].

ومن المفارقات ، أن الهيكل الخلوي المضيف الذي تستغله مسببات الأمراض من أجل الفوعة ، يتم استخدامه أيضًا من قبل الخلية المضيفة في المناعة الذاتية الخلوية ، حيث تحاول الخلية المضيفة القضاء على العامل الممرض [10]. في الواقع ، تساعد إعادة ترتيب الهيكل الخلوي أثناء العدوى البكتيرية في الاستشعار البكتيري وبدء الاستجابات المناعية ، مما يوفر دعائم لتقسيم مسببات الأمراض وتنفيذ الالتهام الذاتي أو موت الخلايا المضيفة مما يؤدي إلى القضاء على العامل الممرض [11].


شاهد الفيديو: أقوى فيديو تحفيز طب نبضات القلب (ديسمبر 2021).