معلومة

استخدام المصطلحات: مُحسِّن ، تسلسل تنشيط المنبع وتسلسل تنشيط المصب


من ويكيبيديا

ان تسلسل تنشيط المنبع أو تسلسل التنشيط المنبع (UAS) هو تسلسل تنظيمي يعمل باتحاد الدول المستقلة. إنه متميز عن المحفز ويزيد من التعبير عن الجين المجاور.

مرة أخرى،

في علم الوراثة ، أ محسن هي منطقة قصيرة (50-1500 سنة مضت) من الحمض النووي يمكن ربطها بالبروتينات (المنشطات) لزيادة احتمالية حدوث نسخ جين معين.

لا أجد فرقًا بينهما ، هل هما مترادفان؟

نظرًا لدورها الأساسي في تنشيط النسخ ، غالبًا ما يُنظر إلى تسلسل التنشيط الأولي على أنه مماثل لوظيفة المُحسِّن في حقيقيات النوى متعددة الخلايا.

يبدو أن هناك نوعًا آخر من التسلسل التنظيمي ، عنصر تنشيط المصب ، وأعتقد أنه مرادف آخر للمُحسِّن الموجود أسفل موقع بدء النسخ.


البروتينات التي ترتبط بمُحسِّن الخميرة rDNA

يختلف نسخ جينات الرنا الريبوزومي عن نسخ الجينات الأخرى في عدة نواحٍ: استخدام بوليميراز متخصص ، والمستوى العالي للنسخ ، والترتيب الترادفي للجينات. في الخميرة خميرة الخميرة، حددنا تسلسل النوكليوتيدات في منطقة المباعد "غير المنقولة" التي لها العديد من خصائص محسن النسخ (8). في الآونة الأخيرة ، أصبح من الواضح أن نسخ هذا التسلسل يحدث (9) وأنه قد يكون متورطًا أيضًا في بعض جوانب إنهاء نسخ 35 S rRNA. أدى احتمال وجود عوامل بروتينية متورطة في إنهاء وتفعيل النسخ وأن هذه العوامل قد تشارك في اقتران نسخ جينات الرنا الريباسي المجاورة لنا إلى البحث عن البروتينات التي قد ترتبط بالمُحسِّن. لقد حددنا اثنين من هذه البروتينات ، تسمى REB1 و REB2 ، والتي ترتبط بالمحسِّن وتحمي تسلسلات معينة من هجوم الكواشف الكيميائية والإنزيمية. من الجدير بالذكر أن هناك موقع ربط REB1 ثانٍ تقريبًا 210 أزواج قاعدية أعلى مصدر نسخ الرنا الريباسي وأن ارتباط REB1 بهذا الموقع يغير شكل الحمض النووي المجاور لموقع البدء.


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


المعززات والنسخ

في بعض الجينات حقيقية النواة ، توجد مناطق تساعد في زيادة أو تحسين النسخ. هذه المناطق ، التي تسمى المعززات ، ليست بالضرورة قريبة من الجينات التي تعززها. يمكن أن توجد في الجزء العلوي من الجين ، داخل منطقة ترميز الجين ، أو في اتجاه مجرى الجين ، أو قد تكون على بعد آلاف النيوكليوتيدات.

مناطق المحسن هي سلاسل ملزمة ، أو مواقع ، لعوامل النسخ. عندما يرتبط بروتين ثني الحمض النووي ، يتغير شكل الحمض النووي (الشكل ( فهرس الصفحة <1> )). يسمح هذا التغيير في الشكل بتفاعل المنشطات المرتبطة بالمحسّنات مع عوامل النسخ المرتبطة بمنطقة المروج وبوليميراز الحمض النووي الريبي. في حين يتم تصوير الحمض النووي بشكل عام على أنه خط مستقيم في بعدين ، فهو في الواقع كائن ثلاثي الأبعاد. لذلك ، فإن تسلسل النوكليوتيدات بعيدًا عن آلاف النيوكليوتيدات يمكن أن ينثني ويتفاعل مع محفز معين.


مناقشة

تتضمن تسلسلات المروج التي نحددها أجزاء مهمة من جين SCBV ORF III. يتداخل تسلسل SCBV839 ، الذي يتمتع بأكبر نشاط في المقايسات العابرة ، مع 525 نيوكليوتيدات ترميز بروتين. تحتوي التسلسلات المتداخلة في جين ORF III على معظم نشاط المروج كما يتضح من جزء SCBV333 الذي يحتوي على 20 نقطة أساس فقط من جين ORF III ويحتوي على 10 ٪ فقط من نشاط المروج لتسلسل SCBV839 (الشكل 3). يحتوي جزء مُحسِّن SCBV282 على 189 نقطة أساس من تسلسل ترميز ORF III. تم العثور على وضع مماثل في Arabidopsis حيث العناصر التنظيمية لمروج زويشل (ZWI) تم العثور على الجين في تسلسل exon و intron المجاور هيدروكسي أيزوبوتيرل-كوا هيدروكسي 1 (CHY1) الجين [49].

كانت متواليات المحسن في مروج SCBV-IM قادرة على زيادة نشاط مروج ZmADH1 المقطوع (الشكل 4) ، لكن هذه المحفزات الكيميرية كانت أضعف بكثير من مروج SCBV-IM السليم في المقايسات العابرة (الشكل 3). هذا الاختلاف كبير جدًا ومن غير المرجح أن يكون نتيجة لتحضيرات الخلايا المختلفة وقد يكون نتيجة لتسلسلات تنشيط المنبع SCBV-IM التي تتفاعل بشكل مختلف مع مروج ZmADH1 الأساسي غير المتجانسة ومروج SCBV-IM الأصلي. شوهدت نتائج مماثلة عندما تم وضع مُحسِّن CaMV 35S في مقدمة المعزز الأساسي CaMV 19S [38].

أظهر تحليل الحذف لمروج SCBV-IM أن إزالة التسلسلات من 770 إلى −507 تسبب في انخفاض بنسبة 30 ٪ في نشاط المروج ، بينما أدت إزالة التسلسلات من 770 إلى −264 إلى انخفاض بنسبة 90 ٪ في النشاط (الشكل 3). لذلك ، كان من المدهش إلى حد ما ملاحظة أن المروج الخيمري SCBV537 :: ZmADH1 (الذي يحتوي على تسلسل SCBV-IM من 689 إلى −153) كان له نشاط أقل من المروج الخيمري SCBV282 :: ZmADH1 (الذي يحتوي على تسلسل SCBV-IM −434 إلى - 153) نظرًا لأن الجزء الأطول في تحليل حذف المُعزز كان له أكبر نشاط. غالبًا ما يتم الحصول على نتائج مفاجئة عند إضافة أو حذف أجزاء من المروجين وحتى الأجزاء الصغيرة من المروجين يمكن أن يكون لها تأثيرات دراماتيكية. على سبيل المثال ، أظهر Dey and Matti [15] أن إزالة 50 نقطة أساس من محفز MMV زاد من النشاط 10 أضعاف و Simon et al. [50] أظهر أن حذف 54 نقطة أساس من داخلي لا خارجي يمكن لمروج نبات الأرابيدوبسيس عكس المروج الصامت.

تتسبب نسخ متعددة من مُحسِّن SCBV-IM في زيادة نشاط المروجين الخيمريين في المقايسات العابرة (الشكل 5). هذا يتوافق مع ما تم ملاحظته مع CaMV 35S و FMV ehancers [8] ، [37] - [39] وقد يرجع ذلك إلى أن النسخ المتعددة من المُحسِّن تكون أكثر فاعلية في تجنيد عوامل النسخ للمُروج.

جزء SCBV282 قادر على العمل كمحسِّن للنسخ عند وجوده في جينوم الذرة في مجموعة ترادفية 4x. في الأحداث التي تحتوي على محسن 4x SCBV-IM في المنبع والمصب للجينات ، وفي أي اتجاه فيما يتعلق بهذه الجينات ، لوحظ زيادة تراكم النسخ (الشكل 7). علاوة على ذلك ، يبدو أن العنصر يتسبب في تراكم النصوص غير الموجودة ، أو الموجودة بمستويات منخفضة جدًا ، في الخطوط غير المعدلة وراثيًا. يوضح هذا أنه يمكن استخدام مُحسِّن SCBV-IM لتفعيل وضع العلامات في الذرة. أدت معززات SCBV-IM إلى زيادة التعبير عن 2 من أصل 8 جينات أظهرت تعبيرًا غير قابل للاكتشاف في نباتات التحكم غير المعدلة وراثيًا. هذا مشابه لبعض الدراسات التي أبلغت عن التعبير خارج الرحم للجينات عندما تتكامل معززات CaMV 35S في مكان قريب [51] ، [52].


المواد والأساليب

تمت زراعة خلايا P2C2 (SCID.adh2C2) و 32 D و Raw264.7 ونقل العدوى بسلسلة من Bcl11b-النتيجة المرتبطة لوسيفيراز والبروتين الأصفر الفلوري (mCitrine ، YFP) يبني مراسل كما هو موصوف هنا. تم قياس 17،18 مثيلة الحمض النووي عن طريق تسلسل ثنائي كبريتات الحمض النووي. تم إنشاء طفرات الذروة الرئيسية (MP) عن طريق الاندماج PCR مع الاشعال الموضحة في الجدول التكميلي 1 (متاح على دم موقع الكتروني). تم قياس تفاعل الحمض النووي بعيد المدى عن طريق اختبار Chromatin Conformation Capture. 19،20 تم إنشاء مراسلي الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC) عن طريق إعادة التركيب. 21،22 رقم الوصول لبيانات السلسلة TCF-1 ChIP-seq: GSE46662. يتم إعطاء الطرق التفصيلية في المواد والطرق التكميلية. في أحد الأشكال ، تم استخدام خلايا من الغدة الصعترية والطحال. تم تربية هذه الحيوانات وصيانتها في مستعمرتنا في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا واستخدمت بالكامل وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من لجنة رعاية الحيوان والاستخدام المؤسسية.


النتائج

السمة المميزة لمحسنات pol II هي أنها يمكن أن تؤثر على التعبير الجيني من مكان بعيد. في المقابل ، فإن التسلسلات التنظيمية للجينات التي يتم نسخها بواسطة RNA polymerase III (pol III) تقع عادةً على مقربة من الجين ، ولا يمكنها العمل على مسافات طويلة (25). بالاتفاق مع هذه الملاحظة ، دراساتنا حول تنظيم أنظمة الطائرات بدون طيار جي - SNR6 ، جين الخميرة pol III الذي يتم تنشيطه عن طريق ربط الوحدة الفرعية TFIIIC τ138 مع UAS جي التسلسل عبر الاندماج مع مجال ربط الحمض النووي Gal4p (DBD) (26 ، 27) ، يشير إلى أن تقسيم UAS هذا جي - SNR6 الجين مثل تحويل أنظمة الطائرات بدون طيار جي عنصر إلى موقع بعيد يقلل بشكل كبير من تعبيره (انظر أدناه). قدمت هذه الاختلافات الوظيفية بين التسلسل التنظيمي للبول II والبول الثالث الأساس للنظام الذي أنشأناه للتحقيق في نمط نشاط المُحسِّن في الجسم الحي . بالنسبة لهذا النظام ، نظرنا في إمكانية أن تساعد آلية عمل مُحسِّن pol II (أيًا كان ذلك ، أي المسح أو الربط أو التكرار) الموجود بجوار العنصر التنظيمي الاصطناعي pol III المخلوع في استعادة الاتصال بين هذا العنصر (UAS جي ) ومروج pol III وبالتالي السماح بتنشيط SNR6 بول الثالث الجين على مسافة. الشكل 1 يصور بشكل تخطيطي الأساس الجزيئي لهذا النظام. ال SNR6 الجين و لاكز تم ربط الجين المراسل الذي تم نسخه من مروج pol II في اتجاهات متباينة. المصب من SNR6 ، قمنا بوضع خمسة مواقع ربط Gal4p (UAS جي ) وأربعة مواقع ربط متجاورة (BS) لـ LexA كمُحسِّن pol II. تم استخدام بروتين خيمري يحمل مجال تنشيط Gal4p مدمجًا في LexA (Lex-AD) كمنشط خاص بـ pol II. لتقليد بنية المروج للميتازوان عن كثب ، تم إدخال موقع ربط LexA واحد قريبًا من GAL1 صندوق تاتا لتسهيل عمل المحسن البعيد (7) (الشكل 1). تم دمج بنية مراسل pol II – pol III هذه في جينوم سلالة الخميرة التي تتحمل حذف العنصر الداخلي SNR6 الجين. نظرًا لأن هذه الضربة القاضية قاتلة ، فقد قدمنا ​​وظيفة SNR6 أليل يحتوي على حذف 6 نقاط أساس ( SNR6-6 ) على بلازميد episomal المميز بعلامة URA3 الجين الذي يكمل تمامًا استنفاد النوع البري U6 snRNA ولا يتأثر بـ Gal4DBD-τ138. سمح لنا هذا الجين المحدد بمراقبة التعبير عن UAS جي - SNR6 الجين المراسل عن طريق اختيار فقدان SNR6-6 بلازميد episomal عند نمو الخلايا على وسط 5-FOA (26 ، 28). ترتبط كفاءة نمو الخلية على هذا الوسط الانتقائي بمستوى التعبير عن أنظمة الطائرات بدون طيار جي - SNR6 الجين (26) (انظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك ، فإن منتج U6 snRNA الأقصر من SNR6-6 الأليل الذي يحمله URA3 يسمح البلازميد المركزي ذو العلامات بمراقبة التعبير عن كليهما SNR6 الأليلات في اختبار تمديد تمهيدي واحد ، منذ SNR6-6 يمكن تمييزه بسهولة عن منتج SNR6 الجين المراسل بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. في إعدادنا التجريبي ، تقدم النماذج الثلاثة الموضحة أعلاه تنبؤات مختلفة لمتطلبات إعادة تنشيط أنظمة UAS المنقسمة جي - SNR6 الجين المراسل pol III بواسطة محسن pol II. تم اختبار هذه التنبؤات (انظر أدناه).

تم تحويل سلالة الخميرة التي تحمل بنيات المراسل الموضحة بشكل تخطيطي في الشكل 1 بالبلازميدات التي تعبر عن عوامل النسخ pol II و pol III المشار إليها في الشكل 2. تفعيل SNR6 تمت مراقبة الجين المراسل من خلال اكتشاف قسامات من مزارع الخميرة هذه على لوحات متساهلة (−Leu −Trp SD) وكذلك لوحات غير متساهلة (−Leu −Trp SD + 5-FOA) من أجل تحديد تلك الخلايا التي يمكن أن تفقد الورم العضلي. نسخة من SNR6 . لم يتسبب التعبير عن عامل النسخ pol III τ138 الذي يفتقر إلى جزء Gal4p DBD في تنشيط أي من UAS جي - SNR6 (الشكل 2 أ) أو من لاكز (الشكل 2 ب) الجينات المراسل. تم تنشيط التعبير عن المنشط النسخي لـ Pol II Lex-AD بقوة لاكز التعبير الجيني (الشكل 2 ب) ، ولكن لم ينشط التعبير عن أنظمة الطائرات بدون طيار جي - SNR6 الجين (الشكل 2 أ). التعبير عن النسخ النشط لبروتين الاندماج Gal4DBD-τ138 لـ UAS جي - SNR6 الجين (الشكل 2 أ) ، ولكن ليس من لاكز الجين المراسل (الشكل 2 ب). كان للجمع بين المنشطات pol II (Lex-AD) و pol III (Gal4DBD-τ138) تأثير سلبي طفيف ولكن قابل للتكرار على أنشطتها. ومع ذلك ، كانوا قادرين على حث التعبير عن جينات المراسل الخاص بهم أيضًا عند التواجد في نفس الوقت على الحمض النووي للمراسل (الشكل 2A و B). في تجربة تحكم ، راقبنا النمو على ألواح 5-FOA لسلالة متساوية المنشأ تحمل بناء مراسل يفتقر إلى UAS جي - SNR6 الجين ، ولكنها تحمل جميع التسلسلات الأخرى الموضحة أعلاه. يوضح الشكل 2 ج أن أيا من عوامل النسخ المعبر عنها حفز نمو سلالة الخميرة هذه على اللوحات التي تحتوي على 5-FOA ، مما يشير إلى أن النمو الانتقائي للخلايا التي تحمل بنية المراسل الكامل كان تأثيرًا مباشرًا لتنشيط المراسل SNR6 الجين. تظهر هذه النتائج أن الجينات الموجهة بشكل متباين تعمل ، حتى عندما يتم تنشيط كلا البوليميراز ، وأن المنشط pol II لم يؤثر بشكل مباشر على التعبير الجيني لجين مراسل pol III والعكس صحيح.

المسافة بين أنظمة UAS الملزمة Gal4DBD-τ138 جي العنصر و SNR6 تمت زيادة الجين على بناء المراسل الأساسي (الشكل 1) بطريقة تدريجية عن طريق إدخال جزء الحمض النووي 100 أو 200 أو 400 نقطة أساس بين هذين التسلسلين (الشكل 3 أ). ثم اختبرنا مستوى SNR6 و β-galactosidase التنشيط النسخي لبنيات مراسل pol III هذه في وجود Gal4DBD-τ138 أو Lex-AD أو مزيج Gal4DBD-τ138 و Lex-AD ، ومقارنتها بمستوى التنشيط لنظام UAS الأقل فاصلًا جي - SNR6 . الزيادة التدريجية للمسافة بين أنظمة الطائرات بدون طيار جي العنصر و SNR6 الجين أدى إلى انخفاض سريع في SNR6 التعبير كما رصدته فحوصات التمهيدي التمديد (الشكل 3 ب وج). تفعيل لاكز تم تقليل الجين بواسطة المنشط pol II Lex-AD إلى 60 ٪ من النشاط الأصلي عن طريق إدخال 200 bp spacer DNA (الشكل ثلاثي الأبعاد واللوحة الوسطى واليمنى). اختبرنا ما إذا كان خفض SNR6 التعبير الناجم عن تحريك أنظمة الطائرات بدون طيار جي عنصر مزيد من المصب SNR6 ، بواسطة منشط pol II مرتبط بالمُحسِّن البعيد. لاحظنا أن الخلايا التي تحمل تركيبات مراسلة فاصل 100 و 200 نقطة أساس ، ولكن ليس الخلايا التي تحمل التركيبة الخالية من المباعد ، أظهرت أعلى (المراسل) SNR6 مستويات النسخ عند التحويل المشترك مع Gal4DBD-τ138 والمنشط pol II Lex-AD مقارنةً بالتحويل باستخدام Gal4DBD-τ138 وحده (قارن `` عدم وجود فاصل '' في ممرات الشكل 3B 1 و 5 ، ممرات فاصل '100 bp' 2 و 6 ، الممرات "200 bp spacer" 3 و 7 ، والشكل 4B). الشكل 3C يرسم SNR6 التعبير كدالة للمسافة بين المراسل SNR6 والطائرات بدون طيار جي عنصر. زاد التعبير المشترك عن Gal4DBD-τ138 و Lex-AD SNR6 التعبير فقط على مسافات (100 و 200 نقطة أساس) حيث كان Lex-AD قادرًا على تنشيط لاكز الجين. تظهر هذه النتائج أن التأثير المساعد لمنشط pol II Lex-AD على عمل Gal4DBD-τ138 حدث فقط في حالة زيادة المسافة بين مواقع الربط لهذا البروتين و SNR6 تسلسل. لم يلاحظ التأثير المساعد عندما كانت مواقع الربط لـ Gal4DBD-τ138 قريبة من جين القطب الثالث.

لذلك سألنا ما إذا كان هذا التأثير المساعد لمنشط pol II يعتمد أيضًا على وجود مروج pol II ومُحسِّن pol II. كما هو مبين في الشكل 4 ، يتطلب مثل هذا التأثير المساعد لمنشط pol II وجود كل من مُحسِّن pol II وتسلسل المحفز ، نظرًا لأن حذف أي من هذه العناصر ألغى تحفيز SNR6 التعبير الجيني. انخفض SNR6 التعبير من سلالات المراسل "no-spacer" و "المحسن المحذوف" و "المروج المحذوف" في وجود كل من المنشطات pol II و pol III ، مقارنةً بوجود المنشط pol III وحده ، ربما يرجع إلى نفس التأثير المثبط غير النوعي (السحق) الذي شوهد في تجارب التحكم. تمشيا مع هذا التفسير ، لوحظ أيضًا انخفاض طفيف في معدل النمو في وجود المنشط pol II المعبر عنه بشكل مفرط لجميع سلالات الخميرة المختبرة في ظل ظروف غير انتقائية (البيانات غير معروضة). تُظهر هذه النتائج أن الوجود المتزامن لمُحسِّن ومُحَسِّن pol II ضروري للتأثير المساعد لمنشط pol II Lex-AD على عمل Gal4DBD-τ138 على مسافة متزايدة بين مواقع الربط لهذا البروتين و SNR6 تسلسل.

اعتقدنا أن خفضت SNR6 التعبير الناجم عن زيادة المسافة بين أنظمة الطائرات بدون طيار جي العنصر و SNR6 يمكن إنقاذ المروج من خلال تشكيل حلقة تجلب المنشط المرتبط بعيدًا Gal4DBD-τ138 على مقربة من SNR6 المروجين. تنشيط مُحسِّن Pol II في الخميرة محدود بمسافة ∼1200 نقطة أساس (5-7). وبالتالي ، قد يتم إنقاذ محسن الخميرة بول II غير قادر على تنشيط جين المراسل نظرًا لبعده الكبير عن المروج المعني (& gt1200 bp) بطريقة مشابهة لإنقاذ الجين. SNR6 التعبير. وبالتالي ، فإن إعادة تنشيط مُحسِّن يقع بعيدًا يتطلب بروتينًا يسهل التواصل بين المُحسِّن والمُحفِّز عن طريق وضع المُحسِّن بالقرب من المُعزِّز المنظم وبالتالي فصل الحمض النووي المتداخل. GAGA ، وهو بروتين مشفر أساسي Trithorax مثل ( TRL ) جين ذبابة الفاكهة سوداء البطن ، وقد ثبت أنه يؤدي العديد من المهام الصبغية وأنه مطلوب للتعبير عن مجموعة واسعة من الجينات المختلفة (29 - 32). في المختبر تسهل GAGA نسخ المعززات الموجودة في أماكن بعيدة عن طريق ربطها بالمحفز المتعارف عليه من خلال قلة القلة عندما تكون مرتبطة بالحمض النووي (24 ، 33 ، 34). لذلك ، هناك عامل مثل GAGA قادر على ربط المعززات الموجودة على مسافة بعيدة مع المروج الخاص بها في المختبر يجب أن تمكّن المُحسّنات من تنشيط النسخ من مسافات أكبر من المُحسِّن والمُحفز مقارنةً بالخميرة. أ لاكز مراسل محاط بالعديد من عناصر GAGA التي تحتوي على أربعة من الولايات المتحدة الأمريكية جي مواقع الربط بين 3 نهاية لاكز تم دمج الجين وعناصر GAGA المصب في الجينوم (الشكل 5A). كما هو متوقع من الأعمال السابقة ، لم يُنشِط المنشط الكلاسيكي Gal4p ولا GAGA ، اللذان يُظهِر أنهما يعملان كمنشِط بدلاً من المنشط الكلاسيكي ، نسخ لاكز الجين المراسل (35). ومع ذلك ، أدى التعبير المشترك إلى تعبير منخفض ولكنه قوي للمراسل. هذا ليس أمرًا رائعًا فقط بسبب المسافة غير المسبوقة ولكن أيضًا لأن منشطات pol II الكلاسيكية في الخميرة قد ثبت أنها لا تعمل من المواضع في اتجاه مجرى النهر في صندوق TATA (36 ، 37). لذلك نستنتج أن Gal4p يتم تجنيده في منطقة المنبع لمربع TATA الخاص بـ غال 1 المروج من خلال عوامل GAGA المتعددة المرتبطة بالمواقع المقابلة في اتجاه مجرى النهر ومنبعه لاكز الجين.


كوابح محسن

كما ذكرنا سابقًا ، مقارنةً بالطفرات الكيميائية ، ص-طفرات العنصر غير فعالة في أن الطفرات المميتة تنتج بنسبة 12٪ فقط من حالات الإدخال ، في حين أن EMS تحفز 60 إلى 80٪ طفرات قاتلة لكل كروموسوم. تم تطوير استراتيجيتين للتدخل مع المعززات الذاتية لزيادة الكفاءة الطفرية ص عناصر. الأول يعمل على منع نشاط المعززات باستخدام أ ص عنصر يحتوي على تسلسلات مرتبطة ببروتين يسمى Suppressor of Hairy-wing (Su [Hw]) الذي يمنع تفاعل المعززات مع المروجين الداخليين (Roseman et al. ، 1995 الشكل 2B). تم اكتشاف مواقع ربط Su (Hw) في الأصل لأنها مطلوبة للنشاط المطفر لـ الغجر العناصر القابلة للتحويل (Corces and Geyer ، 1991). يتم التعبير عن Su (Hw) في معظم الأنسجة خلال التطور (Harrison et al. ، 1993) ، وربط هذا البروتين بموقع الارتباط الخاص به (الموجود في النوع البري. الغجر عنصر) يمنع تفاعل المُحسِّن مع محفزه. وبالتالي ، فإن إدخال ملف الغجر عنصر بين المُحسِّن والمُحفِّز بشكل فعال يسمح لـ Su (Hw) بمنع تفاعل المُحسِّن والمُعزِّز (Holdridge and Dorsett ، 1991 Roseman et al. ، 1993). ص العناصر التي تحتوي على مواقع ربط Su (Hw) مفيدة بشكل خاص لأن معظمها ص تدخل العناصر في التسلسل التنظيمي 5 للجينات. المعدل ص العناصر التي تحتوي على مواقع الربط Su (Hw) تعمل كمطفر أقوى من المعتاد ص العناصر ، حيث تسبب 27٪ مقابل 12٪ من عمليات الإدخال في الوفاة (Roseman et al. ، 1995).

في إستراتيجية ثانية ، بالاعتماد على عنصر EP ، يتم دمج العديد من مواقع UAS أمام الحد الأدنى من المروج في الطرف 3 من ص عنصر (الشكل 2C). عند الإدراج ، ص يسمح العنصر بالتعبير خارج الرحم عن أي جين جيني موجود في 3 نهاية ص- إدخال عنصر (Rorth ، 1996 ، الشكل 2C) ، وبالتالي منع وصول أي محسن داخلي إلى محفزه المشابه. كما هو مبين في الشكل 2C ، فإن ص يحتوي العنصر ، بالإضافة إلى موقع ربط Su (Hw) ، على ما مجموعه 14 موقعًا للطائرات بدون طيار (UAS) في اتجاه منبع مروج ذبابة الفاكهة. بعد إنشاء مجموعة أولية من إدخالات EP ، يمكن عبور السلالات المحتوية على EP إلى سلالات تعبر عن GAL4 في خلية أو نسيج معين ، مما يسمح بالتعبير الخاطئ عن الجينات في الخلايا أو الأنسجة المحددة بواسطة السلالة المعبرة عن GAL4. يمكن أن تكون سلالة GAL4 إما سلالة مكشاف محسن أو سلالة تعبر عن GAL4 من محفز مستنسخ (Rorth ، 1996 Rorth et al. ، 1998). ميزة هذه الطريقة هي أنها مشروطة ، حتى أنها تسمح بشاشات التأثير المميت أو الطفرات المعقمة. بالإضافة إلى ذلك ، فهو فعال لأنه يمكن استخدام نفس المجموعة من سلالات EP لدراسة آثار التعبير الخاطئ في العديد من الأنسجة المختلفة ، عن طريق عبورها ببساطة إلى سلالات مختلفة من GAL4. علاوة على ذلك ، يجب مقارنة أي نمط ظاهري لفقدان الوظيفة بسبب عنصر EP أو استئصاله غير الدقيق بالنمط الظاهري الناتج عن التعبير خارج الرحم للجينات المستحثة عند الإدخال. يكمن المأزق في هذه الإستراتيجية ، بالطبع ، في أن الإفراط في التعبير أو سوء التعبير قد يتسبب في ظهور أنماط ظاهرية غير محددة لا تتعلق بالوظيفة الطبيعية للجين.


الاستنتاجات

توضح دراستنا بوضوح أن المُحسِّن الأول ولكن البعيد يلعب دورًا أساسيًا في الحفاظ على خط الأساس للتعبير الجيني المستهدف. نقترح نموذجًا لسلسلة مُحسِّن ونكشف عن آلية هرمية لتنظيم الجينات تحتوي على المُحسِّن الأول والمحسنات الزائدة عن الحاجة. يتم بدء المجال التنظيمي من هذا المُحسِّن الأول من خلال بناء اتصالات أولية مستقرة مع المروج المستهدف جنبًا إلى جنب مع سلسلة من المعززات الزائدة المرتبطة ببعضها البعض عبر تفاعلات المُحسِّن-المُحسِّن. باختصار ، تشير النتائج التي توصلنا إليها من هذا العمل إلى السمات البعيدة ومتعددة جهات الاتصال لأول معززات حرجة وقد توفر رؤى حول آلية التنظيم للمجالات التنظيمية المعقدة.


المواد التكميلية الإلكترونية

رسم تخطيطي لبنى التحوير

الملف الإضافي 1:. مخططات توضح التفاصيل ذات الصلة بالجينات المحورة التي تم اختبارها والمختصرات المقابلة لها. تشمل العناصر الأساسية ما يلي: cfos - الحد الأدنى من المروج [34] كالتا 4 - بروتين اندماج مُحسَّن Gal4-VP16 [43] GI - إنترون بيتا جلوبين الأرنب لتعزيز استقرار الرنا المرسال [89] pA - SV40 أو تسلسل هرمون النمو البقري متعدد الأدينيل 2xNRSE - تكرار ترادفي لموقع NRSE بتوافق الآراء 21 نقطة أساس [33] ، سمك مدخن - مواقع إعادة تركيب loxP للسماح بتبديل شرائط الكاسيت المعدلة وراثيًا [92] الطائرات بدون طيار - تسلسل المنشط المنبع بمقدار 17 نقطة أساس [63] خاص بمجال ربط الحمض النووي Gal4 (مع العدد المشار إليه من التكرارات ، على سبيل المثال ، 5x أو 14x) E1b - محفز أساسي من بيتا أكتين الكارب [37] كريست 1 - عنصر مُحسِّن بقوة 800 نقطة أساس يتميز بأنه عنصر خاص بالعصبونات الحركية القحفية [35] 2 أ - سلسلة ببتيد فيروسية من الخنازير 2A [86] تعزز التعبير متساوي القطب للرسائل متعددة المراحل [87] nfsB - الإشريكية القولونية الجين الذي يرمز إلى إنزيم نيتريدوكتاز المحول للعقاقير البكتيرية (Ntr) الذي يعزز استئصال الخلايا المستحث كيميائيًا [52 ، 53 ، 88] هو - عنصر محفز 365-bp من موضع إنزيم تفقيس الزرد 1a (he1a) الذي يسمح بالكشف السهل عن خطوط مراسل أنظمة الطائرات بدون طيار في غياب عناصر برنامج تشغيل Gal4-VP16 (انظر الملف الإضافي 5). تضمن صحفيو الفلورسنت ما يلي: M-YFP - غشاء موسوم (تسلسل مزدوج باليتويليشن من فجوة Xenopus43 locus [93] بروتين فلوري أصفر "مُعزز" (EYFP) M-tYFP - غشاء ذو ​​علامات غشاء (كما هو مذكور أعلاه) أحادي البروتين الفلوري الأصفر "العلامة" (tagYFP) مشيري - بروتين فلورسنت أحمر أحادي [94]. (PNG 107 كيلوبايت)

مقارنات فخ محسن ± NRSE

الملف الإضافي 2:. يتم عرض صور متحد البؤر لـ 12 خطوط NRCK إضافية (المربع الأيسر) و 6 خطوط CK (المربع الأيمن) لدعم البيانات المظهرية الملخصة في الشكل 1S. يتم تحديد كل سطر بواسطة رقم أليل معدّل وراثيًا (على سبيل المثال ، gmc601) ومع توصيف النمط الظاهري (على سبيل المثال ، عصبي ، مختلط ، غير عصبي) المتوفر في أسفل يمين كل مجموعة صور. تتوفر بيانات تصوير إضافية عالية الدقة على الإنترنت في [47]. (PNG 2 ميجابايت)

التصوير عالي الدقة لتوسيم الخلايا العصبية الحركية

الملف الإضافي 3:. (A-E) صور متحد البؤر لخط معدل وراثيا 6-dpf NRC1CK-5xY2N (Tg (2xNRSE-CREST1-cfos: KalTA4 ، 5xUAS-E1b: YFP-2A-nfsB) lmc003) إظهار العلامات المحددة للعقد العصبية الحركية. عندما تم وضع مواقع NRSE في مقدمة CREST1-cfos ، أصبح التعبير مقصورًا على المجموعات السكانية الفرعية للخلايا العصبية الحركية القحفية ، كان نمط التعبير الذي تم وصفه في الأصل على أنه CREST1 محدد [35]. (ب ، ج) تضمن تعبير العقد الحركية العصب القحفي X (المبهم ، السهم في منطقة الدماغ المؤخر) ، السابع (الوجه ، رأس السهم السفلي) ، الأمامي والخلفي الخامس (ثلاثي التوائم ، رأس السهم العلوي) الرابع والثالث (البكرة ومحرك العين ، على التوالي ، اليمين رأس السهم). (د ، هـ) مجهول من العصب الفقري النازل. (PNG 273 كيلوبايت)

التعبير العصبي المبكر عن الجينات المحورة للسائق NRSE Gal4

الملف الإضافي 4:. صور متحد البؤر للخط الثلاثي المعدل وراثيا 2-dpf (إت (2xNRSE-cfos: KalTA4) gmc607 Tg (14xUAS: nfsB-mCherry) c264 Tg (elavl3: EGFP) knu3) يُظهر التعبير العصبي النموذجي المبكر (الأسهم تشير إلى الخلايا العصبية ذات العلامات المزدوجة) لخطوط NRCK (محركات NRSE Gal4). (PNG 373 كيلوبايت)


شاهد الفيديو: اقوى شرح لإستخدام الأله الحاسبه في حل مسائل الرياضيات ثانويه عامه زياد محسن (كانون الثاني 2022).