معلومة

ماذا عن اختبار كيناز؟


إنني أتساءل عن سبب استخدام اختبار كيناز ، حيث يمكننا استخراج البروتينات من الخلايا ثم إجراء اختبار غربي بالأجسام المضادة المحددة التي نريد استخدامها.


هناك إجابة بسيطة للغاية: مقياس. إذا أرادت شركة أدوية فحص مكتبة تحتوي على مليون مركب للعثور على تلك التي تمنع نشاط كيناز لهدف معين ، فهي ليست على وشك القيام بمليون عنوان IP ومليون بقعة غربية. بدلاً من ذلك ، سوف يستخدمون كيناز المؤتلف والببتيدات الركيزة ، مع مجموعة متنوعة من أنظمة القراءة للاختيار من بينها.

تشمل الأسباب الأخرى عدم وجود جسم مضاد جيد خاص بالفوسفو للركيزة ، والتعبير المنخفض جدًا للكيناز و / أو الركيزة ، والبروتوكولات المعقدة اللازمة لتنشيط كيناز في المختبر، وعدم وجود نظام نموذجي جيد ، وأكثر من ذلك.


عرض 405 من 405 منتجات

تمكين أبحاث كيناز باستخدام منصة اكتشاف ADP الإنارة وأنظمة إنزيم كيناز الكاملة

أتمتة أنظمة التنميط كيناز

مقايسة كشف الإنارة ADP للكينازات


الأمريكتان

سيتم عرض الموقع باللغة الإنجليزية.

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لضمان عمل موقعنا بشكل آمن وسليم ، فهي ضرورية لعمل خدماتنا ولا يمكن إيقاف تشغيلها في أنظمتنا. عادةً ما يتم تعيينها فقط استجابةً للإجراءات التي تقوم بها والتي ترقى إلى مستوى طلب الخدمات ، مثل تسجيل الدخول أو استخدام عربة التسوق أو ملء النماذج. يمكنك ضبط متصفحك لحظر ملفات تعريف الارتباط هذه أو تنبيهك بها ، لكن بعض أجزاء خدماتنا لن تعمل بدونها. مثل ملفات تعريف الارتباط الأخرى التي نستخدمها ، قد تكون ملفات تعريف الارتباط الضرورية للغاية إما ملفات تعريف ارتباط الطرف الأول أو ملفات تعريف ارتباط الطرف الثالث.

نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتذكر إعداداتك وتفضيلاتك. على سبيل المثال ، قد نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتذكر تفضيلات اللغة الخاصة بك.
السماح بملفات تعريف الارتباط المفضلة

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لجمع معلومات حول كيفية تفاعلك مع خدماتنا ولمساعدتنا في قياسها وتحسينها. على سبيل المثال ، قد نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتحديد ما إذا كنت قد تفاعلت مع صفحة معينة.
السماح بملفات تعريف الارتباط الخاصة بالأداء / الإحصائيات

نحن وشركاؤنا الإعلانيون نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتقديم الإعلانات ، وجعلها أكثر صلة وذات مغزى بالنسبة لك ، ولتتبع كفاءة حملاتنا الإعلانية ، سواء على خدماتنا أو على مواقع الويب الأخرى ووسائل التواصل الاجتماعي.
السماح بملفات تعريف الارتباط التسويقية


أنظمة التنميط الانتقائية كيناز

تم تحسين أنظمة التنميط الانتقائي لـ Kinase من أجل تفاعلات التنميط السريعة والبسيطة للكيناز. تتضمن هذه الأنظمة أزواج كيناز وركيزة مجمعة في عائلات كيناز مفردة ، أو كلوحة عامة من كينازات ممثلة للكينوم البشري ، للحصول على ملف تعريف كيناز واسع. إنهم يعتمدون على تقنية ADP-Glo ​​™ Kinase التي أثبتت جدواها لجعل تشكيل الكيناز سريعًا وبسيطًا. يمكن أيضًا تخصيص الأنظمة.

  • وقت تسليم سريع في غضون ساعات
  • التنميط المرن المثبط للكيناز
  • تسمح إشارة الإنارة المستقرة بمعالجة لوحة الدفعات

نظرة عامة تخطيطية لنظام التنميط الانتقائي Kinase


يتم أولاً تخفيف الكينازات المركزة والركائز / مخزون العامل المساعد ثم دمجها مع مركب الاختبار في لوحة 384 بئراً. بعد فترة حضانة لمدة ساعة ، يتم إجراء اختبار ADP-Glo ​​& trade. تتناسب إشارة الإنارة الناتجة مع تركيز ADP وترتبط بنشاط كيناز.


نظرية الفحص

يستخدم الاختبار الكيميائي الحيوي Z´-LYTE تنسيق إنزيم مقترن قائم على التألق ويستند إلى الحساسية التفاضلية للببتيدات الفسفورية وغير الفسفورية للانقسام الحال للبروتين (شكل 1).

في التفاعل الأولي ، ينقل الكيناز جاما فوسفات ATP إلى بقايا تيروزين أو سيرين أو ثريونين في ببتيد FRET صناعي. في التفاعل الثانوي ، يتعرف البروتياز الخاص بالموقع على ببتيدات FRET غير الفسفورية ويشقها. تقوم الفسفرة لببتيدات الحنق بقمع الانقسام عن طريق تطوير الكاشف. يعطل الانقسام الحنق بين المتبرع (أي الكومارين) والفلور المتقبل (أي الفلوريسين) على ببتيد الحنق ، بينما تحافظ الببتيدات الحنق الفسفورية غير المكسورة على الحنق. يتم استخدام طريقة قياس النسبة ، والتي تحسب نسبة (نسبة الانبعاث) لانبعاثات المتبرع إلى انبعاث المستقبِل بعد إثارة الفلوروفور المانح عند 400 نانومتر ، لقياس تقدم التفاعل ، كما هو موضح في المعادلة أدناه.

من الفوائد المهمة لطريقة قياس النسبة هذه لتقدير تقدم التفاعل التخلص من الاختلافات الجيدة في تركيز ببتيد FRET وكثافة الإشارة. نتيجة لذلك ، ينتج عن الفحص قيم Z´ عالية جدًا (& gt0.7) عند نسبة منخفضة من الفسفرة.

تساهم كل من ببتيدات FRET المشقوقة وغير المشقوقة في إشارات التألق وبالتالي في نسبة الانبعاث. يمكن حساب مدى الفسفرة لببتيد الحنق من نسبة الانبعاث. ستبقى نسبة الانبعاث منخفضة إذا تم فسفرة FRET-peptide (أي لا يوجد تثبيط للكيناز) وستكون عالية إذا كان FRET-peptide غير فسفوري (أي تثبيط كيناز).


طقم مقايسة تيروزين كيناز العالمي

بروتين التيروزين كيناز (PTK) هو إنزيم مهم لمسارات نقل الإشارة التي تتحكم في تكاثر الخلايا والتمايز والتسرطن. يتم تصنيف PTKs إلى عائلتين: مستقبلات الغشاء PTK مثل الأنسولين ومستقبلات EGF ومستقبلات PTK غير المرتبطة بالمستقبلات مثل Src و FAK. تحتوي مستقبلات الغشاء PTK على ثلاثة مجالات: المجالات خارج الخلية ، والغشاء الداخلي ، والمجالات داخل الخلايا. ترتبط المجالات الجوهرية خارج الخلية والغشاء بالروابط مثل الهرمونات وعوامل النمو ، بينما يحتوي المجال داخل الخلايا على موقع PTK النشط. تقوم مستقبلات PTKs بتحويل الإشارات مباشرة إلى الخلية من خلال فسفرة التيروزين بوساطة يجند. تفتقر PTKs المرتبطة بالمستقبلات إلى المجال الجوهري للغشاء وتنقسم إلى ثلاثة أنواع بناءً على موقعها الخلوي (أي الغشاء أو السيتوبلازم أو النواة). تشارك PTKs غير المرتبطة بالمستقبلات في وظائف مختلفة ، بما في ذلك نقل الإشارة واستجابات الاتصال الخلوي الخلوي.

بروتين التيروزين كيناز (PTK) هو إنزيم مهم لمسارات نقل الإشارة التي تتحكم في تكاثر الخلايا والتمايز والتسرطن. يتم تصنيف PTKs إلى قسمين مألوفين: مستقبلات الغشاء PTK مثل الأنسولين ومستقبلات EGF ومستقبلات PTK غير المرتبطة بالمستقبلات مثل Src و FAK. تحتوي مستقبلات الغشاء PTK على ثلاثة مجالات: المجالات خارج الخلية ، والغشاء الداخلي ، والمجالات داخل الخلايا. ترتبط المجالات الجوهرية خارج الخلية والغشاء بالروابط مثل الهرمونات وعوامل النمو ، بينما يحتوي المجال داخل الخلايا على موقع PTK النشط. تقوم مستقبلات PTKs بتحويل الإشارات مباشرة إلى الخلية من خلال فسفرة التيروزين بوساطة يجند. تفتقر PTKs المرتبطة بالمستقبلات إلى المجال الداخلي للغشاء وتنقسم إلى ثلاثة أنواع بناءً على موقعها الخلوي (أي الغشاء أو السيتوبلازم أو النواة). تشارك PTKs غير المرتبطة بالمستقبلات في وظائف مختلفة ، بما في ذلك نقل الإشارة واستجابات الاتصال الخلوي الخلوي.

إن مجموعة مقايسة Tyrosine Kinase العالمية هي عبارة عن في المختبر مجموعة المقايسة المناعية الإنزيمية المعدة للتحديد الكمي لنشاط التيروزين كيناز في مستخلصات زراعة الخلايا الملتصقة أو المعلقة. يمكن أيضًا استخدام المجموعة لقياس مستويات نشاط PTK وتنظيمها بالإضافة إلى في المختبر فحص مثبطات PTK. تشتمل المجموعة على لوحة ميكروتيتر 96 بئر مطلية بركيزة PTK ، وجسم مضاد لبيروكسيديز الفرسفوتيروزين (pY20) ، وركيزة HRP (TMBZ). يمكن إضافة التخفيفات التسلسلية لمستخلص الخلية المحضرة جنبًا إلى جنب مع محلول ATP إلى صفيحة الميكروتر الدقيقة المطلية بالركيزة PTK ، مما يتيح فسفرة التيروزين. يتم بعد ذلك إزالة محلول العينة وغسل اللوحة جيدًا وسدها. بعد خطوة الحظر ، تتم إضافة pY20-HRP واحتضانها ثم استبدالها بمحلول TMBZ. يتيح تطوير اللون تحديد نشاط عينة PTK من خلال مقارنة امتصاص العينة عند 450 نانومتر مع الامتصاص الذي تم الحصول عليه للمعيار (عبر منحنى قياسي مخطط).


موارد بيولوجيا كيناز

أتمتة أنظمة التنميط كيناز

تعرف على كيفية استخدام فحوصات Promega kinase للفحص السريع للمكتبات المركبة.

ADP-Glo: اختبار كشف الإنارة ADP للكينازات

دراسات في المختبر لطريقة عمل مثبطات كيناز ، وآليات مقاومة الأدوية للكينازات الطافرة.

تقنية كمية لقياس تفاعل هدف كيناز في الخلايا الحية

في هذه الندوة عبر الويب ، أبلغنا عن استخدام تقنية نقل الطاقة (NanoBRET) في النهج الكمي الأول لتحديد خصائص كيناز لمركب اختبار داخل الخلايا الحية.

اكتشف اكتشاف العقاقير الجزيئية الصغيرة

ابق على اطلاع بأحداث Promega ومنتجاتها وأخبارها.

& نسخ 2021 Promega Corporation. كل الحقوق محفوظة.


فيم تستخدم؟

غالبًا ما يستخدم اختبار CK لتشخيص الإصابات والأمراض العضلية ومراقبتها. تشمل هذه الأمراض:

    وهو مرض وراثي نادر يسبب ضعف وانهيار وفقدان وظائف العضلات الهيكلية. يحدث في الغالب عند الذكور.
  • Rhabdomyolis ، انهيار سريع للأنسجة العضلية. يمكن أن يكون ناتجًا عن إصابة خطيرة أو مرض عضلي أو اضطراب آخر.

يمكن استخدام الاختبار للمساعدة في تشخيص النوبة القلبية ، وإن لم يكن كثيرًا. اعتاد اختبار CK أن يكون اختبارًا شائعًا للنوبات القلبية. ولكن وُجد أن اختبارًا آخر ، يُدعى تروبونين ، يكون أفضل في الكشف عن تلف القلب.


بروتين كيناز سي (PKC)

بروتين كيناز سي (PKC) هو AGC كيناز الذي يفسفر بقايا السيرين والثريونين في العديد من البروتينات المستهدفة. تم تحديده لأول مرة في عام 1977 في المخيخ البقري بواسطة Nishizuka وزملاؤه باعتباره بروتين كيناز الذي يفسفر الهيستون والبروتامين. منذ ذلك الحين ، تم إثبات مشاركته في العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك التطور والذاكرة والتمايز والانتشار والتسرطن. كان يُعتقد في السابق أنه بروتين واحد ، ومن المعروف الآن أن PKC يتكون من عائلة كبيرة من الإنزيمات التي تختلف في التركيب ومتطلبات العامل المساعد والوظيفة. تم تحديد عشرة أشكال إسوية من PKC ، متفاوتة في تعبير الأنسجة والتجزئة الخلوية ، مما يسمح بتفاعلات محددة مع الركائز.

تم تقسيم عائلة PKC إلى ثلاث مجموعات ، تختلف في متطلبات العامل المساعد للأنزيمات التقليدية (ج) الأشكال الإسوية PKC (تشمل α ،أنا ، βثانيًا و γ) ، التي تتطلب الكالسيوم و diacylglycerol (DAG) للتنشيط (n) PKC الأشكال الإسوية (تشمل δ ، ε ، ، و التي تتطلب DAG وأشكال غير نمطية من PKC ، وهي ζ و ι (تُعرف أيضًا باسم λ ، متماثل الفأر من PKCι البشري) التي لا تتطلب الكالسيوم ولا DAG. بروتين كيناز D (PKD) هو عائلة كيناز مميزة تم تصنيفها في الأصل على أنها مجموعة فرعية PKC (PKCμ ، PKCv). تحتوي الكينازات المرتبطة بـ PKC (PRK / PKN) على مجالات كيناز مماثلة لـ PKC. لا ترتبط هذه ارتباطًا وثيقًا بعائلة PKC نظرًا لاختلاف المجالات التنظيمية ، ومع ذلك ، يمكن اعتبارها جزءًا من عائلة PKC الفائقة.

تمتلك جميع PKCs مجال ربط الفوسفوليبيد للتفاعل الغشائي. يتكون الهيكل العام لجزيء PKC من مجال حفاز وتنظيمي ، يتألف من عدد من المناطق المحفوظة ، تتخللها مناطق من التماثل الأدنى ، المجالات المتغيرة.

يتضمن تنشيط cPKCs الانتقال من العصارة الخلوية إلى غشاء الخلية عن طريق إشراك وحدات استهداف الغشاء. في حالة cPKCs ، تؤدي الزيادة في الكالسيوم داخل الخلايا أولاً إلى تعزيز ارتباط مجال C2 بالدهون الأنيونية. يربط مجال C1 DAG (أو استرات phorbol ، نظائر DAG الوظيفية) و phosphatidylserine (PS) ، حيث يقوم بتجنيد PKCs التقليدية والجديدة للغشاء ، حيث يمكنهم الفسفرة ركائز. تعمل بروتينات التثبيت المحددة (المثبتة في مواقع معينة داخل الخلايا) على توطين الكيناز في موقع عملها. تشمل هذه البروتينات "مستقبلات C-kinase المنشط" (RACKS) ، و "مستقبلات C-kinase غير النشطة" (RICKS) ، و "A-kinase Anchoring protein" (AKAPS) ، و "الركائز التي تتفاعل مع C-kinase" (STICKS) ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لإشارات التوطين النووي (NLS) أو إشارات التصدير النووي (NES) إرسال PKC إلى النواة أو خارجها.

بعض ، إن لم يكن كل ، أشكال PKC الإسوية يمكن أن تنشطر بروتينيًا عند المفصل بين المجال التنظيمي والحفاز عن طريق البروتياز مثل الكالسيوم المنشط بالكالسيوم ، مما يولد وحدة فرعية محفزة حرة مستقلة عن العامل المساعد تُعرف باسم بروتين كيناز M (PKM). لا ينبغي اعتبار "منتج الكالباين" هذا إنزيمًا "غير منظم" نظرًا لأن إنتاجه يتم في الواقع تنظيمه عن طريق تحلل البروتين. الانقسام هو آلية تنشيط بديلة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية للأنزيمات مثل PKCδ ، والتي تحدث في عمليات مثل موت الخلايا المبرمج ، حيث يبدو أن الكاسبيسات لها أدوار مهمة.

تعرض جميع PKCs ، باستثناء isoform ، ما يسمى متواليات PEST ، وشرائح البولي ببتيد المحبة للماء المخصب بالبرولين (P) ، وحمض الجلوتاميك (E) ، والسيرين (S) والثريونين (T) ، والتي تستهدف البروتينات للتحلل بواسطة البروتيازوم. يظهر مستوى إضافي من التعقيد بعد الملاحظة التي تفيد بأن نزع الفسفرة من PKCs المنشط يجعلهم على ما يبدو عرضة للانتشار والتدهور. لذلك ، يتم تنظيم تقليل تنظيم PKC أيضًا بواسطة الفوسفاتازات و ligases اليوبيكويتين.

تتم معالجة الأشكال الإسوية PKC بواسطة ثلاثة فسفورات تمهيدية مرتبة. يتم تحفيز الفسفرة الأولى بواسطة كيناز المعتمد على الفوسفوينوزيتيد (PDK-1) ويحدث في حلقة التنشيط (T500 في PKCβثانيًا). يؤدي هذا الفسفرة إلى تشغيل نوعين من الفسفرة عند الطرف الكربوكسي (T641 و S660 in βثانيًا). يؤدي كل حدث فسفرة إلى تغييرات توافقية في جزيء PKC مما يؤدي إلى تغيير الاستقرار الحراري ومقاومة الفوسفاتيز والكفاءة التحفيزية.

تم الحصول على أول هيكل بلوري كامل لـ PKC للشكل الإسوي الجديد. تم الحصول على المعلومات الهيكلية السابقة من بلورات المجالات التنظيمية ، ومن خلال نمذجة المجال التحفيزي باستخدام بروتين كيناز أ.

يحتوي الجدول أدناه على المُعدِّلات المقبولة ومعلومات إضافية. للحصول على قائمة بالمنتجات الإضافية ، راجع قسم & quot المنتجات المماثلة & quot أدناه.

الحواشي

أ) تم إدراج مواقع المعالجة.

ب) للحصول على قائمة مفصلة بالشركاء الملزمين ، انظر المرجع: Poole، AW، et al. "البروتينات المتفاعلة مع PKC: من الوظيفة إلى الصيدلة." اتجاهات علم فارماكول ، 25, 528-535 (2004).

ج) تسلسل موقع الركيزة الزائفة PKCα RFARKGALRQKNVHEVKDH. تسلسل موقع الركيزة الزائفة PKCε PRKRQGAVRRRVHQVNGH (التي تحتها خط هي مواقع قابلة للتغيير للمخلفات القابلة للفوسفور). ركائز غير محددة في جميع الأشكال الإسوية.

د) منشط دهون محدد لـ aPKCs غير معروف. أقل ما يُعرف عن المنشطات / الركائز / مثبطات aPKCs من nPKCs من cPKCs. المنشطات لم تحدد على جميع الأشكال الإسوية.

ه) يعرض GF 109203X (Gö 6850 aka BIM 1) ترتيب رتبة الفاعلية α & gtβI & gtε & gtδ & gtζ. Bisindolylmaleimides (مركبات Ro ، BIM 1 ، Gö 6976) يثبط كل PKCs في ترتيب الفعالية من cPKCs و gtnPKCs و gtaPKCs (بشكل عام) Calphostin C يثبط موقع DAG في المجال التنظيمي BIM 1 وتعمل مركبات Ro في موقع ATP كلوريد Chelerythrine يثبط مجال الركيزة في الحفاز.

الاختصارات

AKAP: بروتين A-Kinase
أبرينوكارسين: ISIS 3521
Cdk2: كيناز يعتمد على Cyclin 2
CGP41251: (PKC412): مشتق ستوروسبورين
CGP54345: التناظرية ATP
CGP53506: N- (3-Nitrophenyl) -4- (3-pyridyl) -2-pyrimidinamine
eEF-1α: عامل استطالة حقيقيات النوى -1 α الببتيد ، المخلفات 422-443.
جو 6976: 5،6،7،13-Tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo [2،3-a] pyrrolo [3،4-c] carbazole-12-propanenitrile
جو 6983: 2- [1- (3-Dimethylaminopropyl) -5-methoxyindol-3-yl] -3- (1H-indol-3-yl) مالييميد
GF 109203X: 3- [1- [3- (ديميثيلامينو) بروبيل] -1H-indol-3-yl] -4- (1H-indol-3-yl) -1H-pyrrole-2،5-dione (Gö6850)
شفة: بروتين PKC 1 المتفاعل مع البروتين المتفاعل PKC
LY-333531: 9 - [(Dimethylamino) methyl] -6،7،10،11-tetrahydro- (9S) -NH، 18H-5،21: 12،15-dimetheno-dibenzo [e، k] pyrrolo [3،4-h ] [1،4،13] oxadiazacyclohexadecine-18،20 (19H) dione
K252a: قلويد Staurosporine ذات الصلة
ماركس الببتيد: ركيزة C-kinase الغنية بالألانين Myristoylated ، Ac-phe-lys-lys-ser-phe-lys-leu-NH2
MBP: بروتين المايلين الأساسي
رقم 15437: S-2،6-Diamino-N - [[1 '- (1''oxotridecyl) -2'-piperidinyl] ميثيل] هكساناميد ثنائي هيدروكلوريد
PB1: مجال ربط Phox و Bem1p
المساعد الشخصي الرقمي: Phorbol 12، 13 ثنائي أسيتات
PDBu: Phorbol 12 ، 13 ديبوتيريت
PDD: Phorbol 12، 13-ديكانوات
بليكسترين: الصفائح الدموية والكريات البيض C-kinase بروتين الركيزة
سلطة النقد الفلسطينية: Phorbol 12-myristate 13-acetate
ملاحظة: فوسفاتيديل سيرين
رف: مستقبلات C-Kinase المنشط
Ro 31-7549: 2- [1-3 (أمينوبروبيل) إندول-3-يل] -3 (1-ميثيل-1H-إندول-3-يل) مالييميد
Ro 31-8220: 2- <1- [3- (Amidinothio) propyl] -1H-indol-3-yl> -3- (1-methylindol-3-yl) -maleimide)
STAT: محولات الإشارة ومنشطات النسخ
عصا: الركائز التي تتفاعل مع C-Kinase
سينتيد 2: H-pro-leu-ala-arg-thr-leu-ser-val-ala-gly-leu-pro-gly-lys-lys-OH
TPA: خلات تيترا بوربول
UCN-01: 7-هيدروكسي ستوروسبورين
أزيز: بروتين متفاعل PKC زيتا

ص: جرذ
ح: بشر
م: الفأر
rb: أرنب


محتوى قاعدة البيانات

حددنا 31 نوعًا مختلفًا من الأدلة التجريبية ذات الصلة بتحديد أهداف كيناز بتنسيق مصنف هرمي ، أولاً من خلال فئات الإنتاجية العالية أو منخفضة الإنتاجية ، ثم تصنيفها الفرعي حسب الأدلة الفيزيائية والكيميائية الحيوية والجينية والظاهرية (الشكل S2 في ملف إضافي 2). تم استخراج البيانات المدخلة لجميع فئات HTP بكميات كبيرة من المنشورات المقابلة ، بينما تم إدخال أدلة LTP ، المتعلقة بمقايسات الفسفرة المحددة ، مباشرة من قبل مجموعة من القيمين الخبراء (الشكل 1).

لقد استخرجنا المقالات ذات الصلة لكل كيناز من PubMed من خلال البحث تاريخيًا في كل مقالة منشورة تتعلق بالاستعلام kinase. قمنا بعد ذلك بمقارنة معلوماتنا ببيانات من BioGRID لاستخراج منشورات إضافية ربما فاتتنا أثناء عملية التنظيم. تم مسح أكثر من 5000 منشور حتى أغسطس 2010 لتفاعلات LTP kinase وتم إدخال جميع الإدخالات مع PMIDs المقابلة. تم إجراء عمليات الدعم أيضًا بناءً على تعاريف الأدلة التجريبية الموضحة على الموقع الإلكتروني تحت كل فئة محددة (الشكل S1 في ملف إضافي 2).

عملية التنظيم

تم إدخال التفاعلات ثنائية الاتجاه (على سبيل المثال ، التفاعلات الفيزيائية والتفاعلات المميتة الاصطناعية) في كلا الاتجاهين ، بينما تم إدخال التفاعلات أحادية الاتجاه (على سبيل المثال ، التفاعلات الكيميائية الحيوية ، والقمع الاصطناعي) فقط عندما يكون النمط الظاهري مرتبطًا بوضوح كيناز معين. تم إدخال الدليل على التفاعلات بين الكينازات والجينات أو البروتينات الأخرى مع PMIDs المرتبطة ("تفاعل جين الكيناز") ، بما في ذلك المؤلف الأول وسنة النشر. تمت إضافة الاتجاه كملاحظات عند الاقتضاء (على سبيل المثال ، الجرعة المميتة) كما تم وصف التفاعلات الأليلية المحددة والتصميم التجريبي بمزيد من التفصيل في قسم الملاحظات من قبل المنسق. لم يتم تنسيق البيانات البيوكيميائية المتعلقة بالمنظمات الأولية للكينازات. إذا لم تظهر البيانات المتعلقة باستنتاج في المنشور أو المواد التكميلية ، فإن الدليل لا يعتبر صالحًا للدخول في قاعدة البيانات. في حالة وجود أكثر من منشور يدعم نفس التفاعل ، يتم إدخال كل PMID بشكل منفصل. بالنسبة للكينازات المعتمدة على السيكلين مع وحدات فرعية تنظيمية متعددة ، تم أيضًا تنسيق السيكلين المرتبط إذا تم تحديده في الأدبيات. تم تزويد كل أمين بمبادئ توجيهية مفصلة للحفاظ على الاتساق وتم تعيين مجموعة من kinases لتنسيق الأدب. ومع ذلك ، في حالة احتواء المنشور على معلومات لأكثر من كيناز واحد أو بين زوج كيناز ، يتم إدخال البيانات في KID لجميع kinases من ورقة واحدة لتقليل أخطاء التنظيم من خلال عمليات التدقيق الداخلي.

تقييم الجودة لكل فئة تجريبية وتحديد درجات KID

لتقييم جودة كل فئة تجريبية فردية في تحديد أزواج ركيزة كيناز ، استخدمنا طريقة تسجيل بسيطة لتقييم احتمالية أن تحدد فئة الاهتمام زوجًا حقيقيًا من ركيزة كيناز بدلاً من إيجابية خاطئة. قمنا بتجميع مجموعة تدريب إيجابية من تفاعلات ركيزة كيناز ، تم اختيارها من قبل القيمين على المعارض بناءً على المعايير التالية من الأدبيات منخفضة الإنتاجية: 1) تفاعل مادي محدد بين زوج الركيزة كيناز 2) قدرة كيناز على فسفوريلات الركيزة في المختبر 3) قدرة كيناز على فسفرة الركيزة في الجسم الحي و 4) ما إذا كان موقع أو تأثير حدث الفسفرة معروفًا (الجدول S3 في ملف إضافي 1). تتضمن مجموعة التدريب الإيجابية 121 تفاعلًا لـ 40 كيناز وهي غير منحازة لأي فئة تجريبية معينة. قارنا تكرار التفاعلات في كل فئة تجريبية بالتردد المتوقع في مجموعة تدريب سلبية ، والتي حددناها على أنها تفاعلات بروتين كيناز من غير المرجح أن تمثلها حسن النية تفاعلات الركيزة كيناز. للقيام بذلك ، كان علينا حساب تكرار نقطة بيانات تجريبية في كل فئة في مجموعة من البروتينات التي ليست ركائز. نظرًا لأننا نادرًا ما نعرف البروتينات التي ليست ركائز كيناز معين ، فإن تحديد مجموعة سلبية يمثل تحديًا. للحصول على عدد نقاط البيانات التجريبية ، استخدمنا بشكل متحفظ جميع البيانات التجريبية الموجودة في KID والتي لم تكن جزءًا من مجموعة التدريب الإيجابية. لحساب التردد النسبي في مجموعة التدريب السلبية ، احتجنا لقسمة هذه القيمة على حجم مجموعة التدريب السلبية. من حيث المبدأ ، سيكون هذا هو مساحة التفاعل الإجمالية (كل كينازات مضروبة في جميع الجينات) مطروحًا منها مجموعة الكل حسن النية تفاعلات الركيزة البروتين كيناز. ومع ذلك ، من الناحية العملية ، لا تأخذ معظم مجموعات البيانات عينة من مساحة التفاعل بأكملها (على سبيل المثال ، HTP في المختبر فحوصات كيناز) والمجموعة السلبية يجب تطبيعها لتعكس ذلك. لذلك ، اعتبرنا أن حجم مجموعة التدريب السلبي لـ HTP هو خمس مساحة التفاعل الإجمالية (خمس مرات عدد الكينازات مضروبًا في عدد الجينات). يجب أيضًا تعديل حجم مجموعة التدريب السلبي لفئات LTP باستخدام نفس الأساس المنطقي لأن تجارب LTP قد أخذت عينات أقل من مساحة التفاعل بأكملها. لتحديد حجم مجموعة التدريب السلبي LTP ، قمنا بحساب نسبة عدد التفاعلات الموضحة بواسطة تجارب LTP إلى عدد التفاعلات التي تظهرها تجارب HTP ، وقللنا حجم مجموعة التدريب السلبي لفئات LTP بهذه النسبة (HTP مجموعة التدريب السلبية مضروبة في النسبة). لذلك ، نفترض أن تجارب HTP و LTP لها قوة مكافئة لاكتشاف تفاعلات ركيزة كيناز ، لكن تجارب HTP تستكشف مساحة أكبر بكثير. من خلال إجراء هذه التعديلات على مجموعات التدريب السلبية ، نعتقد أن النتيجة تمثل مقياسًا غير متحيز نسبيًا لإثراء نجاح كل فئة في تحديد مجموعة التدريب الإيجابية لدينا.

يتم تعريف الوزن لكل فئة على أنه نسبة السجل لتكرار فئة معينة من التجارب التي تدعم زوجًا من ركيزة كيناز من مجموعة التدريب الإيجابية مقارنة بالمجموعة السلبية. على سبيل المثال ، إذا حددت فئة تجريبية معينة 50٪ من مجموعة التدريب الإيجابية ولكن 10٪ من مجموعة التدريب السلبية ، فإن درجة هذه الفئة ستكون تقريبًا سجل (50/10). نحن نمثل مجموعة التدريب الإيجابية على أنها المصفوفة G ، حيث Gي ، أنا = 1 ، إذا أبلغت الفئة التجريبية الأولى عن تفاعل بين زوج الركيزة j th kinase. يتم تعريف مجموعة التدريب السلبية بالمثل على أنها Rي ، أنا، حيث R هي مجموعة التدريب السلبي على HTP أو LTP. وبالتالي فإن النتيجة هي:

أين نر ونجي هي أحجام مجموعات التدريب الإيجابية والسلبية التي تمت مناقشتها أعلاه. تمت إضافة عدد واحد (1) لكل فئة كعدد زائف في المجموعة الإيجابية. في المجموعة السلبية ، نرجي تمت إضافته كعد زائف ، للتأكد من أن نسبة الملاحظات التجريبية إلى حجم معين كانت هي نفسها في الإيجابيات والسلبيات ، Sأنا = 0 لهذه الفئة. تم استخدام نسبة احتمالية مماثلة مؤخرًا بواسطة Yu وآخرون. [27] ، بدون العد الزائف أو مجموعة التدريب السلبية الطبيعية. بالنسبة لزوج الركيزة المفترض للكيناز j ، يتم تحديد درجة KID على النحو التالي:

أين ساي جاي = 1 عندما تم الإبلاغ عن التجربة الأولى لزوج الركيزة المفترض للكيناز.

من أجل حساب ص- قيم التفاعلات المسجلة ، قمنا بتجميع الأدلة بشكل عشوائي في كل فئة تجريبية في قاعدة البيانات وسجلنا قاعدة البيانات العشوائية. تم استخدام توزيع النقاط الناتج للحصول عليها ص-القيم.

في الشكل 2 ، بالنسبة لمنحنى ROC مع BioGRID ، نظرنا فقط في الإيجابيات التي كانت موجودة في أي من مجموعتي البيانات عند حساب المعدل الإيجابي الحقيقي.

في الشكل 5 ، على الرغم من أن إثراء الطي لكل مجموعة بيانات مشابه لنظام التسجيل لدينا ، لا يلزم تقدير مساحة التفاعل التي تم أخذ عينات منها لأن معظم مجموعات البيانات تشير إلى عدد التفاعلات التي تم اختبارها ، باستثناء بيانات التفاعل المادي التي تم جمعها باستخدام تقنيات قياس الطيف الكتلي ، والتي من أجلها افترضنا التغطية الكاملة. تم تعديل حجم مجموعة التدريب السلبي لمطابقة تغطية مساحة التفاعل المبلغ عنها (عدد الكينازات المختبرة مضروبة في عدد الجينات المختبرة). نلاحظ أن تسجيل كل فئة تجريبية هو تقدير بينما الإثراء لكل مجموعة بيانات دقيق.

مخطط KID

يلخص الشكل S6 في الملف الإضافي 2 المخطط العام لـ KID ، الذي يحتوي على تكوين للواجهة الخلفية والأمامية. تتم إدارة الواجهة الخلفية من خلال لوحة تحكم مستخدم داخلية يديرها العديد من المنسقين. يستخدم المنسقون مخطط قاعدة بيانات علائقية يفرض إدخالات متسقة ، بحيث يمكن لكل فرد أن يلاحظ تلقائيًا الإدخالات السابقة من قبل القيمين الآخرين على أي زوج من جين كيناز / بروتين. يسمح النظام بالتعديل المباشر أو الإزالة أو إضافة المزيد من الأدلة التجريبية والتحقق الداخلي المتبادل من قبل القيمين. يتم بعد ذلك تجميع التفاعلات المنظمة في جدول تفاعل واحد يتم استخدامه ، عند إدخال البيانات أو تعديلها ، لمعايرة وظيفة النتيجة تلقائيًا لكل فئة وإنشاء نسخ احتياطية كاملة لقاعدة البيانات. أيضًا ، يتم تسجيل كل تعديل أمين المتحف تلقائيًا لأغراض إدارية. تستعلم الواجهة الأمامية لقاعدة البيانات عن مخطط قاعدة البيانات العلائقية عبر Ajax للسماح بالتغذية المرتدة السريعة للمعلومات المطلوبة. يسمح نظام الاستعلام بفلترة قاعدة البيانات بأكملها بناءً على إدخالات متعددة في مجموعات مختلفة (الشكل S1 في ملف إضافي 2). ثم يتم تحليل الاستعلام بواسطة الخادم لتحديد مجموعة التفاعلات المطلوبة ، والتي يتم عرضها بدورها مباشرةً بواسطة واجهة KID. يمكن تنزيل هذا الناتج الناتج كنسخة محددة بعلامات جدولة أو ملف شبكة متوافق مع Cytoscape ، أو عرضه مباشرة كشبكة تفاعل باستخدام Cytoscapeweb [42]. يمكن عرض قائمة بجميع تفاعلات قاعدة البيانات في ملف إضافي 3.

ارتباطات كينازات بناءً على أهدافها

قمنا بتجميع أهداف جميع الكينازات ضمن معيارنا الذهبي (قطع صارم) وأجرينا مقارنة شاملة باستخدام معامل ارتباط بيرسون. يمثل قطع الارتباط أ ص-قيمة 0.05 في ر- إحصائيات الاختبار. ثم خضعت النتائج من مقارنات الارتباط لتحليل رسومي باستخدام مخطط مرجح الحافة في Cytoscape [23]. تم إجراء تحليل الإثراء الوظيفي باستخدام FunSpec ، وهو مترجم على شبكة الإنترنت للخميرة [41].


شاهد الفيديو: الكرياتينين: نسبته الطبيعية وأهميته للكلى (كانون الثاني 2022).