معلومة

الطفرات العشوائية مقابل التطور الموجه كاستراتيجيات لتعزيز التعبير


هل يستخدم الناس الطفرات العشوائية (على سبيل المثال باستخدام الأشعة فوق البنفسجية) لتوليد متغيرات مضيفة لها تعبير عالٍ عن مستقلب / إنزيم؟ لقد رأيتها مذكورة كاستراتيجية لكنها تحيرني بسبب ذلك.

كيف يقارن ذلك باستخدام Directed Evolution لنفس الغرض؟ حدسيًا ، يبدو أن الطفرات العشوائية غير فعالة للغاية (نظرًا لعدم قدرتك على التحكم في الجينات التي تغيرها) نظرًا للانفجار التوافقي حتى في شيء مثل حجم جينوم إي كولي. هل أخطأت في هذا المنطق؟

ما هي المواقف التي قد يفضل فيها المرء الطفرات العشوائية على التطور الموجه؟ هل هناك أي إيجابيات وسلبيات يجب مراعاتها؟


حسنًا ، لقد ذكرت ذلك بالفعل. الطفرات العشوائية (مع الأشعة فوق البنفسجية أو المطفرات الكيميائية) تستهدف الجينوم بأكمله وأنت تختار الكائن الحي لبعض السمات.

في تجربة التطور الموجه ، أنت تستهدف فقط جينًا أو مجموعة جينات. مع تقدم البيولوجيا التركيبية ، قد يكون من الممكن تصنيع جينومات صغيرة (سبق أن أظهرها كريج فينتر والمجموعة) وتطبيق منهجية التطور الموجه على نطاق واسع. هذا لا يزال غير موجه ، لأن الطفرات في الواقع عشوائية على الجينوم.

تعتمد الإيجابيات والسلبيات على ما تهدف إلى القيام به بالضبط.


الطفرات العشوائية المستهدفة للجينات النباتية باستخدام محررات قاعدة السيتوزين والأدينين المزدوجة

يمكن تطبيق طفرات التشبع المستهدفة لجينات المحاصيل لإنتاج متغيرات جينية مع تحسين الأداء الزراعي. ومع ذلك ، فإن أدوات التطور الموجه للجينات النباتية ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ أو خلط الحمض النووي ، محدودة 1. قمنا بتصميم خمسة محررات مشبعة مستهدفة للطفرات الذاتية (STEMEs) يمكنها توليد طفرات جديدة وتسهيل التطور الموجه للجينات النباتية. في بروتوبلاستس الأرز ، قام STEME-1 بتحرير السيتوزين والأدينين في نفس الموقع المستهدف بكفاءة C & gt T تصل إلى 61.61٪ وكفاءة C & gt T و A & gt G المتزامنة تصل إلى 15.10٪. تم استخدام STEME-NG ، الذي يشتمل على متغير الزخرف المجاور لـ Nickase Cas9-NG ، مع 20 دليل فردي من الحمض النووي الريبي في بروتينات الأرز لإنتاج طفرات شبه مشبعة (73.21٪) لجزء 56-amino-acid من أسيتيل الأرز. - أنزيم أ كربوكسيلاز (OsACC). طبقنا أيضًا STEME-1 و STEME-NG للتطور الموجه لـ OsACC الجين في الأرز وحصل على طفرات مقاومة مبيدات الأعشاب. ستعمل هذه المجموعة المكونة من اثنين من عناصر STEME على تسريع تطوير السمات ويجب أن تعمل في أي نباتات قابلة للتحرير المستند إلى CRISPR.


الطفرات العشوائية مقابل التطور الموجه كاستراتيجيات لتعزيز التعبير - علم الأحياء

في هندسة التخليق الحيوي للمنتجات الطبيعية ، تعتبر هندسة البروتين أمرًا بالغ الأهمية لتعديل خصائص الإنزيمات أو أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيًا.

حسنت هندسة البروتين التخليق الحيوي للمنتجات الطبيعية من خلال تعزيز النشاط الأنزيمي ، وتوحيد مجمعات الإنزيمات ، وتحسين استقرار البروتين ، وهندسة أجهزة الاستشعار من أجل فحص أفضل أو تنظيم ديناميكي.

يمكن أن ينتج عن هندسة البروتينات الموجودة متغيرات ذات وظائف تحفيزية جديدة. تعمل هذه التطورات على توسيع نطاق المنتجات وبالتالي تنويع التخليق الحيوي للمنتجات الطبيعية.

كانت البروتينات الموجودة في الطبيعة تقليديًا هي المحفزات الحيوية الأكثر استخدامًا لإنتاج العديد من المنتجات الطبيعية التي تتراوح من المواد الكيميائية السلعية إلى المستحضرات الصيدلانية. برزت هندسة البروتين كأداة قوية للتكنولوجيا الحيوية في تطوير الهندسة الأيضية ، لا سيما في مجال التخليق الحيوي للمنتجات الطبيعية. في الآونة الأخيرة ، أصبحت هندسة البروتين طريقة مفضلة لتحسين النشاط الأنزيمي ، وزيادة استقرار الإنزيم ، وتوسيع أطياف المنتج في التخليق الحيوي للمنتج الطبيعي. تلخص هذه المراجعة التطورات الحديثة والاستراتيجيات النموذجية في هندسة البروتين ، مع تسليط الضوء على الدور الأساسي لهندسة البروتين في تحسين وتنويع التخليق الحيوي للمنتجات الطبيعية. آفاق المستقبل وتوجهات البحث تناقش أيضا.


الملخص

أصبحت Bioprocess ، وهي تقنية قائمة على التحفيز الحيوي ، شائعة في العديد من مجالات البحث ويتم تطبيقها على نطاق واسع في التصنيع الصناعي. ومع ذلك ، فإن التحويل البيولوجي المنخفض ، والإنتاجية المنخفضة ، والتكاليف المرتفعة أثناء العمليات الصناعية هي عادة القيود في المعالجة الحيوية. لذلك ، تم تطوير العديد من استراتيجيات الحفاز الحيوي لمواجهة هذه التحديات في السنوات الأخيرة. في هذه المراجعة ، نناقش أولاً استراتيجيات هندسة البروتين ، التي ظهرت لتحسين نشاط التحفيز الحيوي للمحفزات الحيوية. بعد ذلك ، نلخص استراتيجيات هندسة التمثيل الغذائي التي تعزز تطوير مصانع الخلايا الميكروبية. بعد ذلك ، نوضح ضرورة استخدام استراتيجية الجمع بين هندسة البروتين وهندسة التمثيل الغذائي للمحفزات الحيوية الفعالة. أخيرًا ، تتم مناقشة وجهات النظر المستقبلية حول تطوير وتطبيق استراتيجيات الحفاز الحيوي الجديدة. توفر هذه المراجعة إرشادات نظرية لتطوير عمليات حيوية فعالة ومستدامة واقتصادية بوساطة محفزات حيوية جديدة.


الاستنتاجات

لقد تسارع التقدم نحو علاجات ذات مغزى لاضطرابات النمو العصبي بشكل كبير خلال السنوات القليلة الماضية. تُنتج العلاجات الجينية AAV الموجهة من الجهاز العصبي المركزي ، وخاصة العلاجات التي تستخدم AAV9 ، نتائج واعدة قبل السريرية ، خاصة عندما يتم تقديمها في وقت مبكر من مسار المرض ، ويتم ترجمتها بشكل متزايد من مقاعد البدلاء إلى التجارب السريرية للمرحلة الأولى. ستساعد زيادة البحث لفهم البيولوجيا الكامنة وراء اضطرابات النمو العصبي بشكل كبير في تحديد أنواع الخلايا ذات الصلة ونماذج العلاج. عندما يقترن بالتحسينات المستمرة في تصميم البناء وإنشاء متغيرات AAV جديدة مع إمكانات استهداف محددة ومحسّنة ، هناك أمل كبير في علاج حتى الاضطرابات المعقدة. مع انتقال العلاجات إلى الممارسة السريرية ، ستكون الجهود المبذولة لمنع الاستجابات المناعية المثبطة مجالًا مهمًا للتركيز. إن العمل على فهم المناعة المضادة للعلاج في الجانب قبل السريري والمراقبة الدقيقة أثناء التجارب السريرية سيوفر بلا شك ثروة من البصيرة ويساعد في التركيز على تطوير علاجات آمنة وفعالة للغاية.


أساليب

سلالات ونواقل التعبير

تم التعبير عن D2-BGL بتنسيق بيتشيا باستوريس SMD 1168 (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو في خميرة الخميرة ATCC 4،014،317. تم استخدام البلازميدات pGAPZαC مع علامة مقاومة Zeocin و YEp352 مع علامة مساعدة URA3 (مقدمة من البروفيسور فرانسيس أرنولد ، قسم الكيمياء ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) للتعبير عن الإنزيم المؤتلف في P. باستوريس و S. cerevisiae، على التوالى. يحتوي هذان البلازميدان على ببتيد إشارة إفراز عامل التزاوج ألفا قبل D2-BGL لإفراز البروتين. تم إنشاء متجه التعبير pGAPZαC-D2 كما هو موصوف في دراسة سابقة [20] ، بينما تم إنشاء متجه التعبير YEp-D2 عن طريق استنساخ منتج PCR لـ D2-BGL في بلازميد YEp352.

تعبير غير متجانس لـ D2-BGL في الخميرة

P. باستوريس تم تحضير الخلايا المختصة بواسطة طريقة أسيتات الليثيوم - ديثيوثريتول المعدلة (LiAc – DTT) [34]. تم تحويل أربعمائة نانوجرام من pGAPZαC-D2 ، خطيًا باستخدام إنزيم التقييد BspHI ، إلى P. باستوريس بواسطة electroporation. تم اختيار المحولات على ألواح YPDS (1٪ مستخلص الخميرة ، 2٪ ببتون ، 2٪ جلوكوز ، 1 مولار سوربيتول و 20 جم / لتر أجار) مكمل بـ 100 ملجم / لتر زيوسين (Invivogen ، تايوان). لتعبير D2-BGL في ثقافة القارورة ، تم تلقيح مستعمرة واحدة في 3 مل من وسط YPD (1٪ مستخلص الخميرة ، 2٪ ببتون ، 2٪ جلوكوز) مع زيوسين ثم حضنت عند 30 درجة مئوية طوال الليل عند 250 دورة في الدقيقة. تم تلقيح هذه الثقافة المسبقة في 50 مل من وسط YPD باستخدام OD الأولي600 تم ضبط القيمة على 0.05 ، ثم احتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام عند 250 دورة في الدقيقة.

خميرة الخميرة تم تحضير الخلايا المختصة وتحويلها باستخدام م. مجموعة أدوات تحويل EasyComp ™ (ThermoFisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحويل مائة نانوجرام من Yep-D2 إلى S. cerevisiae، ثم تم اختيار المحولات على أطباق YNB – Ura التي تحتوي على 6.7 جم / لتر من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية (Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، و 0.77 جم / لتر- Ura DO الملحق (Clontech ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 2٪ جلوكوز و 20 جم / لتر أجار ، الرقم الهيدروجيني 5.8. لتعبير D2-BGL ، تم تلقيح مستعمرة واحدة في 4 مل من وسط SDCAA يحتوي على 6.9 جم / لتر قاعدة نيتروجين خميرة ، 5 جم / لتر حمض كازامينو باكتو (BD ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 5.4 جم / لتر Na2ص4، 8.56 جم / لتر NaH2ص4· ح2O و 20 ميكروغرام / مل L-tryptophan (Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية) [35] ، ثم حضنت عند 30 درجة مئوية طوال الليل عند 250 دورة في الدقيقة. تم تلقيح هذه الثقافة المسبقة في 40 مل من وسط SDCAA باستخدام OD الأولي600 تم تعديل القيمة إلى 0.1 ، ثم احتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة يومين عند 250 دورة في الدقيقة.

الطفرات موقع الموجه

تم إنشاء طفرات النقطة في D2-BGL باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة من موقع QuikChange Lightning (Agilent ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام 20 نانوغرام من البلازميد كقالب وأشعال متتالية (ملف إضافي 1: TableS2). بدأ PCR بخطوة تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 18 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية والتمديد عند 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، والتفاعل تم الانتهاء بعد خطوة التمديد النهائية عند 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم التخلص من قالب البلازميد عن طريق هضم إنزيم تقييد DpnI عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، وتم تحويل منتج PCR المتبقي إلى بكتريا قولونية سلالة DH5α.

الطفرات العشوائية باستخدام ePCR

تم إنشاء مكتبة متحولة وعرضها في S. cerevisiae باتباع نسخة معدلة من نهج التطور الموجه [36]. تم خطي متجه التعبير YEp-D2 عن طريق هضم إنزيم التقييد لإزالة تسلسل D2-BGL. تم إنشاء تسلسل D2-BGL المتحور باستخدام ePCR مع 100 نانوغرام من YEp-D2 كقالب في 100 ميكرولتر من محلول PCR الذي يحتوي على 0.2 ملي مولار dNTP ، 0.1 ميكرومتر Sc ePCR F التمهيدي ، 0.1 ميكرومتر Sc ePCR R التمهيدي المضاد ، 0.5 ملي MgCl2، 0.2 ملي MnCl2 و 5 U GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية). أنتجت الاشعال Sc ePCR F و Sc ePCR R (ملف إضافي 1: TableS2) مناطق متداخلة من 41 زوجًا أساسيًا (bp) و 47 نقطة أساس مع متجه yEP الخطي عند الأطراف 5 و 3 من منتجات ePCR ، على التوالي. بدأ ePCR بخطوة تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 28 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، التلدين عند 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، والتفاعل تم الانتهاء بعد خطوة التمديد النهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تمت تنقية كل من منتجات YEp الخطية و ePCR باستخدام QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN ، ألمانيا).

فحص مكتبة متحولة

لإنشاء مكتبة متحولة D2-BGL بتنسيق S. cerevisiae، كميات متساوية (

45 fmol) من منتجات YEp و ePCR الخطية معًا إلى 40 ميكرولتر من الخلايا المختصة ، وتم اختيار المحولات على ألواح YNB-Ura عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام. تم عزل المستعمرات المفردة وتلقيحها بشكل فردي في آبار صفيحة عميقة 96 تحتوي على 50 ميكرولتر من وسط SDCAA في كل بئر. تم تلقيح المحولات الناتجة عن منتجات PCR من النوع البري D2-BGL في عمود من ثمانية آبار لتكون بمثابة عنصر تحكم إيجابي. بعد فترة حضانة لمدة يومين ، تمت إضافة 300 ميكرولتر من وسط SDCAA إلى كل بئر وتم تلقيح اللوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام أخرى. لفحص طفرات D2-BGL ، تم خلط 50 ميكرولتر من طاف الثقافة مع 50 ميكرولتر من 4 مم ص-نيتروفينيل بيتا- د- جلوكوبيرانوسيد (صNPG) في لوحة 96 بئر. تم تقييم نشاط الإنزيم عند 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من 1 مولار الصوديوم.2كو3. قيم التطوير التنظيمي405 تم قياسها باستخدام قارئ الأطباق الرفيعة SynergyMx (BioTek ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب المتوسط ​​(AVE) والانحراف المعياري (STDEV) لآبار التحكم الإيجابي (WT) لكل لوحة. المحولات مع OD405 & GT (AVEWT + 2 × STDEVWT) في صفائح YNB – URA جديدة. تم استخراج البلازميدات من طفرات D2-BGL المحسّنة باستخدام مجموعة Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II (ZYMO RESEARCH ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إخضاع المحولات المختارة لثقافة القارورة ، واستخدمت المواد الطافية للثقافة لفحص نشاط السيلوبايز.

تحليلات تسلسل البروتين وهيكله

محاذاة متعددة من β-glucosidases من Chaetomella raphigera D2-BGL (كود PDB: 6JXG) ، Aspergillus aculeatus BGL1 (كود PDB: 4IIH) ، الرشاشيات النيجر BGL1 (GenBank: RDH24713.1) ، الرشاشيات النيجر ASKU28 (GenBank: AFW98805.1) و Trichoderma reesei (PDB: 4I8D) تم إجراؤه باستخدام Clustal Omega [37]. تم بناء نماذج هيكلية للطفرات D2-BGL F256Y و F256M باستخدام SWISS-MODEL [38]. تم تصور الهياكل البلورية ثلاثية الأبعاد للبروتين باستخدام نظام الرسومات الجزيئية PyMOL v2.2.3 (Schrodinger ، LLC).

تنقية الإنزيم بواسطة كروماتوغرافيا تقارب المناعة

تم إجراء كروماتوجرافيا تقارب مناعي باستخدام عمود تدفق الجاذبية اللوني Poly-Prep (Biorad ، الولايات المتحدة الأمريكية) مملوء براتنج Sepharose 4B المنشط CNBr المنشط 1 مل (GE Healthcare Bio-sciences AB ، السويد) مقترنًا بمضاد D2 المنقى. - الأجسام المضادة لـ BGL (LTK BioLaboratories ، تايوان). لتحضير العينات ، 100 مل S. cerevisiae طاف الثقافة أو 30 مل P. باستوتم ترشيح طاف استنبات الريس من خلال 0.2 ميكرومتر من مرشحات قرصية سوبور الغشائية (PALL ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تركيز المادة الطافية إلى 1 مل باستخدام عمود Vivaspin 20 MWCO 30000 (GE Healthcare ، المملكة المتحدة) ، وتم إجراء تبادل المخزن المؤقت ثلاث مرات باستخدام 19 مل من المخزن المؤقت للربط (20 ملي فوسفات الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7). تم تخفيف العينة النهائية إلى 10 مل باستخدام محلول ملزمة. بدأ التنقية بخطوة موازنة باستخدام 10 مل من محلول الربط. بعد حقن العينة ، تم غسل العمود باستخدام محلول منظم للربط 30 مل. تم إجراء الشطف باستخدام محلول شطف 15 مل (0.1 مولار جليكاين ، ودرجة الحموضة 2.7) ، قبل إضافة 700 ميكرولتر من محلول معادل (1 م تريس ، الرقم الهيدروجيني 9). تم تبادل محلول البروتين المنقى وتركيزه باستخدام عمود Vivaspin 6 MWCO 10000 مع محلول 50 ملي أسيتات الصوديوم (NaOAc ، درجة الحموضة 5).

إزالة الجليكوزيل عن طريق علاج Endo H.

تم إزالة جليكوسيلات Purifid D2-BGL وعينات من طاف الثقافة باستخدام endoglycosidase H (NEB ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار ، من أجل إزالة الجليكوزيل من D2-BGL المنقى ، تمت إضافة 2 ميكروغرام من Pp D2-BGL أو Sc D2-BGL إلى 10 ميكرولتر من محلول التفاعل في محلول تغيير طبيعة البروتين السكري (NEB ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد التسخين عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تم إجراء إزالة الجليكوزيل باستخدام 0.4 ميكرولتر Endo H في GlycoBuffer 3 عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. من أجل إزالة الجليكوزيل للعينات المستخدمة في تحليل النشاف الغربي ، تمت إضافة 10 ميكرولتر من مادة طافية للثقافة أو D2-BGL المنقى المسلسل المخفف (التركيز الأصلي: 0.11 مجم / مل) إلى محلول التفاعل (الحجم الإجمالي: 50 ميكرولتر) يحتوي على 0.5 ميكرولتر Endo H في GlycoBuffer 3. تم إجراء التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

فحوصات نشاط السليولاز

تم إجراء فحوصات نشاط β-Glucosidase وفقًا للطرق الموضحة في دراستنا السابقة [20]. تم تقييم التفاعل عند 5 و 10 و 20 دقيقة للتأكد من أن القياس في النطاق الخطي. باختصار ، تم تحديد نشاط بيتا جلوكوزيداز مع صNPG أو السيلوبيوز كركيزة في 50 ملي NaOAc ، الرقم الهيدروجيني 5. للحصول على صمقايسة NPGase ، تم إجراء التفاعل الإنزيمي باستخدام 100 ميكرولتر من محلول الإنزيم الممزوج بـ 100 ميكرولتر من 4 ملي مولار صNPG عند 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد إضافة 600 ميكرولتر من 1 M نا2كو3 لإيقاف التفاعل ، تم نقل 200 ميكرولتر من المحلول النهائي إلى لوحة 96 بئر ، و OD405 تم قياس القيمة باستخدام قارئ الصفيحة الرقيقة SynergyMx. تم تحديد تركيزات المنتج بناءً على منحنى قياسي تم إنشاؤه عن طريق صالتخفيف التسلسلي NP. لمقايسة cellobiase ، تم خلط 100 ميكرولتر من محلول الإنزيم مع 100 ميكرولتر من 20 ملي سيلوبيوز ، وتم إجراء التفاعل عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم إيقاف التفاعل عن طريق تثبيط الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم تحديد تركيزات الجلوكوز باستخدام محلل الكيمياء الحيوية YSI 2700 Select (Yellow Springs Instruments ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تعريف وحدة إنزيم واحدة (U) على أنها 1 ميكرولتر من المنتج (أي ، صNP أو الجلوكوز) يتم إطلاقه في الدقيقة.

تم تحديد نشاط السليلاز الكلي باستخدام ورق ترشيح 50 مجم NO.1 (Whatman ، المملكة المتحدة). تم تحديد تركيزات المنتج باستخدام طريقة حمض الساليسيليك (DNS) [39] ، وتم استخدام التخفيف التسلسلي للجلوكوز لتأسيس المنحنى القياسي لاختزال السكر. لمقايسة ورق الترشيح (FP) ، تم خلط 0.5 مل من محلول الإنزيم مع 1 مل من محلول NaOAc (pH 5) الذي يحتوي على ورق الترشيح ، وتم إجراء التفاعل عند 55 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. تم إيقاف التفاعل بإضافة 3 مل من محلول DNS ، وتم إجراء التلوين بالتسخين عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. OD540 تم قياس القيمة باستخدام قارئ الأطباق الرفيعة SynergyMx. تم تعريف وحدة ورق الترشيح (FPU) على أنها 1 ميكرولتر من تقليل السكر المنطلق في الدقيقة.

فحوصات درجة الحرارة واستقرار الأس الهيدروجيني

تم تحضين محاليل الإنزيم المحتوية على 1.2 مجم / لتر من D2-BGL المنقى عند 25-70 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لمقايسة ثبات درجة الحرارة ، وعند الأس الهيدروجيني 4-8 لمدة 24 ساعة لفحوصات ثبات الأس الهيدروجيني. تم تحديد النشاط النسبي باستخدام مقايسة cellobiase.

حركية الإنزيم

تم تحديد أنشطة محددة باستخدام 0.15 ميكروغرام من الإنزيم المنقى في 100 ميكرولتر من محلول الإنزيم (أي تركيز الإنزيم: 1.5 مجم / لتر). ال صتم إجراء اختبار NPGase عند 55 درجة مئوية لمدة دقيقتين مع 0.25-6 ملي مولار صتم إجراء اختبار NPG و cellobiase عند 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق باستخدام 0.625-100 ملي مولار من السيلوبيوز. تم تحديد تثبيط الجلوكوز عن طريق صمقايسة NPG في وجود 0 أو 5 أو 10 مم من الجلوكوز. المعلمات الحركية كم, الخامسالأعلى, كأنا الجلوكوز و كأنا الركيزة تم تحديدها باستخدام نماذج حركية الإنزيم المضمنة في Prism 8.3.0 (GraphPad Software Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية).

استخراج البروتين داخل الخلايا

تم استخلاص البروتينات داخل الخلايا من كريات الخلايا المستزرعة لمدة 3 أيام باستخدام كاشف استخراج YeastBuster (Merck ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء الاستخراج وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار ، تم استخدام 5 ميكرولتر من كاشف الاستخراج و 0.05 ميكرولتر 100X محلول فوسفين (THP) تريس (هيدروكسي بروبيل) لكل مجم من الخلية (الوزن الرطب) لإعادة تعليق بيليه الخلية. بعد إضافة 25 وحدة من نوكلياز Benzonase ، تم تحضين المحلول عند درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة تحت التقليب. تم جمع البروتينات القابلة للذوبان بعد التركيز عند 16000 جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة ، وتم تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة اختبار برادفورد المتوافقة مع المنظفات (ThermoFisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية).

النشاف الغربي

تم فصل عينات البروتين باستخدام هلام SDS-PAGE 10٪. تم إجراء النشاف الغربي باستخدام غشاء النشاف Amersham Hybond 0.2 ميكرون من البولي فينيلدين ديفلورايد PVDF (GE Healthcare Life Science ، ألمانيا) ونظام الخلايا المصغرة Trans-Blot (Bio-Rad ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد النقل عند 100 فولت و 200 مللي أمبير مع PowerPac 1000 Electrophoresis Power Supply (Bio-Rad ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 1.5 ساعة على الجليد ، تم غمر غشاء PVDF طوال الليل عند 4 درجات مئوية في محلول مانع يحتوي على 30 مل من محلول ملحي Tris Buffered (TBS) Omics Bio ، تايوان) ، 1.5 جرام من الحليب المجفف منزوع الدسم و 0.05٪ توين 20 (JTBaker ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت إضافة الأجسام المضادة في مصل مضاد D2-BGL بتخفيف 1: 30.000 في محلول الحجب ، واستمر الغمر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة أخرى. تم غسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام 30 مل من TBS-T (TBS و 0.05٪ توين 20) ، ثم تم غمر الغشاء في 10 مل من TBS-T يحتوي على 0.1 جم من مسحوق الحليب منزوع الدسم ومضاد للأرانب IgG HRP (Perkin Elmer ، الولايات المتحدة الأمريكية 1 : 10000). بعد الغمر لمدة ساعة واحدة ، تم غسل غشاء PVDF ثلاث مرات باستخدام TBS-T ، وتم الكشف عن وجود D2-BGL بواسطة التلألؤ الكيميائي باستخدام Western Lightning ECL Pro (Perkin Elmer ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم قياس كمية البروتين باستخدام برنامج التصوير ImageJ [40].

تفاعلات البلمرة المتسلسلة الكمية (QPCR)

إجمالي RNA من P. باستوريس تم عزل الخلايا التي تم جمعها بعد فترة الحضانة لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية باستخدام كاشف TRIzol (ThermoFisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استخدام ميكروجرام واحد من DNase I (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) إجمالي الحمض النووي الريبي المعالج لتوليد cDNA باستخدام SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضير محلول تفاعل qPCR باستخدام Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم إجراء التضخيم باستخدام نظام QuantStudio ™ 12 K Flex (Applied Biosystems ، الولايات المتحدة الأمريكية). ال P. باستوريس جين الأكتين (قانون 1 تم استخدام GenBank: AF216956.1) كجين مرجعي ، وتم تطبيق طريقة -2 CT لتحديد التعبير النسبي عن الجينات المرتبطة بـ D2-BGL واستجابة البروتين غير المطوية (UPR) HAC1, KAR2, PDI1, ERO1 و CNE1 (مع الاشعال المدرجة في ملف إضافي 1: TableS2).

فحوصات تكسير الكتلة الحيوية

تم توفير الكتلة الحيوية المعالجة بالأحماض من قبل معهد أبحاث الطاقة النووية (تاويوان ، تايوان). تم تقدير محتوى السليلوز في قصب السكر وقش الأرز المعالج مسبقًا بـ 44.7٪ و 48.17٪ على التوالي. تم إجراء فحوصات التكسير باستخدام تفل قصب السكر 1 أو 2 أو 5 أو 7.5٪ (وزن / حجم) في 1 مل من محلول التفاعل في أنبوب قفل آمن سعة 2 مل (إيبندورف) ، وتم تحضير محلول التفاعل ، لكل 1٪ من الكتلة الحيوية. ، مع 10 ميكرولتر توين 80 ، 0.06 FPU من C1.5L (سيغما الدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 0.3 ميكروغرام من WT D2 أو Mut M في 50 ملي مولار NaOAc (الرقم الهيدروجيني 5). تم فحص التكسير عند 50 درجة مئوية لمدة 72 ساعة وعند 250 دورة في الدقيقة. تم تحديد تركيز الجلوكوز باستخدام محلل الجلوكوز YSI 2700.


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


الملخص

في التطور التجريبي ، يطور العلماء كائنات حية في المختبر ، عادةً عن طريق تحديها في الظروف البيئية الجديدة. ما هي أفضل السبل لتطوير الصفة المرغوبة؟ هل يجب تطبيق التحدي بشكل مفاجئ وتدريجي ودوري ومتقطع؟ هل ينبغي للمرء أن يطبق الطفرات الكيميائية ، وهل السلالات ذات معدل الطفرات الفطرية العالية تتطور بشكل أسرع؟ ما هي أحجام السكان المثالية لتطور السكان؟ هناك استراتيجيات لا حصر لها ، بخلاف تلك التي يمكن أن تكشفها المعامل الفردية. لذلك قمنا بترتيب تحدٍ مجتمعي ، Evolthon ، حيث طُلب من الطلاب والعلماء من مختبرات مختلفة التطور الإشريكية القولونية أو خميرة الخميرة لضغط غير حيوي - درجة حرارة منخفضة. استكشف حوالي 30 مشاركًا من جميع أنحاء العالم أنظمة بيئية وجينية متنوعة للتطور. بعد فترة من التطور في كل مختبر ، تنافست جميع سلالات كل نوع مع بعضها البعض. في الخميرة ، كانت أنجح الاستراتيجيات هي تلك التي تستخدم التزاوج ، مما يؤكد أهمية الجنس في التطور. في البكتيريا ، استخدمت السلالة الأصلح استراتيجية تعتمد على استكشاف معدلات الطفرات المختلفة. أظهرت الاستراتيجيات المختلفة مستويات متغيرة من الأداء والاستقرار عبر تحديات وظروف إضافية. وبالتالي ، تكشف هذه الدراسة عن مبادئ النظم التطورية التجريبية الفعالة وقد تكون مفيدة أيضًا للتطورات التكنولوجية الحيوية للسلالات الجديدة وفهم الاستراتيجيات الطبيعية في سباقات التسلح التطورية بين الأنواع. يشكل Evolthon نموذجًا للاستكشاف العلمي المجتمعي الذي يشجع الإبداع والتعاون.

الاقتباس: كامينسكي شتراوس إس ، شيرمان د ، جونا جي ، بروكس إيه إن ، كونجابور إيه إم ، نجوين با إيه إيه ، وآخرون. (2019) Evolthon: مسعى مجتمعي لتطوير تطور المختبر. بلوس بيول 17 (3): e3000182. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000182

محرر أكاديمي: Laurence D. Hurst ، جامعة باث ، المملكة المتحدة

نشرت: 29 مارس 2019

حقوق النشر: © 2019 كامينسكي شتراوس وآخرون. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط ذكر المؤلف والمصدر الأصليين.

التمويل: تم دعم YP من قبل مركز Minerva للمحاكاة الحية لـ Genome Evolution AZ 5746940763 ، وكان TD مدعومًا من قبل SPP1819 التكيف السريع.

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.

الاختصارات: DREAM ، حوار للتقييمات الهندسية العكسية وطرقها iGEM ، OD للماكينة الدولية المهندسة وراثيًا ، الكثافة البصرية

الأصل: لم يتم تكليفه خارجيًا بمراجعة الأقران.


تطور أدوات الطفرات النباتية: نموذج متحرك من التحرير العشوائي إلى تحرير الجينوم المستهدف

الطفرات هي أساس كل التنوعات الجينية ، وقد استغل الاستيلاد الكلاسيكي للنباتات قوة الطفرات الطبيعية في تطوير أصناف عالية الغلة. منذ اكتشاف المطفرات الكيميائية والإشعاعية ، تم استخدام طرق الطفرات المختلفة بشكل فعال في تربية النباتات الجزيئية لدراسة وظائف الجينات ، لتحديد الطفرات الجينية الحاسمة لمنح سمات جديدة للنباتات. هنا ، نقوم بمراجعة التطور التاريخي واستخدام أدوات الطفرات النباتية ، وبشكل أساسي المطفرات الفيزيائية والكيميائية ، والطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وإدخال T-DNA ، وإدخال الترانسبوزون ، وتداخل الحمض النووي الريبي ، والنووكليازات الضخمة. الميزة الفريدة للنيوكليازات الضخمة مثل نظام CRISPR / Cas هي التحكم في تغييرات الحمض النووي الموجهة للموقع. نسلط الضوء على التطورات الأخيرة في أدوات الطفرات المستندة إلى CRISPR / Cas والتي تتيح تطبيقات مختلفة للتلاعب الجيني ، بما في ذلك الضربات الجينية ، واستبدال الجينات ، والبدائل الأساسية المستهدفة ، وتنويع النيوكليوتيدات للمواقع التي يحددها المستخدم. بالإضافة إلى ذلك ، نقوم بمراجعة استخدام أدوات الطفرات القائمة على كريسبر / كاس في الزراعة.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


المواد والأساليب

البلازميدات والسلالات والكواشف ووسائط النمو. تم إنشاء البلازميد "فريسة" pGAD424-SRC1 الذي يحتوي على مُنشِط مُنشِط مستقبل الستيرويد كامل الطول 1 (SRC-1) كما هو موصوف في المرجع. 20 وكانت هدية كريمة من Benita S. Katzenellenbogen (جامعة إلينوي). تم إدخال الأحماض الأمينية 312-595 التي تحتوي على مجال LBD و F من hERα في اتجاه مجرى مجال ربط DNA Gal4 في بلازميد pBD-Gal4-Cam "الطعم" (ستراتاجين) كما هو موصوف في المرجع. 21. تم استخدام الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) سلالة YRG2 (ستراتاجين) لهذا العمل. تم وصف استنساخ البنيات المتحولة لـ hERα LBD في ناقل تعبير الثدييات pCMV5 في المرجع. 21. كانت الوسائط الغنية المستخدمة لنمو خلايا الخميرة عبارة عن وسط مستخلص الخميرة - بيبتونيدكستروز بالإضافة إلى الأدينين (22) ، في حين كان الحد الأدنى من الوسائط الاصطناعية الكاملة (SC) المتسربة (23) التي تفتقر إلى الأحماض الأمينية المناسبة. طق تم الحصول على بوليميراز DNA من Promega و PfuTurbo تم شراء بوليميريز DNA من Stratagene. تم تصنيع 4،4′-Dihydroxybenzil كما هو موصوف في المرجع. 24. ما لم يذكر خلاف ذلك ، تم الحصول على جميع الكواشف الأخرى من Sigma-Aldrich.

Y2H الفرز القائم على النظام. تم التقاط المحولات من لوحات مكتبة الطفرات في تشبع الموقع الفردي وألواح مكتبة PCR المعرضة للخطأ باستخدام أعواد أسنان معقمة واحتضانها طوال الليل (-16-20 ساعة) عند 30 درجة مئوية في صفيحة دائرية من 96 بئر (Evergreen Scientific ، لوس أنجلوس) تحتوي على 50 ميكرولتر من الوسائط السائلة SC-Leu-Trp قليلة في كل بئر. كعنصر تحكم ، تم تلقيح بئر واحد في كل لوحة ميكروتيتر بمستعمرة خميرة تعبر عن بناء hERα LBD الأبوي. بعد هذا الحضانة طوال الليل ، 250 ميكرولتر من معقم مزدوج المقطر H2تمت إضافة O إلى كل بئر ، ثم تم نقل 5 ميكرولتر من كل مزرعة مخففة إلى الآبار المقابلة لوحيتي ميكروتر معقمتين ذات قاع مسطح 96 بئر (أدوات Rainin) تحتويان على 200 ميكرولتر من وسائط SC-Leu-Trp-His مع تركيز مناسب لأي من الليجين المستهدف (DHB) أو E.2. تم اختيار تركيزات يجند مناسبة لهذا الفحص بناءً على استجابة بنية hERα LBD الأبوية. لكل جولة من الفحص ، تم اختيار تركيز DHB حيث يستجيب بناء hERα LBD الأبوي بشكل ضعيف أو لا يستجيب على الإطلاق ، في حين أن تركيز E2 للفحص بحيث يستجيب البناء الأبوي بشكل معتدل. تم تحضين هذه الصفائح الدقيقة المحتوية على يجند عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، وبعد ذلك تم فحصها بصريًا لتحديد المسوخات ذات الاستجابة المعززة تجاه الترابط المستهدف (كثافة خلية أعلى من التحكم في الطفرات الأبوية) واستجابة ضعيفة تجاه E.2 (كثافة خلية أقل من الأصل). تم فحص مائة وتسعين متحولة لكل مكتبة طفرات تشبع باستخدام هذا النهج ، مع 95 متغيرًا للمكتبة وخميرة معبرة عن الأبوين تستخدم كعنصر تحكم لكل لوحة ميكروتيتر.

فحص جرعة يجند - الاستجابة. تم تخفيف الثقافات بين عشية وضحاها لخلايا الخميرة المناسبة في SC-Leu-Trp- الحد الأدنى من الوسائط الخاصة به إلى OD النهائي600 من 0.002. تمت إضافة قسامات (190 ميكرولتر) من هذه الثقافة المخففة إلى آبار صفيحة ميكروترية معقمة ذات قاع مسطح مكون من 96 بئرًا (Rainin Instruments) ، متبوعة بإضافة 10 ميكرولتر من يجند مركّز بشكل مناسب يتكون من تخفيف 50 ضعفًا من مخزون الإيثانول حل في SC-Leu-Trp-His الحد الأدنى من الوسائط. تم تحضين هذه الصفائح الدقيقة عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، وبعد ذلك تم خلط الثقافات عن طريق الأنابيب ، و OD600 تم أخذ القراءات باستخدام قارئ لوحة Spectramax 340PC (الأجهزة الجزيئية).

تعداء الثدييات ومقايسة Luciferase. تم وصف الطرق المستخدمة في زراعة الخلايا ، تعداء ، وأداء مقايسة لوسيفيراز في المرجع. 25.

المواد والطرق الداعمة. تم وصف إنشاء المكتبة ، واستنساخ المكتبات وتحويلها ، والنمذجة الجزيئية في المواد والطرق الداعمة، والتي يتم نشرها كمعلومات داعمة على موقع الويب PNAS.


شكل 1

الشكل 1. تقترح النمذجة الرياضية إمكانية توليد سلوك ثنائي الاستقرار بدارات التغذية المرتدة الإيجابية البادئة والمتطورة. أ) رسم تخطيطي لـ PFL تحت سيطرة إشارة OHHL (S). عامل النسخ LuxR (R) ، عند الارتباط بـ S ، يشكل مركبًا C المنشط الذي يشكل جهازًا متماثلًا ويرتبط بالمحفز صلوكس لتفعيل تعبير LuxR وإحداث ردود فعل إيجابية. يمكن نمذجة هذا النظام من خلال معادلتين بلا أبعاد: dR / dτ = α (C n / 1 + C n)) - βR - kSR + α0 dC / dτ = kSR– C. هنا ، تمثل S و R و C في المعادلات تركيزات OHHL و LuxR و C المركب على التوالي. يتم نمذجة تخليق R من خلال وظيفة Hill واحدة ، تجمع النسخ والترجمة معًا. تم ضبط معامل التل ليكون 2 ليعكس ديمرزينج السريع لـ C وربط الثنائى بـ صلوكس . α هو ثابت معدل التوليف لـ R بسبب التغذية المرتدة. α0 هو ثابت معدل التوليف الأساسي أو التأسيسي لـ R. β هل ثابت معدل التحلل لـ R. ك هو ثابت الربط لـ R مع S. لجعل النموذج بلا أبعاد ، يتم قياس الوقت فيما يتعلق بثابت معدل الانحلال لـ C ، ويتم تحجيم التركيزات فيما يتعلق بعتبة التنشيط النصفية C. تستخدم قيم المعلمات الممكنة بيولوجيًا للتشعب التحليل ، مع القيم الأساسية لـ β = 5, α0 = 1 و ك = 1. ب) يتم تحديد السلوكيات الديناميكية لـ PFL بواسطة α. عندما تكون α أكبر من القيمة الحرجة (الخط الأزرق المتقطع) ، يُظهر النظام ثباتية (الجزء العلوي الداخلي). لكل α ، يحدد الخطان الأحمران حدود المنطقة ثنائية الاستقرار من حيث S.

تم فحص المفاتيح الجينية الثابتة التي يتم التحكم فيها عن طريق التغذية المرتدة الإيجابية بشكل تجريبي في عدد قليل من السياقات الخلوية (19 ، 20). لا يمكن للبيانات الحالية في المرجع 16 ، والتي تم قياسها على مستوى السكان ، أن تشير إلى ما إذا كان النظام ثنائي الاستقرار. هناك حاجة إلى تحليلات إضافية عن طريق فحص سلوك الخلية المفردة والكشف عن وجود التباطؤ لتوضيح هذه الديناميكيات المثيرة للاهتمام. إذا أصبح هذا هو هدف تصميم المؤلفين ، فقد تساعد جولات أخرى من التطور على LuxR أو مكونات الدائرة الأخرى أو الدائرة.


شاهد الفيديو: Community Update: Progress To A Cure. Rett Syndrome Research Trust (كانون الثاني 2022).