معلومة

هل محفز CMV نشط في الخميرة؟


أرغب في نقل الخميرة وأريد التحكم في كفاءتي. لذلك فكرت في استخدام pEGFP-N1 كعنصر تحكم. يتم تشغيل EGFP بواسطة مروج CMV. يمكن أن الخميرة قراءة المروجين CMV. شكرا هيرمان


نعم (مرجع)

بينما وجدت سؤالك مثيرًا للاهتمام ، كانت هذه هي النتيجة الأولى إلى حد كبير عندما كتبت "CMV yeast" في عالم Google. يجب أن تنظر هناك أولاً قبل أن تسأل!


يمكن استخدام مُحسِّن CMV المبكر / محفز أكتين الدجاج (CAG) لدفع التعبير الجيني أثناء تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الفئران إلى أسلاف الأوعية الدموية

زراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في المختبر لديها القدرة على التمايز إلى خلايا من الطبقات الجرثومية الثلاث وكذلك الخلايا الجرثومية. يحاكي التمايز الأحداث التنموية المبكرة ، بما في ذلك تكوين الأوعية الدموية وتكوين الأوعية في وقت مبكر ويتم استخدام العديد من أنظمة التمايز لتحديد العوامل المهمة أثناء تكوين نظام الأوعية الدموية. يصعب نقل الخلايا الجذعية الجنينية ، بينما تم الإبلاغ عن تقليل تنظيم نشاط المروج عند اختيار المواد المتعدية المستقرة ، مما يجعل دراسة البروتينات عن طريق الإفراط في التعبير أمرًا صعبًا.

نتائج

تم تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر CCE على النوع الرابع من الكولاجين لمدة 4-5 أيام ، وتم فرز خلايا الأديم المتوسط ​​+ Flk1 وتجديدها إما على النوع الرابع من الكولاجين في وجود VEGFA لإحداث خلايا بطانية وخلايا عضلية ملساء أو في نوع الكولاجين الأول المواد الهلامية لتشكيل أنابيب الأوعية الدموية. تم تقليل نشاط محفزات CMV و-actin أثناء اختيار المواد المنقولة المستقرة وأثناء التمايز إلى مرحلة Flk1 ، بينما أدى محسن CMV الفوري / مروج β-actin في ناقل pCAGIPuro-GFP إلى 100 ٪ من المنقولين بشكل ثابت وغير متمايزين. خلايا متمايزة معربا عن GFP. لمزيد من اختبار هذا النظام ، عبرنا عن syndecan-2 و -4 في هذه الخلايا وأظهرنا مستويات عالية من التعبير الجيني في كل من الخلايا غير المتمايزة والخلايا المتباينة إلى مرحلة Flk1.

استنتاج

تقدم النواقل التي تحتوي على محفز CAG أداة قيمة للتعبير طويل المدى عن الجينات المحورة أثناء تمايز الخلايا الجذعية تجاه الأديم المتوسط ​​، بينما تؤدي محفزات CMV و β-actin إلى تعبير ضعيف جدًا عن التحوير أثناء هذه العملية.


خلفية

تتمثل إحدى خصائص البيولوجيا التركيبية في تصميم وتركيب الأجزاء والوظائف البيولوجية والأجهزة. المحفزات مهمة بشكل خاص للتحكم في أوضاع التنظيم ونقاط القوة للتعبير الجيني ، وتوليد كميات مناسبة من الإنزيمات لتحسين التمثيل الغذائي الخلوي. الخميرة هي واحدة من الهياكل الأكثر استخدامًا في أبحاث البيولوجيا التركيبية ، حيث تقدم أداءً ممتازًا كمصانع للخلايا لإنتاج مواد كيميائية حيوية متنوعة ذات قيمة [1،2،3]. أثرت قوى المروج المناسبة بشكل كبير على كفاءة المسارات التركيبية غير المتجانسة في الخميرة وتركيبات المنتجات اللاحقة [4،5،6،7]. أرست الأعمال الحديثة البنية المعيارية لمروّجات الخميرة ، كما هو الحال في خميرة الخباز خميرة الخميرة، methylotrophic بيتشيا باستوريس وزيتية يارويا ليبوليتيكا [8،9،10،11،12،13]. يعتبر عمل Redden and Alper رائعًا بشكل خاص حيث حددوا وأثبتوا وضع تصميم لمحفز الخميرة الأدنى الذي حافظ على مستويات عالية من التعبير مع تقليل الحجم بنسبة 80٪ تقريبًا [8]. يتكون الحد الأدنى من محفز الخميرة المعياري من عدة أجزاء أساسية بالترتيب ، وهي تسلسل تنشيط المنبع الهجين (UAS) ، والفاصل الغني AT المحايد ، وصندوق TATA ، و N30 المروج الأساسي ، وموقع بدء النسخ (TSS). يوفر هذا العمل فرصة كبيرة لتصميم مروجات اصطناعية ذات تسلسلات أكثر عمومية.

من بين هذه الأجزاء المعيارية ، تتميز أنظمة UAS ، والمباعد الغني بـ AT ، وصندوق TATA ، و TSS بميزات تحفظية مميزة لأن عددًا محدودًا فقط من التسلسلات الطبيعية أو الاصطناعية من شأنها أن تحافظ على قوة المروج أو تعززها ، لكن معظم التسلسلات المهندسة تقلل بشكل كبير من قوة المروج [6 ، 8،9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16]. على النقيض من ذلك ، أثر تسلسل المروج الأساسي في اتجاه مجرى مربع TATA على سرعة انزلاق RNA polymerase II قبل إنشاء mRNA ، مما يحدد أيضًا نشاط المروج الأقصى. تتيح هذه المنطقة مساحة أكبر للتصميم الاصطناعي ولكن لها أيضًا محدودية خاصة بها ، حيث ستطغى التسلسلات العشوائية الكاملة على التسلسل الفعال الذي يعزز قوة المروج. أتاح العمل الأخير لبورتيلا وزملائه فرصة رائعة لتصميم نمط عالمي من المحفز الأساسي الذي يمكن استخدامه في أنواع الخميرة المختلفة [17]. لا يزال هناك تساؤل حول ما إذا كان يمكن استبدال هذه المنطقة بتسلسل اصطناعي مصمم من قبل de novo.

من زاوية أخرى ، نحتاج إلى هذا النوع من المحفزات الاصطناعية المصممة من قبل de novo كرموز شريطية لتمييز التعبير الجيني على مستوى الجينوم للبحث في إعادة ترتيب الجينوم [18 ، 19]. ستساعد الرموز الشريطية الاصطناعية للمروجين على تحليل التطور الجيني التركيبي. بالنظر إلى هذه النقطة ، نخطط لبناء سلسلة من متواليات محفز النواة الاصطناعية وتوصيف أدائها للحصول على نوع من القاعدة. في هذه الدراسة ، قمنا ببناء مروجي نواة اصطناعية في Y. ليبوليتيكا، والتي تم تصميمها لإنتاج مواد كيميائية قيمة مثل مشتقات الأحماض الدهنية والأحماض العضوية والتربينويدات والستيرولات [20،21،22]. لقد اخترنا كائنًا موجودًا قد يعزز المروجون الاصطناعيون مستويات التعبير عن إنزيم CrtY للحصول على إنتاج بيتا كاروتين أعلى من مادة الليكوبين السفلية (الشكل 1). تمكنا بسرعة من فحص المحفزات المرغوبة الموجودة في مستعمرات الخميرة بألوان مختلفة من الأحمر والبرتقالي والأصفر والتي قدمت تركيبات مختلفة من اللايكوبين والكاروتين (الشكل 1). المستعمرات ذات إنتاج اللايكوبين 1.2 مجم / جم من DCW وأعلى بكثير 25 مجم / جم ستقدم طيفًا لونيًا متمايزًا للغاية. قمنا بتصميم سلسلتين من N.30 المروجين الأساسيين. كانت السلسلة الأولى موجودة في اتجاه مجرى مروج طبيعي PEXP1 واستبدلت القواعد الـ 55 الأصلية بين TATA-box و TSS في P.EXP1. استبدلت السلسلة الثانية المنطقة الأصلية المكونة من 61 قاعدة بين TATA-box و TSS في مروج طبيعي آخر P.GPD. تم استخدام كلا المروجين بشكل شائع ويمتلكان نقاط قوة أقوى من المروجين الآخرين. منذ N30 كانت مكتبة كبيرة ، ركزنا هنا على اختبار تأثيرات وحدات T-rich والوحدات الغنية بـ G / C على قوة المروج الأساسي.

مفهوم فحص محفزات اللب الاصطناعي بمساعدة طيف ألوان مستعمرة الخميرة. غيرت المحفزات الصناعية المصممة هندسيًا مستوى التعبير عن إنزيم CrtY وضبطت تركيبة اللايكوبين والكاروتين ، مما أدى إلى توزيع لون مستعمرات الخميرة المتغيرة. في السلالة مع انخفاض إنتاج اللايكوبين ، لاحظنا لونين هما اللون الأحمر الفاتح الأصلي والأصفر الفاتح الجديد. في سلالة إنتاج اللايكوبين الأعلى ، لاحظنا ثلاثة ألوان كالأحمر الأصلي والجديد البرتقالي والأصفر


نتائج

نظام معدّل للفيروسات القهقرية قادر على ضرب الجينات والتعبير

الضامة الأولية للفأر من الصعب أن تكون منقولة أو مصابة بالنووية. ومع ذلك ، يمكن أن يصابوا بالفيروسات القهقرية. قمنا بمقارنة العديد من ناقلات الفيروسات القهقرية التجارية ووجدنا أن pSuper-Retro-puro من Oligoengine يعمل بشكل أفضل لإنتاج الفيروسات. يحتوي على ميزتين مؤكدتين على الأقل ، إحداهما تعبير shRNA الذي يحركه مروج H1 ، والآخر هو تعبير عن علامة مقاومة عقار بوروميسين التي يقودها مروج PKG. ومع ذلك ، قد لا يعمل مروج H1 بنفس قوة مروج U6 لتعبير shRNA (16) ، ويفتقر هذا المتجه إلى مواقع الاستنساخ للتعبير الجيني الخارجي. لذلك قمنا بتعديل هذا المتجه إلى ناقل جديد للفيروسات القهقرية ، قادر على ضرب الجين والتعبير مع الاحتفاظ بوظيفة التعبير عن مقاومة البوروميسين. كما هو موضح في الشكل 1 أ ، أزلنا مروج H1 في pSuperRetro-puro واحتفظنا بمواقع الاستنساخ المتعددة (MCS1) لاستنساخ مروج U6 الذي يقود تعبير shRNA. لقد ثبت أن محفز UbiC البشري نشط بشكل أساسي في مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة (27) ، وتم اختياره لدفع التعبير عن الجين الخارجي وجين مقاومة البوروميسين المفصولين بواسطة مروج SV40. يسمح MCS2 بين UbiC و SV40 باستنساخ الجين الخارجي. اشتقنا نواقل باستخدام C-terminal Flag-His6 (FH) للسماح بطبقة مناعية أو ترسيب مناعي للبروتين المعبر عنه ، وسمينا هذا المتجه الجديد باسم pFRRu. المتجه الآخر pFRRg له نفس استراتيجية التصميم ، ولكن تم استبدال مروج UbiC بمروج PKG (الشكل 1B). باستخدام هذه النواقل الفيروسية الجديدة ، قمنا بتحويل مجموعة متنوعة من أنواع خلايا الفئران (على سبيل المثالوالخلايا الظهارية والخلايا الكيراتينية والأرومات الليفية والخلايا المكونة للدم) وكذلك الخلايا الأولية [على سبيل المثال، الخلايا الليفية الجنينية للفأر والضامة المشتقة من نخاع العظم (BMDMs)]. تختلف كفاءة التحويل باختلاف نوع الخلية وعاير الفيروس المطبق. ومع ذلك ، بعد اختيار بوروميسين ، تم نقل جميع الخلايا المتبقية فيروسيًا. في هذه الدراسة ، أدى العيار الفيروسي الذي طبقناه إلى كفاءة نقل تتراوح بين 30٪ و 60٪ للخلايا الضامة ، وتجنب الإدخالات المتعددة للنصوص الفيروسية في خلية واحدة.

نظام الفيروسات القهقرية المعدل مع الضربة القاضية للجينات ووظائف التعبير الجيني الخارجي. أ. خريطة ناقل الفيروس المعدلة مع مروج UbiC. تم إنشاء pFRRu كما هو موضح في المواد والطرق. يوجد موقعان متعددان للاستنساخ: يحتوي 5 & # x02032-end of UbiC على مواقع استنساخ متعددة لكاسيت تعبير shRNA (MCS1) ، و 3 & # x02032-end of UbiC بها مواقع استنساخ متعددة للتعبير الجيني الخارجي (MCS2) التي تحتوي على in -frame Flag-His6 (FH) الوسم. تم حجز تعبير مقاومة Puromycin (puro) مع مروج SV40. ب. ناقل الفيروس المعدلة مع مروج PKG. تم استبدال مروج UbiC كما هو موضح أعلاه بمروج PKG.

تثبيط نشاط محفز U6 عن طريق ترتيب محفز متباين لـ U6 و UbiC

عادةً ما تؤدي ثلاثة ترتيبات مروج إلى TI ، وهي المروجون المتقاربون والمروجون الترادفيون والمروجون المتداخلون (المتباعدون) (26). نظرًا لأن ترتيب المروج المتقارب لـ U6 والمروجين الآخرين نادر في النواقل الفيروسية ، فقد ركزنا على ترتيبات المروج الترادفية والمتباينة لاستكشاف الترتيبات التي أدت إلى ضعف كبير في نشاط المروج U6. قمنا ببناء مروج U6 يقود كاسيت تعبير mCIN85 shRNA وأدخلنا كاسيت التعبير هذا في MCS1 من pFRRu في اتجاهات مختلفة. كان أحدهما ترتيب محفز متباين حيث كان U6 و UbiC في الاتجاه المعاكس (متباعدان pU6sh-pUbiC) ، والآخر كان جنبًا إلى جنب في نفس اتجاه UbiC (pU6sh-pUbiC-tandem). أنشأنا أيضًا ناقل تعبير luciferase shRNA كعنصر تحكم shRNA غير محدد و pFRRrfp-U6-mCIN85 shRNA كعنصر تحكم لتقليل تفاعل المروج عن طريق استبدال مروج UbiC بجزء DNA غير المروج (الشكل 2A). تم إدخال هذه النواقل في خلايا Plat E لإنتاج الفيروسات. تم نقل BMDMs مع الفيروسات ذات الصلة ثم تم اختيارها لاحقًا باستخدام بوروميسين لإزالة الخلايا غير المنقولة. بعد أربعة أيام من الاختيار ، تم تفكيك الخلايا المتبقية لاستخراج البروتين. تم إجراء اللطخات الغربية باستخدام الأجسام المضادة المضادة لـ CIN85 الأرانب (الشكل 2 ب). تم تحديد نشاط محفز U6 النسبي باستخدام مستوى بروتين mCIN85 الداخلي المنشأ مقابل مستوى & # x003b1-tubulin كعنصر تحكم في التحميل. كما هو مبين في الشكل 2C ، كان لترتيب مروج U6 بالنسبة لمحفز UbiC في المتجه تأثير كبير على نشاط مروج U6. حافظ الترتيب الترادفي على نشاط محفز U6 أعلى بكثير من الترتيب المتباين. يشير هذا إلى أنه يمكن تنظيم نشاط مروج U6 بواسطة TI بطريقة تعتمد على ترتيب المحفز.

ترتيب المروج المتباين لـ U6 و UbiC يثبط نشاط محفز U6. أ. رسم تخطيطي لترتيبات مروج U6 و UbiC. تم إنشاء كاسيت تعبير mCIN85 shRNA كما هو موضح في المواد والطرق ، وتم إدخاله في pFRRu لتشكيل ترتيبات مروج متباعدة ومترادفة. تم ضبط الحد الأدنى من التحكم في نشاط المروج U6 المتداخل عن طريق استبدال مروج UbiC بجزء (كدنا) غير محفز من طلب تقديم العروض. ب. مستوى بروتين mCIN85 الداخلي المتبقي ليعكس نشاط محفز U6. تم نقل BMDMs للماوس مع الفيروسات القهقرية المنتجة مع نواقل مختلفة كما هو محدد. بعد أربعة أيام من انتقال الفيروس واختيار الدواء ، تم جمع الخلايا المتبقية وفصلها. تم إجراء لطخات غربية باستخدام مضاد الأرانب النقي CIN85 كجسم مضاد أولي. ج. تطبيع mCIN85 يطرح الكفاءة التي تعكس نشاط مروج U6 النسبي. تسلسل العينة كما هو موضح في اللوحة "ب". القيم عبارة عن إحصائيات من ثلاث تجارب مستقلة.

يؤثر محسن CMV سلبًا على نشاط مروج U6 في وجود مروج UbiC

أظهرت الدراسات السابقة أن محسن CMV له تأثير إيجابي على نشاط محفز U6 (23). ومع ذلك ، فإن تأثير محسن CMV على نشاط مروج U6 في وجود TI غير معروف. للإجابة على هذا السؤال ، وضعنا مُحسِّنًا للـ CMV بين مروج U6 و UbiC في كل من ترتيبات المروج من خلال دمج المُحسِّن في المنبع لمُحسِّن UbiC أو U6 (الشكل 3 أ). ثم اختبرنا نشاط مروج U6. لدهشتنا ، بدلاً من تعزيز نشاط المروج U6 ، عزز محسن CMV في جميع التكوينات الأربعة بشكل كبير التأثير المثبط لـ UbiC على نشاط مروج U6 في كل من ترتيبات المروج (الشكل 3 ب و ج). ومع ذلك ، فإن مستوى التثبيط يختلف باختلاف ترتيبات المروج. أدى دمج مُحسِّن CMV قبل المنبع من U6 والحفاظ على الترتيب الترادفي للمحفزات إلى تثبيط أقل نسبيًا ، بينما أعطى التكوين المتباعد أعلى تثبيط. تشير هذه النتيجة إلى أن مُحسِّن CMV يمكن أن يعزز TI ويمنع نشاط محفز U6 بشكل كبير في وجود محفز UbiC في أي من ترتيبات المروج.

تم تعزيز التأثير السلبي لـ UbiC على نشاط مروج U6 في وجود مُحسِّن CMV. تم اتباع الأساطير الواردة في الشكل 2 فيما عدا أنه تم وضع مُحسِّن CMV بين مروج U6 و UbiC أو تم دمجه في المنبع من U6 كما تم رسمه. أ. رسم تخطيطي لمروج U6 ومحسن CMV وترتيبات مروج UbiC. تم دمج محسن CMV في المنبع إما لمحفز U6 أو محفز UbiC مكونًا ترتيبات متباينة أو ترادفية كما هو محدد. ب. لطخة غربية من mCIN85 لتعكس المتبقي mCIN85 المتبقي في الخلايا. تم إنشاء العينات باستخدام نقل فيروسات مختلفة كما هو محدد. ج. نشاط محفز U6 النسبي بعد التطبيع ضد & # x003b1-tubulin. القيم هي إحصائيات من ثلاث تجارب مستقلة.

تنظيم نشاط المروج U6 بواسطة TI خاص بالمروج

غالبًا ما ينشأ TI من قوة غير متماثلة لاثنين من المروجين المرتبين بشكل وثيق ، والمروج الأقوى يقلل من نشاط الأضعف (26). مروج UbiC نشط في كل مكان في مجموعة متنوعة من الخلايا وهو محفز قوي نسبيًا (27). سألنا بعد ذلك عما إذا كان يمكن الحفاظ على نشاط مروج U6 إذا استبدلنا مروج UbiC بمروج PKG أضعف لموازنة القوة غير المتماثلة سابقًا. قمنا ببناء ناقلات فيروسية مماثلة في كل من ترتيبات المروج U6 مع مروج PKG كما هو موضح في الشكل 4 أ واختبرنا نشاط المروج U6 في BMDMs المنقولة. كما هو متوقع ، لم يلاحظ أي تثبيط كبير لنشاط المروج U6 في أي من الترتيبين (الشكل 4 ب وج). تشير هذه النتيجة إلى أن تنظيم نشاط محفز U6 بواسطة TI خاص بالمروج. إن موازنة قوة المروجين المتجاورين هو المفتاح. PKG ، وهو مروج أضعف ، له تأثير TI ضئيل على نشاط مروج U6.

استجابة نشاط محفز U6 إلى TI خاصة بالمروج. تم اتباع الأساطير في الشكل 2 باستثناء أنه تم استبدال مروج UbiC بمروج PKG. أ. رسم تخطيطي لترتيبات مروج U6 و PKG. ب. مستوى بروتين mCIN85 الداخلي المتبقي ليعكس نشاط محفز U6. ج. نشاط محفز U6 النسبي بعد التطبيع ضد & # x003b1-tubulin. القيم هي إحصائيات من ثلاث تجارب مستقلة.


تصور نشاط الجينات في الخلايا الحية

يُعتقد أن بنية الكروماتين تلعب دورًا مهمًا في التعبير الجيني. باستخدام لاك نظام المشغل / المكبِر ومتغيرين لونيين من بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، طورنا نظامًا لتصور الجين ومنتجاته البروتينية مباشرة في الخلايا الحية ، مما يسمح لنا بفحص التنظيم المكاني وتوقيت التعبير الجيني في الجسم الحي. لوحظت التغيرات المورفولوجية الديناميكية في بنية الكروماتين ، من بنية مكثفة إلى بنية مفتوحة ، عند تنشيط الجينات ، واستهداف منتج الجين ، تم تصور مراسل البروتين الفلوري السماوي (CFP) إلى بيروكسيسومات مباشرة في الخلايا الحية. وجدنا أن موضع الجين المتكامل كان محاطًا بجسم نووي لسرطان الدم النخاعي (PML). كانت الجمعية مستقلة عن النسخ ولكنها كانت تعتمد على المباشر في الجسم الحي ارتباط بروتينات معينة (EYFP /لاك مثبط ، مستقبلات التتراسيكلين / معامل VP16) إلى الموضع. توفر القدرة على تصور التعبير الجيني مباشرة في الخلايا الحية نظامًا قويًا لدراسة ديناميات الأحداث النووية مثل النسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي وإصلاح الحمض النووي.


نقاش

لم يتم التحقيق بدقة في استهداف الميتوكوندريا لبروتينات الغشاء الخارجي المرتبط بـ C. كخطوة أولى نحو توضيح آليات الاستهداف الخاصة بهم ، قمنا بتمييز إشارة استهداف الميتوكوندريا باستخدام اندماج GFP-Tom5 كنموذج. نظرًا لأن اندماج GFP الفلوري المعبر عنه في الجسم الحي يمتلك "طية ضيقة" ويمكن أن يكون الببتيد Tom5 المرتبط بالطرف C من GFP قصيرًا مثل 50 من البقايا ، يجب دائمًا تعريض الطرف C لـ Tom5 إلى سطح الفلورسنت النشط مركب. وبالتالي ، فإن التألق يمثل بروتينات مطوية بشكل صحيح ، وبالتالي ، فإن الفحص الحالي يقلل من الارتباط غير المحدد للبروتينات غير المطوية بالعضويات المختلفة. أظهرت نتائجنا أن TMS مع 18-20 من البقايا الكارهة للماء وشحنات موجبة في المقطع C التالي كلاهما محددات مهمة لاستهداف الميتوكوندريا. تم توضيح أهمية الجزء C كإشارة استهداف الميتوكوندريا بشكل أوضح من خلال التجربة في الشكل 2 ، الجزء C من Tom5 المزروع في الطرف C من السيتوكرومب5، يتم توجيه البروتين الذي يستهدف ER بطريقة أخرى إلى الميتوكوندريا ، أو العكس. عند تقليل عدد الشحنات الموجبة في المقطع C ، فقدت المسوخات تدريجيًا خصوصية الغشاء وتم توزيعها ليس فقط على الميتوكوندريا ولكن على ER ، مما يشير إلى أن ثلاثة أحماض أمينية أساسية على الأقل في المقطع C مطلوبة للنوع المحدد. استهداف Tom5 للميتوكوندريا.

تم فقدان خصوصية الغشاء أيضًا عندما تم تمديد TMS ، على الرغم من بقاء الجزء C سليمًا (الشكل 4). في ضوء التقرير الذي يشير إلى أن القوى الكارهة للماء تدفع الغشاء العفوي (Enoch وآخرون.، 1979 Rachubinski وآخرون.، 1980 اندرسون وآخرون.، 1983) ، نتوقع أن وظائف TMS الممدودة كإشارة غشاء مهيمنة غير محددة (Blobel ، 1980) من خلال تقاربها المعزز مع طبقة ثنائية الدهون ، وتم توزيع البروتينات الطافرة في جميع أنحاء الأغشية ، بما في ذلك الميتوكوندريا و ER ، على الرغم من أن هذه لا يزال يتعين تحديد التركيبات المترجمة إلى أنظمة الأغشية الأخرى.

مجتمعة ، تعمل ثلاث بقايا أساسية للأحماض الأمينية في الطرف C من TMS بطول مناسب كإشارة استهداف للميتوكوندريا. يتم حفظ هذه الميزة الهيكلية أيضًا في الميتوكوندريا VAMP-1B (الشكل 1). عندما تم تغيير كل من بقايا الأرجينين أو جميع البقايا الثلاثة إلى ثريونين ، تم نقل المسوخ إلى أغشية العضيات الإفرازية عبر ER (Isenmann and Wattenberg ، 1998). أظهرت الدراسة الحالية أن الطول ، وليس الكراهية للماء ، هو المحدد الرئيسي لوظيفة TMS [الشكل 4 ، TM (H)]. لدعم ذلك ، يحتوي VAMP-1B على TMS من 17 وحدة بنائية بمتوسط ​​كره للماء 3.20 ومع ذلك ، فإنه مترجمة في الميتوكوندريا. لذلك ، يبدو أن الطول ، وليس كره الماء ، هو الذي يحدد استهداف الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، فقد يكون الطول مطلوبًا للتكيف مع سمك طبقة ثنائية الدهون في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا.

تداخل إدخال خمس بقايا سيرين بين TMS والجزء C بشدة مع استهداف الميتوكوندريا لـ Tom5 ، في حين أن إضافتها إلى الطرف C كانت غير فعالة. وبالتالي ، فإن المسافة بين TMS الكارهة للماء والجزء C الأساسي هي عامل حاسم لاستهداف الميتوكوندريا. تتوافق هذه الملاحظة مع الملاحظة السابقة بأن تحديد موقع الأرجينين بعد TMS مباشرة في OMb أكثر أهمية لاستهداف الميتوكوندريا من أرجينين آخر يقع في الجانب C البعيد (كورودا وإيتو ، 1998 الشكل 1).

كان هناك فرق بين النصف الأول والنصف الأخير من TMS في الحساسية للطفرة المقدمة. يتداخل حذف الأحماض الأمينية الفردية في النصف الأخير من TMS (40 M-45V) مع وظيفة استهداف الميتوكوندريا بقوة أكبر من حذف الأحماض الأمينية الفردية داخل النصف السابق من TMS (الشكل 6). أشارت هذه النتائج مرة أخرى إلى أن TMS والجزء C الأساسي يجب أن يكونا ضمن مسافة أو سياق مناسب. مجتمعة ، قد تتعرف بعض العوامل في العصارة الخلوية على هذه السمات الهيكلية وتوجهها إلى الغشاء الخارجي للميتوكوندريا.

المجال الطرفي C لـ Tom5 ، الذي يتألف من TMS والمقطع C ، عند زرعه في الطرف N من GFP ، يعمل كإشارة استهداف ER ، ربما كمرساة إشارة (Kida وآخرون.، 2000). لذلك ، يجب وضع هذه الأجزاء عند الطرف C ليتم التعرف عليها بشكل صحيح حيث أن استهداف الميتوكوندريا يشير إلى المتطلبات الهيكلية لإشارات استهداف الميتوكوندريا للبروتينات المرتكزة على N والبروتينات المرتكزة بشكل واضح. بالنظر إلى أن الوحدة الفرعية الريبوسومية الكبيرة تضم الببتيد الممتد المكون من 39 وحدة بنائية (Blobel and Sabatini ، 1970) ، فإن إشارة استهداف الميتوكوندريا الخاصة بـ Tom5 تكون محمية تمامًا تقريبًا داخل الوحدة الفرعية الريبوسومية الكبيرة. وبالتالي ، يجب أن يستمر تفاعل الاستهداف أثناء المعالجة اللاحقة للترجمة ، والتي ربما تتجنب التعرف على SRP ، لأن التعرف بواسطة SRP على ببتيد الإشارة يحدث في مجمع سلسلة الريبوسوم الوليدة بالتزامن (Walter and Johnson ، 1994).

تم حفظ الخصائص الهيكلية للإشارة التي تم تحديدها باستخدام الخميرة Tom5 جيدًا في بروتينات مرساة C-tail للثدييات Vamp1B (Isenmann and Wattenberg ، 1998 التي تمت مناقشتها أعلاه) و OMP. كانت تركيبات GFP-Tom5 المثبتة بالغشاء و GFP-OMP25 موجودة في الحالة المشتتة في الأغشية الخارجية ولم يتم دمجها في مجمع TOM. لذلك ، يمكن اعتبار GFP-Tom5 كنموذج يمثل بروتينات مرساة C-tail العامة التي لا تقتصر على آلية استيراد TOM ، ولكنها مشتتة في النهاية في طبقات الدهون الثنائية. يبدو أن هذه البروتينات مستهدفة من خلال مسار مماثل لأنه تم استيرادها إلى الميتوكوندريا التي عولجت بالتريبسين لإزالة مستقبلات استيراد الغشاء الخارجي rTOM70 و rTOM20 و rTOM22 و OM37 (بياناتنا غير المنشورة) ، على الرغم من مشاركة مكون القناة rTOM40 لا يزال بحاجة إلى التحليل.

مكننا نظام الفحص غير المتجانسة باستخدام الخميرة Tom5 من التمييز بين خطوات الاستهداف وتكامل الغشاء في الميتوكوندريا الثديية. تم استهداف GFP-Tom5 من النوع البري المعبر عنه في خلايا COS-7 بشكل صحيح للميتوكوندريا كما لوحظ تحت الفحص المجهري متحد البؤر ، ولكن تم دمجها بشكل غير فعال في غشاء الميتوكوندريا ، في حين تم دمج نفس البنية المعبر عنها في خلايا الخميرة بكفاءة في غشاء الميتوكوندريا. مع زيادة كره الماء لـ TMS ، تم الآن تثبيت بنية الاندماج TM (H) بقوة في غشاء الميتوكوندريا. تشير هذه النتائج إلى أن خصائص إشارة الاستهداف لبروتينات مرساة C-tail متميزة بين الخميرة والثدييات. في الواقع ، لم تكن بقايا الأحماض الأمينية الأساسية في الجزء C من GFP-Tom5 مطلوبة لاستهداف الميتوكوندريا وإدخال GFP-Tom5 في الخميرة (بيانات غير منشورة هيوري ، ساكاجوتشي ، وميهارا). جاري توصيف إشارة استهداف الميتوكوندريا لبروتينات مرساة الذيل C في الخميرة.

كيف يتم التعرف على ميزات الإشارة هذه في السيتوبلازم أثناء الاستهداف بعد الترجمة؟ المركب المرتبط بالبولي ببتيد الناشئ (NAC) ، والذي تم وصفه بأنه المرافق غير المتجانسة ، المرتبط بالريبوسوم الذي يمنع التفاعل المختلط بين SRP وعديد الببتيدات الناشئة المخصصة للمقصورات الخلوية بخلاف المسار الإفرازي (Wiedmann) وآخرون.، 1994) ، في استهداف البروتينات الأولية للميتوكوندريا في الخميرة (George وآخرون.، 1998 Fünfschilling and Rospert ، 1999). خميرة Δegd2المسوخات ، التي تفتقر إلى وظيفة NAC ، تتراكم GFP-Tom22 و GFP-Bcl2 في العصارة الخلوية (Egan وآخرون.، 1999). يبدو أن NAC تعمل كوصيف عام للحفاظ على كفاءة استهداف العضيات للسلائف في الجسم الحي. تشير النتائج الحالية إلى أن TMS والجزء C الأساسي يجب أن يكونا ضمن سياق أو مسافة مناسبة لوظيفة استهداف الميتوكوندريا تشير إلى أن بعض العوامل بالإضافة إلى NAC التي تتعرف على وجه التحديد على هذه الميزات وتثبت البروتين الناشئ الكاره للماء في العصارة الخلوية ، تشارك في الاستهداف.


محتويات

في حدود الهربس، CMV ينتمي إلى Betaherpesvirinae الفصيلة الفرعية ، والتي تشمل أيضًا الأجناس فيروس موروميجالوفير و روزولوفيروس (فيروس الهربس البشري 6 و فيروس هربس بيتا البشري 7). [7] كما أنه مرتبط بفيروسات الهربس الأخرى داخل ألفاهربسفيرينا الفصيلة الفرعية ، والتي تشمل فيروسات الهربس البسيط 1 و 2 وفيروس الحماق النطاقي ، و غاما هربسفيرينا الفصيلة الفرعية ، والتي تشمل فيروس إبشتاين بار وفيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوزي. [6]

عدة أنواع من فيروس مضخم للخلايا تم التعرف عليها وتصنيفها للثدييات المختلفة. [7] الأكثر دراسة هي الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV) ، والذي يُعرف أيضًا باسم فيروس هربس بيتا البشري 5 (HHV-5). تشمل أنواع CMV الرئيسية الأخرى الفيروس المضخم للخلايا الشمبانزي (CCMV) الذي يصيب الشمبانزي وإنسان الغاب ، و الفيروس المضخم للخلايا القرد (SCCMV) و الفيروس المضخم للخلايا ريسوس يُعرف (RhCMV) الذي يصيب قرود المكاك CCMV باسم كليهما فيروس هربس بيتا بانين 2 (PaHV-2) و pongine betaherpesvirus 4 (PoHV-4). [8] يسمى SCCMV cercopithecine betaherpesvirus 5 (CeHV-5) [9] و RhCMV ، Cercopithecine betaherpesvirus 8 (CEHV-8). [10] تم اكتشاف نوعين آخرين من الفيروسات في قرد الليل تم وضعهما مؤقتًا في الجنس فيروس مضخم للخلاياويطلق عليهم فيروس الهربس aotus 1 و فيروس الهربس aotus 3. تحتوي القوارض أيضًا على فيروسات كانت تسمى سابقًا الفيروسات المضخمة للخلايا والتي أعيد تصنيفها الآن تحت الجنس فيروس موروميجالوفير يحتوي هذا الجنس الفيروس المضخم للخلايا الماوس (MCMV) يُعرف أيضًا باسم فيروس بيتا هربس مريد 1 (MuHV-1) وما يرتبط بها ارتباطًا وثيقًا فيروس بيتا هربس مريد 2 (MuHV-2) الموجود في الفئران. [11]

تحرير الأنواع

يتكون الجنس من 11 نوعًا: [5]

  • آوتين بيتا هربس 1
  • فيروس بيتا هربس سيبين 1
  • Cercopithecine betaherpesvirus 5
  • فيروس هربس بيتا البشري 5
  • فيروس بيتا هربس المكاكين 3
  • Macacine betaherpesvirus 8 المكاكين بيتاهربسفيرس 8
  • الماندريلين betaherpesvirus 1
  • Panine betaherpesvirus 2
  • فيروس بابيين بيتاهربس 3
  • فيروس بابيين بيتاهربس 4
  • Saimiriine betaherpesvirus 4

الفيروسات في فيروس مضخم للخلايا مغلفة ، مع عشرونية الوجوه ، كروية إلى متعددة الأشكال ، وهندسة دائرية ، و T = 16 تناظر. يبلغ قطرها حوالي 150-200 نانومتر. الجينوم خطي وغير مقسم ، ويبلغ طوله حوالي 200 كيلو بايت. [4]

جنس بنية تناظر كابسيد الترتيب الجيني التجزئة الجينومية
فيروس مضخم للخلايا متعدد الأشكال كروي تي = 16 مغلف خطي أحادي الجزء

تمتلك فيروسات الهربس بعضًا من أكبر الجينومات بين الفيروسات البشرية ، وغالبًا ما تشفر مئات البروتينات. على سبيل المثال ، يبلغ حجم جينوم DNA مزدوج الشريطة (dsDNA) لسلالات HCMV من النوع البري حوالي 235 كيلو بايت ويشفر ما لا يقل عن 208 بروتينات. وبالتالي فهو أطول من جميع فيروسات الهربس البشرية الأخرى وواحد من أطول جينومات جميع فيروسات الإنسان بشكل عام. يحتوي على بنية الجينوم المميزة لفئة فيروس الهربس E ، والتي تتكون من منطقتين فريدتين (UL طويل وفريد ​​من نوعه قصير أمريكي) ، كلاهما محاط بزوج من التكرارات المقلوبة (التكرار الطرفي / الداخلي الطويل TRL / IRL والداخل / الطرفي تكرار قصير IRS / TRS). تشترك كلتا المجموعتين من التكرارات في منطقة من بضع مئات من النقاط في الثانية ، ما يسمى بـ "التسلسل" ، يشار أحيانًا إلى المناطق الأخرى من التكرارات باسم "تسلسل b" و "تسلسل c". [12]

التكاثر الفيروسي نووي ولايسوجينيك. يتم الدخول إلى الخلية المضيفة عن طريق ربط البروتينات السكرية الفيروسية بالمستقبلات المضيفة ، والتي تتوسط في الالتقام الخلوي. يتبع النسخ المتماثل نموذج النسخ المتماثل ثنائي الاتجاه dsDNA. النسخ النموذجي للحمض النووي ، مع بعض آليات التضفير البديلة هي طريقة النسخ. تتم الترجمة عن طريق المسح المتسرب. يخرج الفيروس من الخلية المضيفة عن طريق الخروج النووي والتبرعم. يعمل البشر والقرود كمضيفين طبيعيين. تعتمد طرق الانتقال على ملامسة سوائل الجسم (مثل اللعاب والبول والإفرازات التناسلية) من شخص مصاب. [4] [13]

جنس تفاصيل المضيف استوائية الأنسجة تفاصيل الدخول تفاصيل الإصدار موقع النسخ المتماثل موقع التجميع الانتقال
فيروس مضخم للخلايا قرود البشر الغشاء المخاطي الظهاري البروتينات السكرية مهدها نواة نواة لعاب البول

تشترك جميع فيروسات الهربس في قدرة مميزة على البقاء كامنة داخل الجسم لفترات طويلة. على الرغم من إمكانية وجودها في جميع أنحاء الجسم ، إلا أن عدوى الفيروس المضخم للخلايا غالبًا ما ترتبط بالغدد اللعابية في البشر والثدييات الأخرى. [7]

يتم تضمين محفز الفيروس المضخم للخلايا بشكل شائع في النواقل المستخدمة في أعمال الهندسة الوراثية التي أجريت في خلايا الثدييات ، حيث إنه محفز قوي ويقود التعبير التأسيسي للجينات الخاضعة لسيطرته. [14]

فيروس مضخم للخلايا لوحظ لأول مرة من قبل عالم الأمراض الألماني هوغو ريبرت في عام 1881 عندما لاحظ تضخم الخلايا ذات النوى المتضخمة الموجودة في خلايا الرضيع. [15] بعد سنوات ، بين عامي 1956 و 1957 ، قام توماس هاكل ويلر مع سميث ورو بعزل الفيروس بشكل مستقل ، والمعروف فيما بعد باسم "الفيروس المضخم للخلايا". [16] في عام 1990 ، تم نشر المسودة الأولى لجينوم الفيروس المضخم للخلايا البشري ، [17] وهو أكبر تسلسل جينوم متجاور في ذلك الوقت. [18]


الملخص

لقد بحثنا في النشاط النسخي للفيروس المضخم للخلايا البشري ، والهربس ثيميدين كيناز ، وموجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية α ، والسوماتوستاتين ، وسلسلة الغلوبولين المناعي κ ، والبلورات ألفا ، والألبومين ، ومحفزات إنترفيرون- β في الخميرة الانشطارية شيزوساكارومايس بومب. من بين هؤلاء ، تم العثور على الفيروس المضخم للخلايا البشري ، وموجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية α ، ومحفزات السوماتوستاتين نشطة للغاية ، حوالي 11 و 9 و 0.9 ضعفًا مثل المروج المبكر SV40 ، على التوالي. ما تبقى من المحفزات المدروسة كان ضعيفًا ، حيث يمتلك 10-20 ٪ فقط من نشاط المروج SV40. أظهر تحليل التمديد التمهيدي أن المروجين الأقوياء بدأوا النسخ في S. بومبي في نفس المواقع كما في خلايا الثدييات ، مما يشير إلى التشابه الكبير بين نظامي النسخ.


يعمل المروج الخاص بالحيوانات المنوية للجين SP-10 كعامل عازل في الخلايا الجسدية

تعرض علامات تمايز الحيوانات المنوية مثل البروتين الأكروسومي SP-10 تعبيرًا جينيًا رائعًا للخصية والجراثيم مقيد بالخلايا الجرثومية. ومع ذلك ، لا يُعرف الكثير عن الآليات التي تمنع ظهورها في الأنسجة الجسدية. لقد لاحظنا سابقًا أن المروج -408 / + 28 أو -266 / + 28 من SP-10 يوجه النسخ بدقة خاصة بالحيوانات المنوية في الفئران المعدلة وراثيًا ، بيول. ريبرود. 61 ، 1256-1266). Lack of ectopic expression in these mouse lines implied that the SP-10 promoter might have protected the transgene from the influence of neighboring enhancers. The present study tested this directly by performing enhancer-blocking assays. In transiently transfected COS cells, the -408/-92 SP-10 promoter, but not stuffer DNA, blocked the transcriptional activity of a heterologous enhancer (CMV) in a position- and orientation-dependent manner. In transgenic mice, despite integration adjacent to the pan-active CMV enhancer, the -408/+28 promoter maintained spermatid-specificity and no ectopic expression of the transgene resulted. Enhancer blocking is a characteristic feature of insulators. Our results show that the SP-10 proximal promoter, which activates transcription in spermatids, functions as an insulator in somatic cells. Insulator activity mapped to the -186/-135 region and mutation of two ACACAC motifs compromised the insulator function. In conclusion, the evolutionarily conserved SP-10 insulator is novel and is the first one shown to regulate transcription of a germ cell differentiation marker.


The Molecular Basis of Endocrinology

Transcription

RNA polymerase II binds downstream of the TATA box and initiates transcription of the RNA copy of one strand of the gene. Transcription continues some way downstream of the end of the gene and the transcript is processed while being exported from the nucleus. The 5′–end is modified (capped), introns are removed (splicing) and the 3′–end is trimmed and tailed with 5- to 25-adenosine residues (polyadenylation).

معالجة الحمض النووي الريبي

The splicing process involves a complex series of reactions catalysed by a set of small nuclear ribonuclear protein particles (SNRPS pronounced snurps). These recognize sequences at the ends of introns enabling the precise removal of the intron sequence with reconnection of the ends of the two exons. The 5′–sequence is: Exon NNNNN^ guaagunnnnn Intron whereas the 3′–sequence is Intron nnnnnnأnnnnn(c/u)نcaĝNNNNN Exon. The excised intron forms a lariat in the process ( Figure 2.2) .

Figure 2.2 . Transcription and RNA processing: the primary transcript starts close to the site of RNA polymerase binding and extends beyond the polyadenylation signal. The transcript is cleaved and polyadenylated close to the signal AAUAAA the 5′-end is modified by addition of a deoxyguanosine residue ‘capping’. 5′ untranslated 3′ untranslated

Mutations of the sequences shown are a common cause of genetic disease leading to abnormal processed RNA transcripts which cannot be translated and which are often unstable leading to low levels of RNA.

The splicing reaction may proceed differently in different tissues leading to different mature RNAs and hence different protein products being produced from the same gene in a process known as alternative splicing, the best known example in endocrinology being the calcitonin/CGRP gene in which calcitonin lies on exon 4 and CGRP (calcitonin gene-related peptide) lies on exon 5. In C cells exon 4 is included in the mRNA and its poly(A) addition site is used thus removing CGRP from the mature mRNA, whereas in the nervous system exon 4 is spliced out leaving exon 5 in the mature mRNA which allows translation of CGRP ( Figure 2.3 ).

Figure 2.3 . Calcitonin gene alternate splicing: the calcitonin gene contains six exons exon 4 codes for calcitonin and contains a polyadenylation signal exon 5 codes for CGRP (calcitonin gene-related peptide) and the next polyadenylation site is in exon 6. Splicing in C cells produces an mRNA containing the first four exons and excludes exons 5 and 6, whereas in nerves exon 4 is excluded by a different tissue–specific splicing pattern, giving an mRNA containing exons 1,2,3,5 (CGRP) and 6. The different mRNAs are translated giving calcitonin or CGRP in association with different flanking peptides


Redox Cell Biology and Genetics Part B

Klaus Felix , . Siegfried Janz , in Methods in Enzymology , 2002

Shuttle Vector and Principle of Assay

In the plasmid-based shuttle vector pUR288, لاكز functions as both target and reporter gene of mutagenesis. The 5346-bp vector contains in addition to لاكز-coding sequences the 35-bp binding site for the LacI repressor, lacO, the binding site for CRP (cAMP receptor protein, which facilitates transcription of لاكز by stimulating the formation of an active promoter complex), an origin of replication (ori), and an ampicillin resistance gene ( Fig. 4A ). The principle of the pUR288 mutagenesis assay is illustrated in Fig. 4B . Briefly, shuttle vectors are excised from the transgenic concatemer by restriction with هينdIII. Linearized plasmids are then separated from bulk genomic DNA with the help of magnetic beads that are coated with a LacI fusion protein that can bind to the lacO sequence of the plasmid. 4 Elution from the beads is achieved by adding isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), an inactivator of LacI that induces an affinity decreasing conformational change in the protein for lacO. Plasmids are circularized at the cohesive هينdIII sites by ligation with T4 ligase and then electroporated into بكتريا قولونية that is (1) deficient in β-Gal (لاكز − ), (2) galactose intolerant due to the absence of galactose epimerase (galE − ), and (3) restriction negative to prevent the degradation of incoming methylated plasmid DNA. ال galE − mutation is key 12 because it allows for the positive selection of lacZ − mutants in the presence of the lactose analog P-Gal (phenyl-β-D galactoside), a substrate for β-Gal. LacZ − mutants are unable to cleave P-Gal in contrast, wild-type LacZ + cells are able to cleave it, and thereby release galactose. Galactose is converted to UDP-galactoside, which cannot be further metabolized on the galE − background instead, it is accumulated intra-cellularly to toxic and eventually lytic concentrations. Thus, whereas LacZ + cells are prevented from growth on P-Gal-supplemented agar plates, LacZ − cells are not. To determine the rescue efficiency of plasmids from genomic DNA, a small aliquot (usually 2 ΜL) of a 2-ml suspension of pUR288-transfected بكتريا قولونية is plated on a titer plate that has been supplemented with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal). X-Gal is cleaved by β-Gal, which produces a blue halo around growing LacZ + colonies. Note that LacZ − mutants will be missed on the dilution plate (no blue halo), but this is negligible because the ratio between LacZ + to LacZ − colonies is on the order of 10 4 :1. Note further that the cleavage of X-Gal releases galactose, which is converted to the same toxic UDP-galactoside derived from P-Gal however, the amounts of galactose liberated from X-Gal are small and therefore compatible with the growth of LacZ + colonies [the molar concentration of X-Gal (183 ميكرومتر 75 ميكرومترg/ml) is 64 times lower than that of P-Gal (11.7 mم, 3 mg/ml)]. The remaining part of the suspension (1998 ميكرومترl) is plated on a single P-Gal plate to select for mutants. Mutants grow as small, red, formazan-stained colonies in the presence of a tetrazolium salt that should be added for improved visibility of the sometimes tiny colonies. The mutant frequency is calculated as the ratio of mutants to nonmutants that is, the number of colonies on the P-Gal selection plate to the number of colonies (×1000) on the X-Gal titer plate. To characterize the mutational spectrum, mutant colonies can be picked and used directly as templates in long-range PCR amplifications of the entire لاكز gene. The PCR fragments are useful for restriction analysis and DNA sequencing. Plasmid DNA minipreparations are equally useful if it is decided not to use PCR for template preparation. Excellent reviews of the pUR288 assay including detailed protocols and sections on troubleshooting are available. 13–15 More specialized articles on the detection of so-called color mutants, 16 the nature of background mutations, 17 and sources of assay variability 18 have also been published. In addition, a commercial kit-based version of the assay—together with technical support, a step-by-step protocol, and accessory services, such as mutational analysis by DNA sequencing and two-dimensional electrophoresis—is being offered by Leven ( www.leveninc.com ). Our overall experience with the assay is positive, but attention must be paid to preparing DNA of high quality [even small amounts of impurities (proteins, salts, organic solvents) can sometimes decrease the rescue efficiency of the shuttle vector] and avoiding contamination with unrelated plasmids that are lacZ − , lacO + , and ampicillin resistant. Plasmids of this nature (e.g., derivatives of pBluescript) are in widespread use in many laboratories, and they can easily show up as false “pUR288 mutants” after finding their way into reagents or laboratory space where the mutagenesis assay is performed.

الشكل 4. في الجسم الحي mutagenesis assay, using pUR288. (A) Plasmid-derived shuttle vector pUR288. CRP, cAMP receptor protein ori, origin of replication لاكز, gene encoding β-Gal هينdIII, restriction site used to release the plasmid from genomic DNA. (B) Principle of the assay: LacZ− mutants are positively selected on P-Gal plates. See text for additional details.


شاهد الفيديو: الأحياء - 3ث - التكاثر: التبرعم في فطر الخميرة والهيدرا (كانون الثاني 2022).