معلومة

الأنماط الظاهرية التي تسببها الطفرات في الحمض النووي للميتوكوندريا؟


هل ستؤثر الطفرات في الحمض النووي للميتوكوندريا بالضرورة على الأنماط الظاهرية؟

لدي بعض المعرفة السريعة بنظرية الخلية التكافلية المتسلسلة ، وأجد صعوبة في اعتبار أن الحمض النووي للخلية السابقة - الآن العضية - سيؤثر على أي شيء خارج الميتوكوندريا نفسها ، على الرغم من أنني أستطيع أن أتخيل تغيير عمليات الميتوكوندريا التي لها تأثير غير مباشر على العمليات غير الميتوكوندريا المرتبطة بأنماط ظاهرية معينة.


بافتراض أنني فهمت (وأعدت صياغة) السؤال بشكل صحيح ، أجد المنطق غريبًا. إن الاضطراب أو التغيير في العملية هو الذي ينتج تغيرات نمطية بعد حدوث طفرة في الجين ، لذلك إذا كانت العملية حاسمة للحياة - مثل تلك التي تحدث في الميتوكوندريا - فما الفرق الذي يحدثه حيث يتم تشفيرها؟

ربما تكون المشكلة هي نظرية التكافل الداخلي لأصل الميتوكوندريا. نعم ، يعتقد معظمنا ذلك ، ولكن ، مهما كانت منذ ملايين السنين ، فإن الميتوكوندريا هي جزء لا يتجزأ من حقيقيات النوى الحديثة. حدثت تغييرات واسعة النطاق ، وأكثرها صلة بتوضيح طريقة التفكير هذه هي حقيقة أن معظم جينات الميتوكوندريا البشرية مشفرة الآن في النواة. هل ستكون هذه الجينات أكثر أو أقل احتمالًا لإنتاج أنماط ظاهرية عند حدوث طفرة؟ بالكاد.

الآن إلى الحقائق. من المؤكد أن هناك طفرات في جينات الميتوكوندريا مرتبطة بالمرض في الإنسان وبالتالي تنتج أنماطًا ظاهرية. بعضها مدرج في الجدول أدناه ، مأخوذ من مراجعة قام بها تايلور وتورنبول في عام 2004.

حساب ل الحمض النووي للميتوكوندريا وأمراض الميتوكوندريا هذا هو مكتوب لجمهور أقل تقدمًا قابض مقالة - سلعة.


لا ، لن يحدث ذلك بالضرورة تؤثر على النمط الظاهري. بالطبع ، الطفرات الصامتة أو غير المنطقية ممكنة في mtDNA تمامًا كما هو الحال في الحمض النووي الجيني.

لكن على سبيل المثال: في بعض الحالات ، يمكن أن تسبب التغيرات الموروثة في الحمض النووي للميتوكوندريا مشاكل في نمو وتطور ووظيفة أنظمة الجسم. تعطل هذه الطفرات قدرة الميتوكوندريا على توليد الطاقة بكفاءة للخلية.

(https://ghr.nlm.nih.gov/primer/mutationsanddisorders/mitochondrialconditions)


ديناميات مغاير الحمض النووي للميتوكوندريا: الآثار المترتبة على صحة الإنسان والمرض

تحتوي الميتوكوندريا على الجينوم الخاص بها ، والذي يتم توريثه عن طريق الأم ورموز البولي ببتيدات التي تشكل سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا. الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) له بنية ورمز يختلفان عن تلك الموجودة في الجينوم النووي.

تساهم طفرات mtDNA في المرض البشري عبر مجموعة من الشدة ، من الطفرات النادرة شديدة الاختراق التي تسبب الاضطرابات أحادية الجين التي غالبًا ما تؤثر على الجهاز العصبي والعضلات والقلب وأعضاء الغدد الصماء ، إلى الطفرات التي لها مساهمة أقل اعتدالًا في السمات المعقدة الشائعة والمتأخرة بداية الاضطرابات.

العديد من البشر الأصحاء لديهم مستويات منخفضة (& lt1٪) من طفرات نقطة mtDNA ، بما في ذلك الطفرات الموروثة والمكتسبة. يمكن أن يساهم العبء المتزايد للطفرات المكتسبة في ظهور الأمراض المتأخرة.

بدأت الدراسات في الكائنات الحية النموذجية في تقديم نظرة ثاقبة للآليات التي يتم من خلالها قمع اكتساب طفرات mtDNA جديدة ، لا سيما في الخط الجرثومي.


النتائج

توليد نموذج مرض بشري متماثل المنشأ قائم على hESC لتقييم الدور المُمْرِض لـ DNAJC6 طفرة في PD

DNAJC6 ترتبط الطفرات الجينية لدى مرضى شلل الرعاش بطفرات متماثلة اللواقح تسبب فقدانًا لوظيفة الجين. لإنشاء نموذج للمرض البشري في المختبر لتقييم الدور الممرض لـ DNAJC6 في PD ، أنشأنا متماثلًا DNAJC6 الاستئصال في hESCs باستخدام CRISPR-Cas9 مع RNA أحادي الدليل (sgRNA) الذي يستهدف DNAJC6 موضع الجين ، الذي يمتد من intron 6 إلى exon 7. تم صنع sgRNA عن طريق محاكاة الطفرة الجينية (c.801-2 A → G) التي تم الإبلاغ عنها في PD العائلي ، والتي تسبب فقدان التعبير الجيني بسبب عدم استقرار mRNA (3). بعد cotransfecting hESCs (H9) باستخدام ترميز البلازميد Cas9 و sgRNA ، تم الحصول على المستعمرات المشتقة من خلية واحدة وتوسيعها بممرات تسلسلية (الشكل S1A). من بين تلك المشتقة من المستعمرات ، تم اختيار ثلاثة خطوط خلوية تحتوي على طفرات ثنائية (متماثلة اللواقح) للتحليل ، مع ثلاثة hESCs من النوع البري (WT) مشتقة من المستعمرات التي خضعت لنفس تفاعلات CRISPR-Cas9 ولكن بدون sgRNA (الشكل 1 ب). 1A والشكل S1 و B و C). تمشيا مع النتائج التي توصل إليها Edvardson وآخرون. (3) ، وأظهرت المسوخ DNAJC6 عدم استقرار الرنا المرسال (الشكل 1 ب) ربما عن طريق اضمحلال الرنا المرسال غير المعقول (NMD) (28) ، الأمر الذي أدى في النهاية إلى تقليل تعبير الرنا المرسال والبروتين (الشكل 1 ، C إلى E). ومع ذلك ، فإن انخفاض تعبير DNAJC6 لم يغير خصائص hESC مثل تعبير علامة متعددة القدرات ، أو نمو الخلية ، أو التجديد الذاتي ، أو بقاء hESCs (الشكل S2 ، A إلى D).

(أ) ملخص لتسلسل الجينات المحورة في DNAJC6 تم توليد hESCs متحولة (Δ1 ، 2 ، 3) في دراستنا. (ب) DNAJC6 استقرار مرنا في WT و hESCs متحولة. DRB ، 5،6-dichloro-1-beta- d -ribofuranosylbenzimidazole ، مثبط نسخ mRNA. (ج إلى ه) مرنا وتعبيرات البروتين DNAJC6 مقدر من خلال تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) (C) ، لطخة غربية (WB) (D) ، وتحليلات كيميائية مناعية (E). أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر. (F) رسم تخطيطي لـ hESCs متمايزة إلى hMLOs ، والخلايا الجذعية / السلائف العصبية ثنائية الأبعاد VM (NSCs) ، وثقافات الخلايا العصبية mDA ، المستخدمة كمنصة تجريبية. (جي إلى ا) التعبير عن العلامات المبكرة (FOXA2 و LMX1A و EN1) والمتأخرة (NURR1) الخاصة بالدماغ المتوسط. تم تحديد تعبيرات علامة الدماغ المتوسط ​​المبكرة والمتأخرة في WT و hMLOs المتحولة في DIV15 و DIV30 ، على التوالي ، باستخدام الكيمياء المناعية (G ، H ، J ، L ، و N) و qPCR (I ، K ، M ، و O) تحليلات. لتقدير الخلايا الإيجابية للعلامة ، تم تجميد خمسة hMLOs من خمس دفعات مختلفة من كل WT وثقافات متحولة بسمك 16 ميكرون ، وتم حساب الخلايا الإيجابية كل خمسة أقسام من كل hMLO. أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر. (ص إلى ص) تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) لـ WT مقابل ثقافات hMLO المتحولة في DIV0 و DIV4 و DIV15 و DIV30. (P) مجموعات هرمية غير خاضعة للرقابة للجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) بين WT و hMLOs متحولة [أجزاء لكل كيلو قاعدة من النص لكل مليون قراءة معينة (FPKM) و GT1 ، وتغيير أضعاف و GT2]. (Q و R) Scatterplots من DEGs التي تسلط الضوء على الجينات التنموية للخلايا العصبية mDA متضمنة في الأكثر أهمية والأكثر تنظيمًا في WT hMLOs مقابل hMLOs متحولة في DIV15 و DIV30. يتم تقديم البيانات كوسائل ± SEM ، ن = 3 تجارب مستقلة. أهمية في *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، للطالب ر اختبار n.s.

عيوب تنميط الدماغ المتوسط ​​البطني المبكر عن طريق الضرر DNAJC6 طفره

للتحقيق في دور DNAJC6 طفرة في التسبب في مرض PD ، تسببنا في التمايز بين خطوط متحولة و WT hESC تجاه hMLOs التي تشبه VM النامي ، وهي منطقة الدماغ التي تتأثر بشكل أساسي في PD (الشكل 1F والشكل S3A). في يوم التمايز 15 [DIV (أيام في المختبر) 15] ، احتوت hMLOs المتمايزة عن WT-hESCs على العديد من تركيبات PLZF + أو SOX2 + الوردية الظهارية العصبية (الأنبوب العصبي) ، والتي تتميز بقطبية apico-basal مع ZO-1 ، ZO-2 ، تعبير N-CADHERIN و OCLUDIN في الجانب القمي (الشكل S3 ، C إلى E). كانت الوريدات ملطخة بعلامات للجذع / السلائف العصبية العامة (NESTIN) ، والدماغ الجنيني الأمامي (OTX2) ، والدماغ المتوسط ​​الجنيني (EN1) ، وخلايا الصفيحة الأرضية VM (FOXA2 و LMX1A) (الشكل 1 ، G ، H ، J ، و L ، والتين. وتجدر الإشارة إلى أن هياكل الأنبوب العصبي كانت أقل سلامة في hMLOs المتحولة من WT hMLOs (الشكل S3 ، C إلى F) ، جنبًا إلى جنب مع تعبير OCLUDIN القمي المنخفض (الشكل S3E) ، والذي يتم التحكم فيه عن طريق إشارات WNT الكنسية (29). علاوة على ذلك ، تم تقليل التعبير عن LMX1A و EN1 من المرحلة المبكرة من hMLOs المتحولة (DIV15) بشكل ملحوظ (الشكل 1 و G و J إلى M). يعمل LMX1A ، جنبًا إلى جنب مع FOXA2 ، كمنظم رئيسي لتطوير الخلايا العصبية mDA في الجهاز الظاهري المتطور عن طريق تحفيز التعبير عن بطارية من جينات التطور اللاحق ، مثل نور 1, PITX3، و NGN2، والتفاعل معهم بطريقة تلقائية للحث على توليد الخلايا العصبية لـ MDA (1517). باستمرار ، التعبير عن جين التطور اللاحق نور 1 تم تخفيضه في hMLOs متحولة في يوم تمايز لاحق (DIV30) (الشكل 1 و G و N و O).

بالإضافة إلى ثقافة أورجانويد ، استخدمنا ثقافة NSC المعزولة من hMLOs المبكرة ذات النمط VM (الشكل 1F والتين. S3B). تعد ثقافة NSC المشتقة من hMLO موحدة فيما يتعلق بالتعبير عن مجموعة من العلامات الخاصة بـ VM-NSC ويمكن تحفيزها بسهولة للتمييز بين الخلايا العصبية الأصلية لـ MDA التي تعبر عن علامات خاصة بالدماغ المتوسط ​​في نمط مشابه لتطور الخلايا العصبية MDA في التطور. الدماغ المتوسط ​​(الشكل S3B). على أساس هذه الخصائص ، قررنا استخدام ثقافة NSC كمنصة بحث لدراسة الآليات المسببة للأمراض لـ PD. عندما تم اشتقاق NSCs من WT hMLOs ، فقد عبروا بشكل موحد عن FOXA2 و LMX1A الخاصين بـ VM (& gt95 ٪ من إجمالي الخلايا). التعبير عن جين التطور اللاحق نور 1 بدأت بعد 3 إلى 5 أيام من تحريض التمايز لـ WT NSCs تجاه الخلايا العصبية mDA (الشكلان S3B و S4). تجلت أيضًا انخفاضات LMX1A و EN1 (يوم تمايز التوسع 0 ، D0) ، وتعبير NURR1 (D5) أيضًا في NSCs وتمييز NSCs المستمدة من hMLOs المتحولة ، على التوالي (الشكل S4 ، A إلى I).

للحصول على نظرة جزيئية حول العيوب التنموية بوساطة استئصال DNAJC6 ، قمنا بتحليل النسخ العالمية للعضيات المتحولة و WT على مدار النقاط الزمنية أثناء تمايز hESC-hMLO. كشفت التحليلات مع المجموعات الهرمية غير الخاضعة للرقابة أن النسخ من hMLOs WT و hMLOs المتحولة كانت متشابهة في أيام ثقافة hMLO غير المتمايزة (DIV0) وأيام ثقافة hMLO المبكرة (DIV4) ولكنها أصبحت منفصلة عن بعضها البعض بواسطة DIV15 (الشكل 1P). على الدوام ، أظهرت تحليلات علم الوجود الجيني (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) أن الجينات الخاضعة للتنظيم الخافت في hMLOs المتحولة (مقابل WT hMLOs) في DIV15 قد تم إثرائها في أنطولوجيات "تطور الدماغ المتوسط" و "تمايز الخلايا العصبية DA "(مظلل باللون الأخضر في الشكل 2 أ). على وجه التحديد ، التنظيم السفلي للجينات التنموية الرئيسية للخلايا العصبية MDA LMX1A, OTX1, OTX2, EN1, EN2, نور 1, PTX3, NGN2, ASCL1 (MASH1)، و MYT1L تم عرضه في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) الخاصة بـ hMLOs المتحولة في DIV15 و DIV30 (الشكل 1 و Q و R). انخفاض التعبيرات LMX1A, EN1، و نور 1 في جميع المسوخات الثلاثة تم التحقق من صحتها بشكل أكبر من خلال تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) (الشكل 1 ، K ، M ، و O).

(أ و ب) أعلى مسارات GO و KEGG للجينات الخاضعة للتنظيم في hMLOs متحولة (مقابل WT hMLOs) في DIV15. يتم تمييز "مسار إشارات WNT" باللون الأحمر. "تطوير mDA" - يتم تمييز الفئات ذات الصلة باللون الأخضر. (ج) خريطة الحرارة لتعبيرات السيتوكينات WNT والمستقبلات والمنشطات في بيانات RNA-seq. تظهر قيم التعبير كسجل2-تعداد القراءة المقيسة المحولة. (د) أظهر تحليل تخصيب مجموعة الجينات (GSEA) إثراء إشارات WNT في خلايا WT مقارنة بالطفرة DNAJC6. (ه إلى جي) تحليلات الكيمياء الخلوية المناعية (E) و WB (F) لتحديد مستويات بروتين cat-catenin في WT و hMLOs المتحولة في DIV15. تم قياس شدة النطاقات في (F) باستخدام برنامج ImageJ ، وتم تطبيع القيم إلى نازعة هيدروجين الغليسيرالديهيد -3 فوسفات (GAPDH) (G). WCL ، محلول الخلية الكاملة CE ، مستخلص عصاري خلوي NE ، مستخلص نووي. أشرطة مقياس ، 100 ميكرومتر. (ح إلى ي) تحليلات الكيمياء الخلوية المناعية (H) و WB (I) لتحديد مستويات بروتين R-spondin 2 في WT و hMLOs المتحولة في DIV15. تم قياس شدة النطاقات في (I) باستخدام برنامج ImageJ ، وتم تطبيع القيم إلى GAPDH (J). (ك و إل) تم تقييم قدرة الخلايا الداخلية عن طريق امتصاص صبغة FM1-43 (K). تم قياس شدة الإسفار لـ FM1-43 باستخدام ImageJ في 30 خلية تم اختيارها عشوائيًا من كل ثقافات WT و NSC المتحولة (L). أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر. (م و ن) انخفاض مستويات بروتين بيتا كاتينين عن طريق علاج مثبط الالتقام الخلوي بوساطة الكلاذرين (M). تم إجراء تحليل WB في ثقافات VM-NSC المشتقة من WT1-hMLOs. تم قياس شدة النطاقات في (M) باستخدام برنامج ImageJ ، وتم تطبيع القيم إلى GAPDH (N). يتم تقديم البيانات كوسائل ± SEM. ن = 3 تجارب مستقلة. DMSO ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد. أهمية في *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، للطالب ر اختبار (G و J و L) وتحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار Bonferroni اللاحق (ن).

يتسبب فقدان الالتقام الخلوي بوساطة DNAJC6 في حدوث خلل في التنظيم الذاتي لـ WNT-LMX1A

في بيانات RNA-seq في hMLO DIV15 ، كانت إحدى الفئات الأعلى للجينات الخاضعة للتنظيم السفلي في hMLOs المتحولة (مقابل WT hMLOs) هي "مسار إشارات WNT" (مظلل باللون الأحمر في الشكل 2 ، A و B) ، جنبا إلى جنب مع خفض مستويات mRNA للسيتوكينات WNT ، والمستقبلات ، والمنشطات (الشكل 2C). تم تأكيد إثراء إشارات WNT جنبًا إلى جنب مع تطور الخلايا العصبية mDA من خلال تحليل تخصيب مجموعة الجينات (الشكل 2D). تم الإبلاغ عن أن إشارات WNT ضرورية للتطور المبكر للخلايا العصبية MDA (30). يتقارب مسار WNT الكنسي في تنشيط β-catenin وانتقاله إلى النواة ، حيث يعمل كمنشط للحث على نسخ الجينات بوساطة عامل الخلايا التائية / المحسن اللمفاوي (TCF / LEF). في تحليلات الكيمياء الخلوية المناعية وتحليلات اللطخة الغربية (WB) ، تم تقليل مستويات البروتين لـ cat-catenin (خاصة في النواة) بشكل كبير في hMLOs الطافرة بواسطة DIV15 (الشكل 2 ، E إلى G). بالإضافة إلى ذلك ، التنظيم السفلي لمركب R-spondin 2 (RSPO2) ، المحفز المشترك لإشارات WNT / β-catenin ، والذي يمنع إزالة مركب مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة (LRP) المرتبط بمستقبلات البروتين الدهني (LRP) (31) ، تجلى أيضًا في hMLOs متحولة (الشكل 2 ، H إلى J).

من المعروف أن تنشيط إشارة WNT يتطلب الالتقام الخلوي بوساطة الكلاذرين (CME) لمجمعات مستقبلات يجند WNT [تمت مراجعته في (32)]. بما يتوافق مع دور DNAJC6 في CME (2) ، تم تقييم قدرة الالتقام ، التي تم تقييمها من خلال امتصاص صبغة FM1-43 ، بشكل واضح في ثقافات NSC المتحولة (الشكل 2 ، K و L). علاوة على ذلك ، أدى علاج مثبط CME Dyngo-4a (مثبط الدينامين) و PitStop2 (مثبط clathrin) في WT NSCs إلى انخفاض في مستويات β-catenin داخل الخلايا (الشكل 2 ، M و N) ، مما يشير بشكل جماعي إلى أن ضعف CME تسبب عن طريق فقدان DNAJC6 هو المسؤول عن التنظيم السفلي لإشارة WNT في hMLOs متحولة.

LMX1A و EN1 هي أهداف محتملة لنسخ WNT-β-catenin بوساطة (15, 33, 34). باستمرار ، جنبًا إلى جنب مع المستويات النووية المنخفضة من β-catenin (الشكل 2 و F و G) والتنظيم السفلي لـ LMX1A و EN1 أظهر تعبير mRNA (الشكل 1 ، K و M) ، تحليل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) إثراءًا أقل لبروتينات cat-catenin المرتبطة بمناطق المروج لـ LMX1A و EN1 في ثقافات NSC المتحولة (الشكل S6 ، A إلى D) ، مما يؤكد انخفاض التعبير عن LMX1A و EN1 في متحولة DNAJC6 يتم التوسط في الثقافات من خلال إشارات WNT-β-catenin الكنسية الضعيفة.

بينما ينظم WNT-β-catenin LMX1A و EN1, LMX1A ينشط أيضًا نسخ ملفات WNT السيتوكينات (15, 35) و RSPOs (36, 37). باستمرار ، جنبا إلى جنب مع انخفاض مستويات الرنا المرسال من WNT1, WNT4، و RSPO2 في الثقافات المتحولة (الشكل 2C والتين. S6 ، E إلى G) ، قسريًا LMX1A التعبير في NSCs متحولة تعافى بشكل كبير WNT السيتوكين و RSPO2 التعبير (الشكل S6H) ، مشيرًا إلى أن حلقة تنشيط النسخ المتبادلة بينهما LMX1A و WNT تم إنشاؤه في hMLO المبكر ، على غرار VM الجنيني المبكر (15) وأن المسار التنظيمي الإيجابي يتم إلغاؤه بفقدان وظيفة DNAJC6. تشير النتائج التي توصلنا إليها معًا إلى أن فقدان CME بوساطة DNAJC6 يتسبب في ضعف إشارات WNT ، بوساطة WNT LMX1A و EN1 التعبير ، وفي النهاية WNT-LMX1A تنظيم ردود الفعل الإيجابية ، وهو أمر بالغ الأهمية لنمذجة VM المبكرة وتطور الخلايا العصبية MDA ، في hMLOs متحولة.

ضعف WNT-LMX1A المبكر في DNAJC6 أسفرت المسوخات عن خلايا MDA ضعيفة بدون تعبير عامل خاص بالدماغ المتوسط

انخفض التعبير عن LMX1A و EN1 في المراحل المبكرة من hMLOs الطافرة يمكن اعتبارها عاملاً مساهماً في التسبب في مرض PD. استمد هذا الافتراض من حقيقة أن هذه الجينات مع جيناتها النهائية نور 1 الاستمرار في التعبير في الخلايا العصبية البالغة من mDA ، والتعبير عن هذه العوامل الخاصة بالدماغ المتوسط ​​في الخلايا العصبية البالغة من mDA أمر بالغ الأهمية للبقاء ومقاومة الإهانات السامة (1820). لذلك ، انخفض التعبير عن LMX1A و EN1 في التطور المبكر يمكن أن ينتج الخلايا العصبية MDA مع انخفاض هوية الدوبامين ، مما يجعلها عرضة للإهانات السامة.

كانت خلايا TH + نادرة في البداية ، مع وجود أشكال عصبية غير ناضجة سائدة في فترات hMLO المبكرة (DIV15 إلى DIV30). زادت الخلايا العصبية TH + تدريجياً خلال فترة مزارع hMLO (الشكل S7A) وبما يتفق مع دراسة سابقة (38) ، أصبحت الأغلبية في DIV50 إلى DIV70 من hMLOs (شكل S7 ، A و B). كما عبّروا أيضًا عن جينات أخرى خاصة بعصبونات DA دات, VMAT2، و AADC، مما يؤكد الأنماط الظاهرية للخلايا العصبية DA لخلايا TH + (الشكل S3A). بما يتوافق مع التعبير المستمر عن الجينات التنموية للخلايا العصبية MDA (39) ، الخلايا العصبية TH + DA في أواخر WT hMLOs وثقافات WT-NSC المتباينة عبرت بأمانة في وقت مبكر (LMX1A و EN1) والمتأخرة (NURR1) عن العوامل التنموية (الشكل 3 ، A إلى L ، والشكل S3 ، A و B). على النقيض من ذلك ، أدى العجز المبكر في تعبير LMX1A في hMLOs المتحولة (الشكل 1 و G و J و K) إلى ظهور خلايا عصبية TH + DA ذات عوائد أقل (تصل إلى 50٪ من عوائد WT) ومع تعبير منخفض بشكل ملحوظ عن علامات خاصة بالدماغ المتوسط ​​(الشكل 3 ، أ إلى ل). تمشيا مع أدوار عوامل الدماغ المتوسط ​​في بقاء الخلايا العصبية في mDA ، أظهرت الخلايا العصبية TH + DA في خلايا hMLOs الطافرة أجسامًا خلوية صغيرة ومنكمشة مع عصبونات مختصرة ومجزأة ، وهي علامة على موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية وتنكسها (الشكل 3 ، M و N). كانت زيادة الخلايا المبرمجية (كاسباس 3 + المشقوق) متبوعة بموت الخلايا الحاد (EthD1 +) ، مقارنة مع WTs ، كانت واضحة في المتأخر hMLOs التي تحمل DNAJC6 الطفرات (الشكل 3 و Q و R و U و V) ، مما أدى إلى تقليل أحجام hMLO الطافرة من فترات الثقافة المتأخرة (الشكل S7 و C و D).إلى جانب انخفاض الغلة وتعبير العامل الخاص بالدماغ المتوسط ​​في خلايا TH + ، تجلى زيادة تنكس الخلايا العصبية DA وموت الخلايا في الثقافات المتمايزة عن NSCs الطافرة (الشكل 3 ، O ، P ، S ، T ، W ، و X) .

(أ إلى إلتعبير عامل خاص بالدماغ المتوسط ​​في الخلايا العصبية DA في أواخر hMLO (A ، B ، E ، F ، I ، J) وثقافات NSC المتمايزة (C ، D ، G ، H ، K ، L). الصور المعروضة تمثيلية ومأخوذة من الثقافات المشتقة من WT1 و mutant-3. أشرطة مقياس ، 25 ميكرومتر. (م إلى X) تم تقييم تنكس الخلايا العصبية DA من خلال تحليل شكلي على الخلايا العصبية TH + (M إلى P) ، ونسبة الخلايا المبرمج (كاسباس المشقوق 3 +) (Q إلى T) ، ونسبة موت الخلايا (EthD-1 +) الخلايا (U إلى X) ). الأشكال الداخلية في (U) و (W) هي خلايا Hoechst +. في التحليل المورفومتري ، تم تقدير طول ألياف TH + لكل خلية عصبية DA في WT والثقافات المتحولة ، ن = 3 مكررات بيولوجية في كل ثقافة مشتقة من WT وطفرة ، تم تقييم 30 خلية TH +. أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر. يتم تقديم البيانات كوسائل ± SEM ، ن = 3 تجارب مستقلة. أهمية في *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، للطالب ر اختبار.

تم اكتشاف اعتلال Synucleinopathy وتنظيم ضربات القلب المجهد في HMLOs المتأخرة وخلايا MDA التي تحمل DNAJC6 المسوخ

أظهر تسجيل الخلايا العصبية خارج الخلية باستخدام مجموعة أقطاب متعددة زيادة في ترددات إطلاق النار في hMLOs المتحولة (أكثر من ضعف تلك الموجودة في WT hMLOs) في DIV80 (الشكل 4A والشكل S8 ، A و B). إن الزيادة في تردد جهاز تنظيم ضربات القلب الداخلي ("تنظيم ضربات القلب المجهد") هو خاصية عصبية في PD التدريجي ، والذي ينتج عن ضعف الأكسدة في قنوات البوتاسيوم من النوع A Kv4.3 (40). بالإضافة إلى ذلك ، حفزت المستويات المنخفضة من النواقل العصبية DA بسبب الإفراج المعيب قبل المشبكي DA تواتر الإطلاق الداخلي للخلايا العصبية MDA عبر تحفيز مستقبل D1 (41, 42). كان الإجهاد التأكسدي المقدر بواسطة ثنائي هيدروكلورو فلورسين ثنائي الأسيتات (DCF) ، وهو صبغة تكتشف أنواع الأكسجين التفاعلي الخلوي (ROS) ، أكبر بكثير في ثقافات hMLO الطافرة و hNSC (الخلايا العصبية mDA) المتمايزة مقارنة بنظيراتها في WT (الشكل 4 و B و C). بالإضافة إلى ذلك ، بما يتفق مع عيوب إعادة تدوير الحويصلة المشبكية مع ضعف CME في الخلايا العصبية المشتقة من فئران Dnajc6-KO [(6) والشكل 2 و K و L] ، ظهرت مستويات أقل بكثير من إطلاق DA (خاصة عند استحضارها عن طريق إزالة الاستقطاب) في الثقافات الطافرة (الشكل 4 د). انخفاض إطلاق DA في متحولة DNAJC6 من المحتمل أيضًا أن يكون ناتجًا عن الانخفاض في استقلاب DA داخل الخلايا نفسه ، مثل الإنزيمات الرئيسية المحددة لإنتاج DA ، مثل ذ و DDC، أقل في hMLOs متحولة (الشكل 4E).

(أ) مخططات عابرة من مصفوفة متعددة الأقطاب مع إشارات عصبية تم فرزها ومعدل إطلاق الإشارات العصبية بمرور الوقت المسجلة من WT وDNAJC6 عضويات hMLO باستخدام مسبار عصبي مكون من 16 قطبًا كهربائيًا. (ب و ج) قياس أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) في hMLO (قضبان مقياس ، 500 ميكرومتر) وثقافات NSC المتباينة (أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر) من خلال ثنائي هيدرو كلورو فلورسين ثنائي أسيتات (DCF) يتم تقديم DA تلطيخ (B) مستوى ROS كقيمة متوسط ​​كثافة مضان (ج). ن = 3 تجارب مستقلة. (د) التحديد الكمي لإصدار DA في hMLO DIV94 و NSC D15 المتمايزة. ن = 3 تجارب مستقلة. mnt ، دقائق. (ه) خريطة الحرارة لتعبيرات التمثيل الغذائي لـ DA ، ونقل DA ، والجينات المرتبطة بجهاز تنظيم ضربات القلب في بيانات RNA-seq. يتم عرض قيمة التعبير كسجل2 أضعاف التغيير من ΔDNAJC6 مقابل WT hMLO DIV15 و DIV30 على التوالي. (F إلى أنا) تحليل WB لتحديد مستويات بروتين α-syn الذاتية من Triton X-100 (Tx-100) - الأجزاء القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان من WT وDNAJC6 hMLO في DIV55 و DIV130 (F و H). تم قياس شدة النطاقات في (F) و (H) باستخدام برنامج ImageJ ، وتم تطبيع القيم إلى GAPDH (G و I). ن = 3 تجارب مستقلة. (ي إلى م) الكشف داخل الخلايا عن تجميع α-synuclein باستخدام تكملة مضان ثنائية الجزيئية (BiFC) على hMLO DIV55 و hNSC D12 (I). تم إجراء تحليل على hMLO DIV55 باستخدام تصوير CLARITY وتأكيد إضافي بواسطة عضوي مقطوع (سمك ، 30 ميكرون) من نفس الدفعة وتحليلها باستخدام (كنفوكل) (J). يظهر تجميع α-Syn من حيث النسبة المئوية لخلايا BiFC + ، ن = 3 تجارب مستقلة (K) ، وعدد BiFC + النقاط لكل خلية (L) ، وعدد BiFC + / pSer129-αSyn + النقاط لكل خلية (M) ، ن = 30 خلية تم تحليلها في كل مجموعة. أشرطة المقياس ، الوضوح ، 200 ميكرومتر 30 ميكرومتر لصورة عالية التكبير hNSC ، 50 ميكرومتر. ND ، لم يتم الكشف عنها. يتم تقديم البيانات كوسائل ± SEM. أهمية في *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، للطالب ر اختبار.

في تحليلات WB ، تم اكتشاف أوليغومرات α-syn السامة (Triton) بسهولة في الكسور القابلة للذوبان Triton X-100 من hMLOs المتحولة (الشكل 4 و F و G) ، في حين تم اكتشاف القليل من القسيمات في WT hMLOs عند DIV55. كان علم أمراض α-syn في hMLOs المتحولة أكثر تقدمًا مع زيادة تكوين مجاميع α-syn ذات الوزن الجزيئي المرتفع في كسور SDS القابلة للذوبان (Triton X-100 – غير قابلة للذوبان) في DIV130 (الشكل 4 ، H و I). بالإضافة إلى الأشكال المجمعة لهذا البروتين ، تمت زيادة مونومر α-syn أيضًا في hMLOs المتحولة ، مما أدى إلى زيادة جذرية في إجمالي مستويات بروتين α-syn بفقدان DNAJC6. لا يمكن تمييز تعبير mRNA الداخلي عن α-syn بين ثقافات WT والثقافات الطافرة (الشكل S8C) ، مما يشير بشكل جماعي إلى وجود خلل في بروتين α-syn في hMLOs متحولة DNAJC6. على عكس hMLOs ، لم نتمكن من اكتشاف α-syn الذاتية في كل من WT والخلايا العصبية المتحولة (الشكل S8D). قمنا بعد ذلك بفحص ميل تكوين الركام من خلال WT α-syn المُدخل خارجيًا. تم تشكيل كميات أكبر بكثير من الركام من خارجي α-syn في الخلايا العصبية الطافرة (hNSC D12) من تلك الموجودة في WTs (الشكل S8D). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتقييم كمي زيادة قلة القلة داخل الخلايا α-syn في متحولة hMLO DIV55 و hNSC D12 باستخدام نظام تكملة مضان ثنائي الجزيء (BiFC) (43) ، حيث يمكن الكشف عن ثنائيات α-syn وأوليغومرات داخل الخلايا عن طريق التألق الأصفر في الخلايا المنقولة بواسطة α-syn مدمجة إما في الطرف الأميني (N) (V1S) أو جزء الكربوكسي (C) (SV2) من الزهرة ، a متغير من البروتين الأصفر الفلوري (الشكل 4 ، J إلى M). تم تأكيد تشكيل α-syn multimers في ثقافات hMLO الطافرة المتأخرة من خلال اكتشاف مجموعات الخلايا الإيجابية لـ α-syn الفسفوري في سيرين 129 (p129-α-syn pS129) ، والتي كانت إيجابية مزدوجة لـ ProteoStat ، صبغة محددة للبروتينات المجمعة (الشكل S8E).

تكمن عيوب الميتوكوندريا والعضلات الجسمية في تراكم α-syn المرضي في DNAJC6 الخلايا العصبية المتحولة

يعد الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا سمة مهمة في التسبب في مرض PD ، حيث يساهم في تكوين سوء طي α-syn والإجهاد التأكسدي (44). تم عرض أدوار العوامل الخاصة بالدماغ المتوسط ​​LMX1A و EN1 و NURR1 في وظائف الميتوكوندريا والتكوين الحيوي في الخلايا العصبية لـ MDA (21, 23, 24). بالاتفاق مع هذه التقارير ، من المحتمل جدًا أن تخضع الخلايا العصبية المتحولة لـ MDA التي تفتقر إلى تعبيرات عامل الدماغ المتوسط ​​لخلل وظيفي في الميتوكوندريا. تم العثور على زيادة مستويات ROS للميتوكوندريا (MitoSox الشكل 5 ، A و B) في مزارع الخلايا العصبية المتحولة لـ MDA. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا انخفاضًا كبيرًا في إمكانات غشاء الميتوكوندريا (JC-1 الشكل 5 و D و E) ، مما يشير إلى تلف الميتوكوندريا. لمزيد من التحقق من صحة تلف الميتوكوندريا في الثقافات الطافرة ، استخدمنا تعبيرًا ثابتًا عن MitoTimer ، يشفر بروتين Timer [DsRed mutant (DsRed1-E5)] مدمجًا مع تسلسل إشارة الميتوكوندريا من السيتوكروم ج وحدة أوكسيديز VIII (COX8). ينبعث متحور DsRed من التألق الأخضر عند تصنيعه حديثًا ولكنه ينقل طيف الفلورسنت بشكل لا رجعة فيه إلى اللون الأحمر عندما يتأكسد ، لذلك يمكن استخدامه أيضًا لمراقبة تلف الميتوكوندريا بسبب الإجهاد التأكسدي (45). وجدنا أن الخلايا العصبية الطافرة أظهرت شدة أعلى للفلوريسنت الأحمر ونقاط حمراء أكثر نقاءً ، مما يشير إلى الميتوكوندريا التالفة (الشكل 5 ، F إلى H). لا يمكن تمييز محتويات الميتوكوندريا ، المقدرة بعدد نسخة الحمض النووي للميتوكوندريا ، بين WT والخلايا الطافرة (الشكل 5C) ، مما يشير إلى أن حمل الميتوكوندريا لا يبدو أنه يؤثر على النتائج المرصودة لتلف الميتوكوندريا.

(أ و ب) تم الكشف عن الميتوكوندريا ROS في ثقافة NSC المتمايزة باستخدام مجسات MitoSOX Red (A). تم قياس شدة الإسفار باستخدام ImageJ في 15 منطقة مختلفة من ثلاث تجارب مستقلة (B). يتم تقديم مستويات ROS على أنها متوسط ​​كثافة التألق. أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر. (ج) تحليل qRT-PCR لنسبة الحمض النووي للميتوكوندريا في WT والخلايا العصبية المتحولة ، (ن = 3). (د و ه) التحليل المحتمل لغشاء الميتوكوندريا باستخدام JC-1 في ثقافة NSC المتمايزة (D). يشير انخفاض نسبة التألق الأحمر (مجموع JC-1) / نسبة التألق الأخضر (JC-1 مونومر) إلى إزالة الاستقطاب / اضطراب إمكانات غشاء الميتوكوندريا (E). أشرطة مقياس ، 25 ميكرومتر. (F إلى ح) صور تمثيلية لـ ميتوتيمر التعبير الجيني المراسل في ثقافات NSC المتباينة (F). يمثل التألق الأحمر متحولة Ds-Red المؤكسدة (DsRed1-E5) الناتجة عن الإجهاد التأكسدي. تم قياس تلف الميتوكوندريا على أنه النسبة الحمراء: الخضراء (G) وعدد النقاط الحمراء النقية لكل خلية. ن = 15 خلية من كل مجموعة (ح). شريط النطاق ، 10 ميكرومتر. يتم تقديم البيانات كوسائل ± SEM ، ن = 3 تجارب مستقلة. أهمية في **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، للطالب ر اختبار.

يعد ضعف التصفية الذاتية لـ α-syn أحد الأسباب الرئيسية لتراكم α-syn في PD (46, 47). وجدنا زيادة في مكونات جسيم البلعوم p62 و LC3II في الخلايا العصبية الطافرة (الشكل 6 ، A و B ، يسار). باستمرار ، وفقًا لتقييم المناعة ، أظهرت الخلايا العصبية الطافرة عددًا أكبر من p62 + نقطة ، جنبًا إلى جنب مع زيادة LC3II + / p62 + colocalization (الشكل 6 ، C إلى E) ، مما يشير بشكل جماعي إلى أن جسيمات البلعمة الذاتية قد تراكمت إما عن طريق زيادة تكوين جسيم البلعمة الأولي أو عن طريق انسداد التدفق الذاتي. لم تكن الزيادة في p62 + puncta مصحوبة بزيادة تعبير mRNA (الشكل S9A). بالإضافة إلى ذلك ، عند علاج بافيلوميسين A1 ، الذي يمنع الاندماج بين الجسيم الذاتي والليزوزوم ، زادت مستويات البروتين في LC3B-II و p62 بشكل ملحوظ في الخلايا العصبية WT ، ولكن ليس في الخلايا العصبية الطافرة (الشكل 6 ، A و B ، على اليمين) ، مما يشير إلى ذلك من المحتمل أن تكون الزيادة في البلعمة الذاتية LC3 + / p62 + في الخلايا العصبية الطافرة بسبب تدفق الالتهام الذاتي غير الفعال. قمنا أيضًا بفحص التدفق الذاتي باستخدام مسبار الفلورسنت الترادفي mCherry-GFP-LC3B ، والذي ينبعث من إشارات mCherry والبروتين الفلوري الأخضر (GFP) في مرحلة البلعمة الذاتية ، ولكن فقط mCherry الفلوري في autolysosomes بسبب الأس الهيدروجيني الحمضي من autolysosome. مقارنةً بـ WTs ، أظهرت الخلايا العصبية المتحولة المنقولة بواسطة ناقل المسبار زيادة في البلعوم الذاتي mCherry + / GFP + على حساب mCherry + autolysosomes (الشكل 6 ، F إلى H). تم تأكيد انخفاض الجسيمات الذاتية في الخلايا العصبية الطافرة بشكل أكبر من خلال الانخفاض في LAMP1 + / LC3 + نقاط النقاط (الشكل 6 ، I و J) ، مما يشير بشكل جماعي إلى أن تدفق الالتهام الذاتي قد تم حظره في المرحلة المتأخرة. كان إجمالي LAMP1 + (الشكل 6K) و LysoTracker + puncta (الشكل S9 و B و C) أيضًا أقل بشكل ملحوظ في الخلايا الطافرة. يتم التعبير أيضًا عن الواسمات الليزوزومية [بروتين الغشاء 1 المرتبط بالجسيمات الليزوزومية (LAMP1)] في الإندوسومات المتأخرة ، والتي يمكن تمييزها عن الليزوزوم عن طريق التعبير عن مستقبلات مانوز 6 فوسفات (M6PR) (48). أكد LAMP1 و M6PR coimmunostaining أيضًا الانخفاض في LAMP + / M6PR - نقاط الجسيمات الليزوزومية (الشكل S9 و D و E) ، مما يشير إلى أن الانخفاض في LAMP1 + / LC3 + كان من المحتمل أن يكون مؤشرًا على انخفاض عدد الليزوزومات. في المقابل ، تم تجميع العديد من نقاط LC3 مع LAMP1 في الخلايا العصبية الطافرة (الشكل 6 ، I و J) ، مما يشير إلى أن الاندماج بين الجسيم الذاتي والليزوزوم كان طبيعيًا في الخلايا العصبية الطافرة.

(أ و ب) تحليل WB لمكونات البلعمة الذاتية LC3BII و p62 في وجود أو عدم وجود bafilomycin A1. (B) يمثل مستويات البروتين في LC3BII و p62 (تطبيع إلى β-actin) بالنسبة إلى قيمة WT1 في الحالة القاعدية. ن = 3 تجارب مستقلة. (ج إلى ه). صورة تمثيلية لتلطيخ LC3B / p62 في ثقافات الخلايا العصبية المتمايزة (C). أشرطة مقياس ، 10 ميكرومتر لجميع الصور. التحديد الكمي لعدد p62 + نقطة نقطية لكل خلية (D) وتوحيد موقع p62 ​​+ و LC3 + النقاط لكل خلية (E). ن = 12 خلية (د) و ن = 15 خلية (E) من كل مجموعة. (F إلى ح) صورة تمثيلية للخلايا العصبية المتباينة معربًا عن mCherry-GFP-LC3B (F). الصور الداخلية و DAPI + (الرمادي) و NeuN + (الأرجواني) في نفس الحقول المجهرية. التحديد الكمي للالتهام الذاتي (النقاط الصفراء) وعدد الجسيمات الذاتية (النقاط الحمراء) لكل خلية (G و H). ن = 30 خلية. تشير رموز النجمة (*) إلى الجسيمات الذاتية. (أنا إلى ك) صورة تمثيلية لتلوين LAMP1 / LC3B في الخلايا العصبية المتباينة (I). أقحم ، صورة DAPI + / NeuN +. LAMP1 معتمدين على LC3 + النقاط لكل خلية (J). LAMP1 + نقاط النقاط لكل خلية (ك). ن = 15 (ي) و ن = 30 (ك) خلية. (إل و م) أنشطة الجلوكوسيريبروسيداز الليزوزومي 1 (GBA1) (L) والكاثيبسين (M). ن = 3 مكررات بيولوجية. (ن إلى ص) الممثل LAMP1 + / GBA + الصور في الخلايا العصبية المتباينة (N). تم قياس عدد نقاط LAMP1 + / GBA + النقاط (O) و GBA + النقاط (P) لكل خلية. ن = 24 (س) و ن = 20 خلية (ف). (س و ص) ممثل كالنيكسين + / GBA + صور (س). أعداد كالنيكسين كولوكسين + / GBA + النقاط النقطية لكل خلية (R). ن = 30 خلية. يتم تقديم البيانات كوسائل ± SEM. أهمية في *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، للطالب ر اختبار.

علاوة على ذلك ، تم تكبير الجسيمات الحالة (LAMP1 + / M6PR -) في DNAJC6 الخلايا العصبية الطافرة (الشكل S9 و D و G) ، مما يشير إلى ضعف عمليات التحلل في الجسيمات الحالة في الخلايا الطافرة. لتقييم قدرة التحلل الليزوزومي ، قمنا بقياس نشاطين تمثيليين للإنزيم [glucocerebrosidase 1 (GBA1) و cathepsin D] ، ويرتبط انخفاضهما ارتباطًا وثيقًا بـ PD (49, 50). لا يمكن تمييز تعبير GBA1 (الشكل 6P والشكل S9I) ومجموع نشاط إنزيم GBA1 (العصاري والليزوزومي) بين المسوخ و WTs (الشكل S9H). ومع ذلك ، جنبًا إلى جنب مع انخفاض في تواليس GBA والليزوزومات (LAMP1 +) (الشكل 6 ، N و O) ، تم تقليل نشاط GBA الليزوزومي بشكل كبير في الخلايا الطافرة (الشكل 6L). علاوة على ذلك ، فإن نشاط cathepsin D ، هدف المصب لـ GBA الذي يشارك بشكل مباشر في عملية التحلل الليزوزومي لـ α-syn (51) ، انخفض بشكل ملحوظ (الشكل 6M). تتم معالجة البروتينات الليزوزومية عن طريق التهريب الحويصلي عبر الشبكة الإندوبلازمية (ER) وجهاز جولجي. أظهرت النتائج السابقة أن الإفراط في التعبير عن α-syn في الخلايا العصبية للفأر يمكن أن يمنع الاتجار داخل الخلايا لـ GBA ، مما يؤدي إلى زيادة الاحتفاظ بـ GBA في ER وانخفاض GBA في الجسيمات الحالة (52, 53). بالاتفاق مع هذه التقارير ، كان نشاط مناعة GBA أكثر وفرة في مقصورات calnexin + ER للخلايا العصبية الطافرة (الشكل 6 و Q و R). علاوة على ذلك ، فإن الجسيمات الداخلية المتأخرة LAMP1 + / M6PR + ، التي تشارك في النقل الحويصلي من Golgi إلى الجسيمات الحالة ، قد انخفضت أيضًا بشكل كبير في الخلايا العصبية الطافرة (الشكل S9 و D و F). هذه النتائج مجتمعة تشير إلى أن فقدان DNAJC6 تؤدي الوظيفة إلى حدوث خلل في عملية النقل الحويصلي للبروتينات الليزوزومية وفي النهاية انخفاض في أنشطة الإنزيم الليزوزومي. تمشيا مع عمليات التحلل الجسمي الجسدي الضعيف ، كان بروتين α-syn أكثر استقرارًا في DNAJC6 الخلايا العصبية المتحولة مقارنة بالخلايا العصبية WT (الشكل S9 و J و K).

هدم DNAJC6 في NSCs على نمط VM يكرر النتائج المرضية للـ PD

متي DNAJC6 تم إجراء ضربة قاضية للجينات (KD) في ثقافة WT VM-NSC باستخدام تدخل CRISPR (CRISPRi) (54) ، لاحظنا أيضًا انخفاض تعبير عامل الدماغ المتوسط ​​في الخلايا العصبية DA المتباينة (الشكل S10 ، A إلى M). تتميز الخلايا العصبية DA المتمايزة عن NSCs KD أيضًا بعصابات مجزأة (الشكل S10N) وزيادة تجميع α-syn (الشكل S10 ، O إلى Q). بالنظر إلى أن نمط VM الخاص بثقافة NSC قد تم تحديده بالفعل ، تشير هذه النتائج إلى أنه بالإضافة إلى تعبير DNAJC6 خلال فترة التطوير المبكرة لـ VM ، فإن صيانته بعد ذلك أمر بالغ الأهمية لمنع الخلايا العصبية MDA من فقدان تعبيرات عامل الدماغ المتوسط ​​الحرجة والانحطاط يمكن أن يؤدي إلى أنماط ظاهرية PD.

قد يكون لـ DNAJC6 دور في التحلل الجسيمي الذاتي لـ α-syn بطريقة مستقلة عن LMX1A

التعبير الجبري عن DNAJC6 في hESCs الطافرة ، أنقذت العيوب في التطور العضوي إلى hMLOs مع إشارات WNT-LMX1A المستعادة (الشكل S11 ، A إلى C) ، وبالتالي أنتجت hMLOs التي تم إنقاذها الخلايا العصبية mDA التي تعبر عن عوامل خاصة بالدماغ المتوسط ​​مماثلة لتلك الموجودة في WTs مع تحسين الميتوكوندريا تعمل في ثقافات الخلايا العصبية المتمايزة (الشكل S11 و D و E). خارجي DNAJC6 يمكن أيضًا أن ينقذ التعبير في ثقافات NSC الطافرة جميع الأنماط الظاهرية للـ PD في الخلايا العصبية المتمايزة mDA (الشكل 7 ، من أ إلى و). بالنظر إلى أن LMX1A هو عامل حاسم يتوسط أدوار DNAJC6 المرصودة ، فقد تم تحسين قابلية بقاء الخلية ووظيفة الميتوكوندريا من خلال التعبير القسري عن LMX1A في الثقافات NSC متحولة (الشكل 7C). ومع ذلك ، لم يتم إنقاذ العيوب الليزوزومية ، وفقًا لتقدير عدد الليزوزومات وحجمها وتوطين بروتين GBA ، بشكل كبير عن طريق الإجبار. LMX1A التعبير (الشكل 7 و D و E). بالإضافة إلى ذلك ، تم إنقاذ تراكم α-syn المرضي (p129-α-syn + ، ProteoStat + puncta) ، والذي يتأثر إلى حد كبير بوظائف الليزوزومات (GBA) ، بشكل ضئيل بواسطة LMX1A التعبير (الشكل 7F). باتساق، LMX1A أدى استخدام KD باستخدام lenti-shLMX1A في ثقافات WT-NSC إلى انخفاض كبير في إنتاج الخلايا العصبية DA ، والبقاء على قيد الحياة ، والتعبير عن العامل الخاص بالدماغ المتوسط ​​، وصحة الميتوكوندريا (الشكل S12 ، A إلى Q) ، دون تغيير في العدد الليزوزومي ، وتوطين GBA في الجسيمات الحالة ، وتدفق الالتهام الذاتي (الشكل S12 ، R إلى X). تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن عيوب جسمية في DNAJC6لا يتم التوسط في الخلايا العصبية الطافرة من خلال التنظيم السفلي لـ LMX1A. ومع ذلك ، لاحظنا أن تجميع α-syn ، المقدّر بعدد BiFC + / p129-α-syn + puncta ، قد زاد بشكل ملحوظ بمقدار LMX1A KD في الثقافات العصبية WT (الشكل S12AA) ، والذي من المحتمل أن يكون بسبب الضرر التأكسدي والميتوكوندريا الناجم عن LMX1A KD في الخلايا العصبية (الشكل S12 ، N إلى Q).

تم نقل NSCs المتحولة DNAJC6 (△ 3) مع الفيروسات البطيئة التي تعبر عن LMX1A أو DNAJC6 أو GFP (التحكم) ثم تمايزت إلى خلايا MDA العصبية. (أ و بتم تحديد التعبير عن العامل الخاص بالدماغ المتوسط ​​في الثقافات العصبية المتمايزة لـ MDA باستخدام تحليلات الكيمياء الخلوية المناعية (A) و qPCR (B). أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر. ن = 3 تجارب مستقلة. (ج) تم تقييم قابلية الخلية للبقاء من خلال عدد الخلايا المشقوقة caspase-3 و EthD1 + (الصفين الأول والثاني) والميتوكوندريا ROS المقدرة بواسطة MitoSox (الصف الثالث). أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر. ن = 3 تجارب مستقلة. (د) تأثيرات إنقاذ LMX1A و DNAJC6 على كمية وحجم الليزوزوم. الفحص المجهري متحد البؤر لـ LysoTracker Red DND99 في الخلايا العصبية المتباينة. أشرطة مقياس ، 10 ميكرومتر. يتم قياس متوسط ​​شدة مضان LysoTracker لكل خلية في الرسم البياني في الصف الأول. ن = 15 خلية من كل مجموعة. تصور الجسيمات الحالة بواسطة تلطيخ LAMP1 في الخلايا العصبية المتباينة. أشرطة مقياس ، 10 ميكرومتر. التحديد الكمي لعدد الليزوزوم لكل خلية (الرسم البياني الثاني) وحجم الليزوزوم لكل خلية (الرسم البياني الثالث) ، ن = 15 خلية من كل مجموعة. تمثل كل نقطة متوسط ​​قيمة حجم الليزوزوم لكل خلية. يشير السهم الأبيض إلى lysosome متضخم. (ه) صورة تمثيلية لتلوين LAMP1 / GBA في الخلايا العصبية المتباينة. أشرطة مقياس ، 50 ميكرومتر. القياس الكمي لـ LAMP1 + و GBA + نقطتا نقطية لكل خلية. ن = 15 خلية من كل مجموعة. (F) تأثيرات إنقاذ LMX1A و DNAJC6 على تجميع α-syn في الخلايا العصبية المتباينة. تم قياس تجميع α-syn من خلال عدد pSer129-αSyn + / ProteoStat + النقاط الزمنية لكل خلية. أشرطة مقياس ، 10 ميكرومتر. ن = 15 خلية من كل مجموعة. (جي) ملخص تخطيطي لمسارات الإشارات المسببة للأمراض PD الناجمة عن فقدان DNAJC6. يتم تقديم البيانات كوسائل ± SEM. أهمية في *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ، ANOVA أحادي الاتجاه مع تحليل Bonferroni اللاحق.

تسبب طفرة DNAJC6 ضعف تكوين الخلايا العصبية العامة

السؤال المتبقي هو ما إذا كان فقدان وظائف DNAJC6 خاصًا بنظام الخلايا العصبية MDA أو يسبب عجزًا معممًا في الخلايا العصبية. بالإضافة إلى انخفاض إنتاج الخلايا العصبية DA (الشكل S14 ، A إلى D) ، كان عدد الخلايا العصبية العامة TUJ1 + و MAP2 + أقل أيضًا في DNAJC6 hMLOs متحولة (الشكل S14 ، E إلى G) والثقافات المتمايزة VM-NSC (الشكل S14 ، H إلى J). علاوة على ذلك ، عندما تم تحفيز hESCs الطافرة على التمايز إلى عضويات تشبه الدماغ القشري ، ينتج عن الخلايا العصبية في العضيات القشرية التي تحمل DNAJC6 تم تقليل الطفرة أيضًا (الشكل S15 ، B إلى D) مع تعبير أقل للواسمات الخاصة بالعصبونات القشرية مقارنة مع العضيات القشرية WT (الشكل S15E). التعبير عن علامات السلائف العصبية الخاصة بالدماغ الأمامي (PAX6, TBR2، و HOPX) كان أكبر في العضيات القشرية الطافرة (الشكل S15E) ، مما يشير إلى خلل في تكوين الخلايا العصبية القشرية بسبب فقدان DNAJC6. يتوافق عيب الدماغ المتوسط ​​الإضافي الملحوظ مع التخلف العقلي والنوبات التي يتم اكتشافها بشكل متكرر في المرضى المصابين DNAJC6-PD (4). على الرغم من هذا النقص المعمم ، فإن ضعف نمو الخلايا العصبية قد يكون له تأثير أكثر عمقًا على نظام الخلايا العصبية DA في الدماغ المتوسط ​​، وأعراض بارزة في نهاية المطاف في المرضى الذين يحملون DNAJC6 الطفرات ، بسبب التطور الفريد للخلايا العصبية mDA ، حيث يستمر التعبير عن العوامل التنموية مثل LMX1A و EN1 و NURR1 ولها أدوار في الخلايا العصبية البالغة mDA التي تمنع انحلالها. هذا أيضًا بسبب ضعف الخلايا العصبية mDA بسبب ارتفاع ROS داخل الخلايا ، وتكرار إطلاق داخلي ، والطلب على الطاقة [تمت مراجعته في (55)].

باختصار ، باستخدام ملف DNAJC6-PD نموذج المرض البشري ، حددنا أن فقدان DNAJC6 أثناء تطور الخلايا العصبية mDA يسبب فقدان LMX1A التعبير من خلال إشارات WNT الضعيفة (الشكل 7G ، يسار). التعبير الضعيف عن LMX1A و NURR1 (هدف المصب لـ LMX1A) يواصل ويؤدي إلى عيوب الميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي في الخلايا العصبية المتمايزة MDA (الشكل 7G ، على اليمين). من ناحية أخرى ، يؤدي فقدان DNAJC6 مباشرة إلى حدوث عيوب في الجسم الذاتي في الخلايا العصبية MDA بطريقة مستقلة عن LMX1A. تؤدي الاختلالات الخلوية المعتمدة على LMX1A والمعتمدة على LMX1A معًا بشكل إضافي إلى إحداث مظاهر PD مثل تجميع α-syn المرضي وتنكس الخلايا العصبية MDA.


وراثة الميتوكوندريا

الحالات التي تسببها طفرة في الحمض النووي للميتوكوندريا لها أنماط غير عادية.

  • تتأثر كل من الذكور والإناث
  • الشرط ينتقل عن طريق الأنثى إلى نسلها
  • إذا كان للذكر السمة ولم يكن لدى زوجته & # 8217t ، فإن نسلهم & # 8217t لديهم هذه السمة

في النسب الأول ، سترى أنه عندما تمتلك الأنثى السمة ، فإن كل نسلها يمتلك هذه السمة ، ولكن في النسب الثاني ، ليس هذا هو الحال بالضرورة. التعبير عن ظروف الميتوكوندريا متغير. يوجد داخل كل خلية عدة ميتوكوندريا. يمكن أن يختلف عدد الميتوكوندريا التي تحمل الطفرة. يمكن تحمل نسبة معينة من الميتوكوندريا الطافرة داخل الخلية ولن يتم التعبير عن المرض في الكائن الحي. ومع ذلك ، قد تتسبب نسبة أكبر من الميتوكوندريا الطافرة في ظهور المرض في الكائن الحي.

يوضح النسب الأول كيف ينتقل الميراث من خلال الأنثى ، في سيتوبلازم خلية البويضة. يوضح النسب الثاني كيف يمكن أن يختلف التعبير اعتمادًا على نسبة الميتوكوندريا التي تحمل الطفرة.


يؤدي تراكم طفرات الحمض النووي في الميتوكوندريا إلى ظهور أنماط ظاهرية للشيخوخة المبكرة المكونة للدم تختلف عن شيخوخة الخلايا الجذعية الفسيولوجية

تتوسط الخلايا الجذعية الجسدية في الحفاظ على الأنسجة مدى حياة الكائن الحي. على الرغم من طول العمر الراسخ الذي يعد شرطًا أساسيًا لمثل هذه الوظيفة ، فإن البيانات المتراكمة تدل على اختلال وظيفة الخلايا الجذعية مع تقدم العمر. لذلك فإن تحديد الآليات الكامنة وراء الخلل الوظيفي في الخلايا الجذعية المرتبط بالعمر هو مفتاح فهم عملية الشيخوخة. هنا ، باستخدام نموذج يحمل بوليميراز DNA الميتوكوندريا المعيب في التدقيق اللغوي ، نظهر عيوب المكونة للدم التي تذكرنا بالشيخوخة المبكرة لـ HSC ، بما في ذلك فقر الدم ، اللمفاويات ، وانحراف النسب النخاعي. ومع ذلك ، على النقيض من شيخوخة الخلايا الجذعية الفسيولوجية ، كان لطفرات الحمض النووي المتراكم بسرعة تأثير وظيفي ضئيل على تجمع الخلايا الجذعية المكونة للدم ، وبدلاً من ذلك تسببت في كتل تمايز مميزة و / أو اختفاء أسلاف المصب. تظهر هذه النتائج أن وظيفة الميتوكوندريا السليمة مطلوبة من أجل التمايز المناسب للخلايا الجذعية متعددة السلالات ، ولكنها تجادل ضد طفرات الحمض النووي للميتوكوندريا في حد ذاتها كونها المحرك الأساسي لشيخوخة الخلايا الجذعية الجسدية.


الميراث

يمكن أن يُورث الاضطراب الوراثي للميتوكوندريا بعدة طرق اعتمادًا على نوع الحالة وموقع التغيير المسبب للمرض (الطفرة). تلك التي تسببها الطفرات في الحمض النووي للميتوكوندريا تنتقل عن طريق وراثة الأم. [1] [3] فقط خلايا البويضات (وليس خلايا الحيوانات المنوية) هي التي تساهم بالميتوكوندريا في الجيل التالي ، لذلك يمكن للإناث فقط نقل طفرات الميتوكوندريا إلى أطفالهن. يمكن أن تظهر الحالات الناتجة عن الطفرات في الحمض النووي للميتوكوندريا في كل جيل من الأسرة ويمكن أن تؤثر على كل من الذكور والإناث. في بعض الحالات ، تنتج الحالة عن طفرة جديدة (de novo) في جين الميتوكوندريا وتحدث في شخص ليس له تاريخ من الحالة في العائلة.

قد تتبع الاضطرابات الوراثية للميتوكوندريا الناتجة عن الطفرات في الحمض النووي النووي نمط وراثي سائد أو متنحي أو وراثي مرتبط بالكروموسوم X. [1] [3] في الحالات الصبغية السائدة ، تكفي نسخة واحدة محورة من الجين المسؤول في كل خلية لإحداث علامات أو أعراض للحالة. في بعض الحالات ، يرث الشخص المصاب الطفرة من الوالد المصاب. قد تنجم حالات أخرى عن طفرات جديدة في الجين. تحدث هذه الحالات في الأشخاص الذين ليس لديهم تاريخ من الاضطراب في عائلاتهم. يتمتع الشخص المصاب بحالة جسمية سائدة بفرصة 50٪ مع كل حمل لنقل الجين المتغير إلى طفله أو طفلها.

عندما يتم توريث حالة بطريقة وراثية متنحية ، يجب أن يكون لدى الشخص تغيير في كلتا نسختين من الجين المسؤول في كل خلية. عادة ما يحمل والدا الشخص المصاب نسخة واحدة متحولة من الجين ويشار إليها على أنها ناقلات. عادةً لا تظهر على ناقلات المرض علامات أو أعراض الحالة. عندما يكون لدى اثنين من حاملي حالة وراثية متنحية أطفال ، فإن كل طفل لديه خطر 25٪ (1 من 4) للإصابة بهذه الحالة ، و 50٪ (1 من 2) معرض لخطر أن يكون ناقلًا مثل كل من الوالدين ، و 25 ٪ فرصة لعدم وجود الشرط و لا يكون الناقل.

تعتبر الحالة مرتبطة بـ X إذا كان الجين المتحور الذي يسبب الحالة موجودًا على كروموسوم X ، أحد الكروموسومات الجنسية (كروموسوم Y هو كروموسوم الجنس الآخر). لدى النساء اثنان من الكروموسومات X والرجال لديهم كروموسوم X و Y. يمكن أن تكون الحالات المرتبطة بـ X هي المهيمنة المرتبطة بـ X أو المتنحية المرتبطة بـ X. الوراثة هي السائدة المرتبطة بـ X إذا كانت نسخة واحدة من الجين المتغير في كل خلية كافية للتسبب في الحالة. النساء المصابات بحالة سائدة مرتبطة بـ X لديهن فرصة بنسبة 50 ٪ لنقل الحالة إلى ابن أو ابنة مع كل حمل. الرجال المصابون بحالة سائدة مرتبطة بـ X سينقلون الحالة إلى جميع بناتهم ولا لأي من أبنائهم. يكون الميراث متنحيًا مرتبطًا بالكروموسوم X إذا تسبب الجين الموجود على الكروموسوم X في حدوث حالة لدى الرجال الذين لديهم طفرة جينية واحدة (لديهم كروموسوم X واحد فقط) وفي الإناث مع طفرتين جينيتين (لديهم اثنين من الكروموسومات X). ستنقل المرأة المصابة بحالة مرتبطة بـ X الطفرة إلى جميع أبنائها وبناتها. هذا يعني أن جميع أبنائها سيصابون بالمرض وستكون جميع بناتها حاملات. سينقل الرجل المصاب بحالة متنحية مرتبطة بالكروموسوم X الطفرة إلى جميع بناته (الناقلات) ولا أحد من أبنائه.


دعم المعلومات

S1 الشكل. تسلسل مزدوج - تشكيل إجماع دو نوفو بدون مرجع مع تصحيح خطأ الباركود.

باستخدام التسلسل المزدوج ، يتم إنشاء محولات مزدوجة الشريطة تحتوي على تسلسل عشوائي 12 نانومتر لتسلسل Illumina وربطها بالحمض النووي ذي الشريطة المزدوجة والمجزئ ذي الأهمية. ينتهي كل جزيء بمجموعة مختلفة من التسلسلات العشوائية على كلا الطرفين. يتم تضخيم الجزيئات المرتبطة بالمحول وتسلسلها ، مما ينتج عنه عدة قراءات متسلسلة لكل خيط DNA أولي. تتم محاذاة القراءات وفقًا لتسلسلها العشوائي ، ويتم تشكيل قراءات الإجماع ، أولاً للخيوط المفردة بشكل مستقل ، SSCS ، ويتبعها تكوين إجماع على خيطي DNA مزدوج الاتجاه ، DCS. تم وصف مبدأ التسلسل المزدوج بالتفصيل من قبل شميت وزملاؤه (الشكل 1 في [46]). يظهر هنا مبدأ تشكيل الإجماع الخالي من المرجع مع تصحيح أخطاء الباركود [51،52]. بدون محاذاة قراءة تسلسل النهاية المزدوجة مع تسلسل مرجعي ، تتم محاذاة القراءات مباشرةً وفقًا لتسلسل العلامات العشوائية ، مما يسمح بما يصل إلى ثلاثة حالات عدم تطابق. يتم تصحيح حالات عدم التطابق ، ويتم تكوين تسلسلات الإجماع على النحو الموصوف أعلاه ، مما يتطلب على الأقل ثلاث قراءات ثنائية النهاية لتشكيل SSCS وكلاهما SSCS لتشكيل DCS. DCS ، تسلسل إجماع مزدوج SSCS ، تسلسل إجماع أحادي الخيط.

S2 Fig. نظرة عامة على إعداد مكتبة العينة والمزدوجة ، والتسلسل ، وتشكيل الإجماع ، والاستدعاء المتغير.

تم استخلاص إجمالي الحمض النووي لأول مرة من الأنسجة الجسدية واستخدامه كمدخلات لإثراء الحمض النووي الأنزيمي mtDNA. تم تحلل البويضات الفردية أو تجمعات البويضات واستخدامها مباشرة في خطوة الإثراء. تم إعداد مكتبات التسلسل المزدوج وتسلسلها باستخدام قراءات نهاية مقترنة 250-nt. تم إجراء تكوين الإجماع على Galaxy [95] باستخدام خط أنابيب Du Novo [51،52] ، وتم تعيين الإجماع على التسلسل المرجعي لـ mtDNA للماوس (NC_005089.1) وتم تحليله بشكل أكبر للمتغيرات. mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

S3 الشكل. كفاءة إثراء mtDNA وعمق التسلسل.

(أ) تظهر كفاءة تخصيب mtDNA توزيعًا أضيق في الأنسجة الجسدية مقارنة بالبويضات. تشير العلامات النجمية إلى وسيط التوزيع. الكميات الكبيرة من الوسط الذي تم تخزين البويضات فيه تقلل من كفاءة التخصيب ، مما يؤدي إلى وجود بويضات مع عدم وجود إثراء أو إثراء ضعيف للغاية للعينات بكمية كبيرة من الوسط. (ب) متوسط ​​عمق تسلسل DCS ل mtDNA. تم استهداف الحد الأدنى لمتوسط ​​عمق تسلسل mtDNA البالغ 500 × لـ DCS في الأنسجة الجسدية (هذه القيمة في الواقع تعتمد بشدة على كفاءة إثراء mtDNA ومن الصعب تقديرها بدقة قبل تضخيم عائلة العلامة أثناء إعداد مكتبة الطباعة على الوجهين). بالنسبة للبويضات المفردة ، تم استخدام جميع الجزيئات التي تم الحصول عليها أثناء إعداد المكتبة كمدخلات لعائلة العلامة PCR. بالنسبة للعينات ذات الإثراء الضعيف ، تم استخدام ربع إلى نصف المكتبة فقط لأن غالبية الحمض النووي يمثل الحمض النووي النووي ، مما أدى إلى عينات ذات عمق تسلسل أقل لـ mtDNA. تشير العلامات النجمية إلى وسيط التوزيع. (ج) توزيع عمق تسلسل DCS عبر mtDNA لعينة نموذجية (تظهر عينات من الماوس G131 كمثال). تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. DCS ، تسلسل الإجماع المزدوج mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

شكل S4: الطفرات التي تم إدخالها أثناء التطور الجسدي أو السلالة الجرثومية.

الطفرات الجسدية المبكرة (لوحظت في كل من الأنسجة الجسدية). وصل واحد منهم فقط إلى MAF & gt1٪ (في دماغ الجرو G132p1). تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. MAF ، تردد أليل ثانوي.

شكل S5. ترددات الطفرات في أنسجة السلالة الجرثومية والجسدية.

(أ) تقاس ترددات استبدال النيوكليوتيدات في البويضات الفردية للأمهات والجراء في نسب الماوس G126 و G129. تشير النقاط الرمادية إلى متوسط ​​عمق تسلسل DCS & lt100 ×. بسبب عمق التسلسل المنخفض ، قد تكون ترددات الطفرات منحازة نحو قيم منخفضة أو عالية للغاية (اعتمادًا على غياب أو وجود طفرة). (ب) ترددات الطفرات المقاسة في المخ والعضلات والبويضات المفردة وبرك البويضات للأمهات والجراء ، والتي تظهر على مستوى الفرد. تم تضمين العينات المتسلسلة فقط على عمق 100 × على الأقل (جميع الأنسجة الجسدية 51 من 92 بويضات مفردة 21 من 24 مجموعة بويضات) لضمان مقاييس تردد الطفرات الدقيقة. لحساب تردد الطفرة في البويضات المفردة ، تم الجمع بين عدد الطفرات والنيوكليوتيدات المتسلسلة عبر جميع البويضات المقاسة لنفس الفأر. اختبار التقليب ص- يشار إلى القيم (اختبار أحادي الجانب يعتمد على المتوسطات 100،000،000 من التباديل المصححة للاختبار المتعدد). (ج) ترددات الطفرات في إجمالي mtDNA المقاسة في المخ والعضلات والبويضات (البويضات المفردة وتجمعات البويضات مجتمعة) للأمهات والجراء المجمعة لجميع الأفراد من فئة عمرية. تم اختبار الفرق بين الجراء والأمهات في كل فئة باستخدام اختبار فيشر الدقيق *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص & lt 0.001. تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. DCS ، تسلسل الإجماع المزدوج mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

الشكل S6 ترددات الطفرات في مناطق mtDNA المختلفة.

يتم عرض ترددات الطفرات للأمهات (أ) و (ب) الجراء للمناطق المختلفة على طول mtDNA. تم تجميع ترددات الطفرات في مناطق ترميز الحمض الريبي النووي النقال (الأخضر). تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

S7 التين. الطفرات في جينات ترميز البروتين.

(أ) ترددات الطفرات داخل جينات ترميز البروتين المختلفة في الدماغ والعضلات والبويضات للأمهات والجراء. (ب) توزيع الطفرات غير المرادفة (الأحمر) ، وكودونات البدء المفقودة (الخضراء) ، واكتساب رموز التوقف (الرمادي) ، وكودونات التوقف المفقودة (الصفراء) ، والطفرات المترادفة (الزرقاء) داخل الجينات المختلفة. يمثل مستوى الشفافية العدد الإجمالي للطفرات الموجودة في الجين ، والتي تتراوح من 1 إلى 47. تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq.

شكل S8 ترددات الطفرات في مواقع CpG.

تم اختبار أهمية الفروق بين ترددات الطفرات في الأمهات والجراء باستخدام اختبار فيشر الدقيق * ص & lt 0.05 ** ص & lt 0.01 ، *** ص& lt0.001 مصحح للاختبارات المتعددة. تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq.

S9 التين. سياق الطفرات ثلاثي النوكليوتيدات.

يظهر سياق ثلاثي النوكليوتيدات للطفرات في الدماغ والعضلات والبويضات في الأمهات والجراء ، على التوالي. يُدرج سياق النوكليوتيدات (على سبيل المثال ، ACA) في قائمة واحدة فقط ، ولكنه يمثل السياق على كلا الخيطين (على سبيل المثال ، ACA لطفرات C & gtA على خيط واحد ، و TGT لطفرات G & gtT على الخيط الثاني). لم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية في سياق الطفرات ثلاثي النوكليوتيدات بين الأمهات والجراء في الدماغ والعضلات والبويضات (ص = 1, ص = 1 و ص = 1 ، على التوالي ، اختبار استقلالية بيرسون مع محاكاة مونت كارلو). تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq.

شكل S10: تتراكم أنواع مختلفة من الطفرات مع تقدم العمر داخل وخارج الحلقة D.

(أ) تواتر أنواع الطفرات المختلفة في الحلقة D في الجراء والأمهات. (ب) تكرارات أنواع الطفرات المختلفة خارج الحلقة D في الجراء والأمهات. تم اختبار أهمية الفروق بين الأمهات والجراء باستخدام اختبار فيشر الدقيق *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص & lt 0.001 مصححة للاختبارات المتعددة. تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq.

S11 الشكل. تتراكم بدائل النوكليوتيدات بشكل غير متماثل على خيوط DNA.

نلاحظ توزيعًا غير متماثل لأنواع الطفرات المختلفة بين L-strand (تحتوي على عدد أكبر من السيتوزينات أكثر من الجوانين) و H-strand من mtDNA ، كما هو موضح سابقًا للدماغ البشري [28]. يتم عرض نوع الاستبدال بالنسبة إلى التسلسل المرجعي (الذي يمثل L-strand) لـ mtDNA. تم اختبار أهمية الاختلافات بين الطفرات على خيوط مختلفة باستخدام اختبار فيشر الدقيق *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص & lt 0.001 مصححة للاختبارات المتعددة. تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. H- ستراند ، حبلا ثقيلة L- ستراند ، خصلة خفيفة mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

شكل S12: التراكم غير المتماثل لأنواع الطفرات مع تقدم العمر بين الخيوط الخفيفة والثقيلة من الحمض النووي الريبي.

(أ) ترددات الطفرات لأنواع الطفرات المختلفة في الحلقة D في الدماغ والعضلات والبويضات. (ب) ترددات الطفرات لأنواع الطفرات المختلفة خارج الحلقة D في الدماغ والعضلات والبويضات. تم اختبار أهمية الاختلافات بين الخيوط المختلفة باستخدام اختبار فيشر الدقيق *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص & lt 0.001 مصححة للاختبارات المتعددة. تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

S13 الشكل. حدوث وانتقال غير المتجانسات الموروثة في السلالتين (G129 و G126).

تشير الأرقام الحمراء المكتوبة بخط مائل إلى معرفات الأمهات.تشير الدوائر إلى الإناث ، وتشير المربعات إلى الذكور ، ويشير الماس إلى البويضات (تم اعتبار جميع البويضات الفردية وتجمعات البويضات معًا). تظهر الحشوات اللونية المختلفة وجود مواقع مختلفة غير متجانسة داخل الأفراد (أو جميع البويضات). يظهر موضع الموقع غير المتجانسة باللون المقابل عند ملاحظته لأول مرة ضمن النسب. يتم تمييز المواقف باللون الأصفر عند ملاحظتها لأول مرة عند الأمهات وباللون الرمادي عند ملاحظتها لأول مرة في الجراء. المعرف ، المعرف.

S14 الشكل. MAFs لوحظ لمجموعات متغايرة الموروثة مفصولة بحدوثها في النسب.

يتم عرض MAFs للمواقع غير المتجانسة المفصولة بالأنسجة (المخ ، والعضلات ، والبويضة المفردة ، وتجمع البويضات) بناءً على حدوثها في النسب. الأزرق: تغاير اللزمات المشتركة بين العديد من الأمهات وجرائهن من النسب (وبالتالي من المحتمل أن تكون موجودة أيضًا في الجدة) أخضر: heteroplasmies تتقاسمها الأم وبعض صغارها (وبالتالي من المحتمل أن تكون نشأت في الأم أو الجدة) ، مع إظهار أخضر داكن لوحظت حالات غير متجانسة في الأمهات (حيث تمت ملاحظتها أولاً) والأخضر الفاتح تظهر حالات غير متجانسة لوحظت في الجراء (التي ورثت فيها). من المحتمل أن تكون قد نشأت في السلالة الجرثومية للأمهات ورثتها الجراء). تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. MAF ، تردد أليل ثانوي.

S15 الشكل. ترددات البلازما غير المتجانسة عبر البويضات والجراء الفردية.

تآمر MAFs Heteroplasmy من البويضات المفردة ضد متوسط ​​MAF في الدماغ والعضلات من الماوس المقابل. تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. MAF ، تردد أليل ثانوي.

شكل S16 العلاقة بين التباين الطبيعي والعمر.

(أ) التباين المعياري (الفرق مقسومًا على ص(1 − ص)، أين ص هو متوسط ​​تواتر الأليل بين الأنسجة الجسدية أو بين البويضات المفردة) من MAFs متغايرة في الدماغ والعضلات في الجراء والأمهات. (ب) تباين طبيعي من MAFs متغاير في البويضات المفردة من الماوس في الجراء والأمهات. اختبار التقليب أحادي الجانب (المتوسطات 10000 تبديل): ص = 0.478 بوصة (أ) و ص = 0.047 بوصة (ب). تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. MAF ، تردد أليل ثانوي.

S17 التين. سياق ثلاثي النوكليوتيدات للطفرات في عينات Covaris والعينات المنفصمة إنزيميًا.

نظرًا لقلة عدد الطفرات التي تم اكتشافها لكل سياق ثلاثي النوكليوتيد في نوع العينة والفئة العمرية ، فليس لدينا الكثير من القوة لاكتشاف الاختلافات بين طرق التجزئة المستخدمة. لاختبار الفروق إحصائيًا ، أجرينا اختبار Pearson's chi-squared test للاستقلال باستخدام محاكاة مونت كارلو (يمكننا فقط حساب ص- القيم باستخدام عمليات المحاكاة لأن افتراضات تقريب مربع كاي لم تتحقق). لم نلاحظ أي اختلافات ذات دلالة إحصائية في سياق الطفرات ثلاثي النوكليوتيدات بين عينات Covaris والعينات المنفصمة إنزيميًا (ص = 0.409 و ص = 0.194 للأمهات والجراء ، على التوالي). تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq.

S18 الشكل. تشكيل إجماع Du Novo في المجرة [95].

S19 الشكل. الارتباط بين MAFs مغاير التباين المقاس في DCSs و SSCS.

يُظهر المحاور x و y MAFs للبدائل غير المتجانسة الموروثة المقاسة من DCSs و SSCS ، على التوالي. (أ) عند النظر فقط في heteroplasmies التي تم قياس الأليل الصغير من أجلها في خمسة DCS على الأقل ، فإن الترددات المقاسة ترتبط بشكل جيد جدًا في الأمهات وكذلك الجراء. (ب) Heteroplasmies التي تم قياس الأليل الصغير من أجلها في أقل من خمسة DCSs تظهر ارتباطًا أقل بين DCS و SSCS ، ومن المحتمل أن يكون ناتجًا عن فاصل الثقة الكبير لـ DCS MAFs بسبب العدد الصغير للجزيئات التي تم تحليلها. نظرًا لأن عدد الجزيئات المقاسة في التسلسل المزدوج أعلى بثلاث مرات على الأقل بالنسبة لـ SSCS ، فمن المحتمل أن يكون MAFs المتغاير من SSCS أكثر دقة. لذلك ، بالنسبة لهذه المواقع ، تم استخدام MAFs المقاسة من SSCSs في التحليلات اللاحقة (كما هو موضح في جدول S3). تتوفر البيانات الأولية للمعلومات الموضحة في هذا الشكل على https://github.com/makovalab-psu/mouse-duplexSeq. DCS ، تسلسل الإجماع المزدوج MAF ، تردد أليل ثانوي SSCS ، تسلسل إجماع أحادي الخيط.

جدول S1. عمر الفئران الفردية في النسبتين (G129 و G126) في وقت جمع الأنسجة.

يشير A أو B بعد اسم العينة إلى صغار من ولدين مختلفين.

الجدول S2. ملخص تسلسل مزدوج.

ملخص للعينات المتسلسلة لأنواع العينات المختلفة ، بما في ذلك عمق التسلسل ، وكفاءة تخصيب mtDNA. mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

جدول S3. المتغيرات الخاصة بالأنسجة الموجودة في & gt1 DCS (أكثر من جزيء mtDNA واحد في عينة يشار إليها كـ & gt1 DCS في العمود المسمى "الملاحظات") ، طفرات جسدية مبكرة (توجد في كل من الأنسجة الجسدية ولكنها لا تنتقل إلى الجيل التالي أو البويضات) ، وجميع أنواع غير المتجانسة الموروثة.

DCS ، تسلسل الإجماع المزدوج mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

جدول S4. تم تحليل ترددات الطفرة لمناطق وظيفية مختلفة من mtDNA في الأمهات والجراء.

يتم سرد المنطقة D-loop والمنطقة غير المشفرة بشكل منفصل للسماح بمقارنة أفضل بالنتائج المبلغ عنها في منطقة D-loop فقط. تبلغ مساحة حلقة D في الماوس mtDNA 877 نقطة أساس مقارنة بـ 934 نقطة أساس مع الأخذ في الاعتبار جميع المناطق غير المشفرة. ص- تم تصحيح القيم للاختبارات المتعددة (بشكل منفصل لمقارنات الأم مقابل الجراء ومقارنات D-loop مقابل غير D- حلقة) باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg للتحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ. mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

جدول S5. مقارنة ترددات الطفرات بين مناطق mtDNA المختلفة.

تم إجراء مقارنات زوجية مع FET و ص- تم تصحيح القيم للاختبارات المتعددة باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg للتحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ. FET ، اختبار فيشر الدقيق mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

الجدول S6. تمت ملاحظته مقابل الأعداد المتوقعة لطفرات دي نوفو والبدلات غير المتجانسة الموروثة.

(أ) الطفرات الجسدية والجرثومية لدى الأمهات. (ب) الطفرات الجسدية والجرثومية في الجراء. (ج) غير المتجانسة الموروثة. ص- تم حساب القيم باختبار ثنائي الحدين. تم استخدام التسلسل الفعلي للنسبتين (بما في ذلك إدخال واحد مقارنة بالتسلسل المرجعي). يتم عرض الأعداد المرصودة للمتغيرات والأرقام المتوقعة في ظل التوقعات العشوائية والحيادية (بناءً على التردد في مواقع محددة). (D ، E) اختبار أحادي الحدين لاختبار ما إذا كانت ترددات الطفرات التي لوحظت في الحلقة D أكبر بكثير مما هو متوقع بالصدفة.

الجدول S7. تواتر أنواع الطفرات المختلفة في الأنسجة والبويضات الجسدية.

ص- تم تصحيح القيم للاختبارات المتعددة (بشكل منفصل لمقارنات الأم مقابل الجراء لأنواع الطفرات المختلفة ، مقارنات الأم مقابل الجراء لمقارنات Ti و Tv ، و CpG مقابل مقارنات nonCpG) باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg للتحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ. "(النوع) المتسلسل nt" هو عدد النيوكليوتيدات المتسلسلة التي يمكن أن تؤدي بشكل فعال إلى نوع الطفرة المرصودة. Ti ، تلفزيون الانتقال ، التحويل.

جدول S8. تم تحليل ترددات أنواع الطفرات المختلفة في الأنسجة الجسدية والبويضات للأمهات والجراء بشكل منفصل للحلقة D وخارج الحلقة D.

ص- تم تصحيح القيم (اختبار فيشر الدقيق) للاختبار المتعدد باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg للتحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ. "(النوع) المتسلسل nt" هو عدد النيوكليوتيدات المتسلسلة التي يمكن أن تؤدي بشكل فعال إلى نوع الطفرة المرصودة.

الجدول S9. تحليل تراكم الطفرات المنحازة للخيوط.

ص- تم حساب قيم الاختلافات في ترددات الطفرات لنوعي الطفرات التكميلية (انحياز الخيط) باستخدام FET وتم تصحيحها للاختبار المتعدد باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg للتحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ. "nt sequenced (type") هو عدد النيوكليوتيدات المتسلسلة التي يمكن أن تؤدي بشكل فعال إلى نوع الطفرة المرصودة. FET ، اختبار فيشر الدقيق.

جدول S10. مقارنة بين تراكم الطفرات المنحازة للخيوط في الحلقة D مقابل خارج الحلقة D (غير حلقة D).

ص- تم حساب قيم الاختلافات في ترددات الطفرات لنوعي الطفرات التكميلية ، وكذلك بين الحلقة D وخارج الحلقة D (بدون حلقة D) باستخدام FET وتم تصحيحها للاختبار المتعدد باستخدام طريقة Benjamini- Hochberg للتحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ (منفصل للمقارنات بين حبلا و D-loop / non-D-loop). "(النوع) المتسلسل nt" هو عدد النيوكليوتيدات المتسلسلة التي يمكن أن تؤدي بشكل فعال إلى نوع الطفرة المرصودة. FET ، اختبار فيشر الدقيق.

جدول S11. نموذج الانحدار اللوجستي ذو التأثيرات المختلطة بدون تفاعلات.

التأثيرات الثابتة: الفئة العمرية (الأم ، الجرو) ، الأنسجة (الدماغ ، العضلات ، تجمع البويضات ، البويضات المفردة [مجتمعة عبر جميع البويضات المقاسة للفأر]) ، حجرة mtDNA (حلقة D ، غير حلقة D) ، نوع الطفرة (التحويل ، انتقالات A & gtG و T & gtC ، انتقالات C & gtT و G & gtA). خط الأساس للتأثيرات الثابتة: الفئة العمرية ، الأنسجة الأم ، حجرة mtDNA في الدماغ ، نوع طفرات D-loop ، الانقلاب. التأثيرات العشوائية: معرف الماوس (ترتبط الملاحظات المتعددة بنفس الفرد ، 36 فردًا في المجموع). الاستجابة: تكرار الطفرات ، مع إعطاء أوزان بعدد النيوكليوتيدات المقابلة لكل ملاحظة. الهامش psuedo-R 2 (يمثل التباين الموضح بالتأثيرات الثابتة): 22.82٪. Pseudo-R 2 الشرطي (يمثل التباين الموضح بكل من التأثيرات الثابتة والعشوائية): 23.53٪. نسبة الأرجحية: احتمالات وجود طفرة للفئة المقابلة مقسومة على احتمالات وجود طفرة لفئة خط الأساس (يتم تعريف الاحتمالات على أنها احتمالية تحور النيوكليوتيد ، مقسومًا على احتمال عدم تحورها). المعرف ، المعرف mtDNA ، الحمض النووي للميتوكوندريا.

الجدول S12. نموذج الانحدار اللوجستي ذو التأثيرات المختلطة مع التفاعلات.

التأثيرات الثابتة: الفئة العمرية (الأم ، الجرو) ، الأنسجة (الدماغ ، العضلات ، تجمع البويضات ، البويضات المفردة [مجتمعة عبر جميع البويضات المقاسة للفأر]) ، حجرة mtDNA (حلقة D ، غير حلقة D) ، نوع الطفرة (التحويل ، انتقالات A & gtG و T & gtC ، انتقالات C & gtT و G & gtA) ، والتفاعلات بين نوع الطفرة (التحويل ، A & gtG و T & gtC ، انتقالات C & gtT و G & gtA) وكل من المتغيرات الأخرى. خط الأساس للتأثيرات الثابتة: الفئة العمرية ، الأنسجة الأم ، حجرة mtDNA في الدماغ ، نوع طفرات D-loop ، الانقلاب. التأثيرات العشوائية: معرف الماوس (ترتبط الملاحظات المتعددة بنفس الفرد ، 36 فردًا في المجموع). الاستجابة: تكرار الطفرات ، مع إعطاء أوزان بعدد النيوكليوتيدات المقابلة لكل ملاحظة. الهامش pseudo-R 2 (يمثل التباين الموضح بالتأثيرات الثابتة): 23.31٪. Pseudo-R 2 الشرطي (يمثل التباين الموضح بكل من التأثيرات الثابتة والعشوائية): 24.02٪. التفاعلات مهمة (اختبار مربع كاي للمقارنة بين النموذج الكامل والنموذج المصغر): ص-القيمة = 1.3e − 30. المعرف ، المعرف mtDNA ، الحمض النووي للميتوكوندريا.

الجدول S13. المواقع غير المتجانسة (heteroplasmies الموروثة) في سلالتي الفأر.

جدول S14. تتواجد الهيتروبلازم إما في جيلين من النسب أو في كل من الأنسجة الجسدية والجراثيم للفرد (أي التغاير الموروثة).

جدول S15.

حساب الارتباطات الخاصة بالبدائل غير المتجانسة الموروثة بين (A) يعني MAF من heteroplasmies في الدماغ مقارنة بمتوسط ​​MAF في العضلات للجراء (B) يعني MAF من heteroplasmies في الدماغ مقارنة بمتوسط ​​MAF في العضلات للأمهات (C) يعني MAF من heteroplasmies في جميع البويضات المفردة التي تم تحليلها من أجل جرو مقارنة بمتوسط ​​MAF لكل من الأنسجة الجسدية للجرو المقابل و (D) يعني MAF للبويضات غير المتجانسة في جميع البويضات المفردة التي تم تحليلها للأم مقارنة بمتوسط ​​MAF لكل من الأنسجة الجسدية للأم المقابلة بعد الاختزال إلى أحجام عينات متساوية. تم إجراء الاختزال العشوائي 10x لكل حساب ارتباط ، وتم حساب متوسط ​​جميع القيم التي تم الحصول عليها. (C ، D) تم إجراء التحليل إما بعد استبعاد العينات التي تم قياس واحدة أو اثنتين منها فقط بعمق تسلسلي كافٍ (الجدول في الأعلى) أو عند تضمين جميع العينات المستقلة عن عدد البويضات المفردة (الجدول السفلي). MAF ، تردد أليل ثانوي.

جدول S16. تقدير عنق الزجاجة للخط الجرثومي.

S17 الجدول. نظرة عامة على جميع المكتبات المتسلسلة.

مكتبات تسلسل مزدوج للدماغ والعضلات من 36 فأرًا ، وكبد سبعة فئران ، وقلب فأر واحد ، بالإضافة إلى 92 بويضة مفردة و 24 مجموعة بويضة. تم إجراء ما مجموعه خمسة عمليات تشغيل HiSeq 2500 ، المسمى mm_DS01-mm_DS05. لزيادة عمق تسلسل mtDNA ، تم إعداد مكتبة ثانية من حين لآخر لنفس العينة وتسلسلها في تشغيل آخر. بالنسبة لمعظم البويضات المفردة ، تم استخدام التجزئة الإنزيمية ، والتي تعد جزءًا من مجموعة إعداد مكتبة DNA NEB Ultra II FS ، لتفتيت الحمض النووي (المشار إليها بـ FS في "تجزئة" العمود) للأنسجة الجسدية ، وبعض البويضات المفردة ، وبرك البويضات ، والقص على آلة Covaris M220 (المشار إليها بالسيرة الذاتية في العمود "تجزئة"). يتم عرض عدد الطفرات المفترضة الخاصة بالأنسجة بعد التصفية (كما هو موضح في S1 Note). mtDNA ، DNA الميتوكوندريا.

جدول S18. القائمة الكاملة لطفرات de novo التي تم قياسها في سلالتي الماوس.

يحتوي الجدول على جميع طفرات de novo المفترضة ، بغض النظر عن عدد العينات التي تم العثور على طفرة فيها (المشار إليها في العمود الأخير). تم تضمين الطفرات التي حدثت في أقل من أربع عينات فقط في التحليل النهائي (انظر ملاحظة S2). يتم سرد الطفرات الجسدية المبكرة (الموجودة في كل من الأنسجة الجسدية ، ولكنها غائبة في السلالة الجرثومية) بشكل منفصل في جدول S3.

S19 الجدول. استدعاء متغير وخطوات تصفية طفرة de novo.

جدول S20. مخاليط اصطناعية بترددات متغايرة متغايرة.

تم خلط عينتين من قرود المكاك الريسوسية مختلفة في 14 موقعًا ثابتًا ، وموقعين غير متجانسين (واحد في كل قرود مكاك مبين باللون الأخضر) بنسب مختلفة (10٪ ، اثنان مكررات 1٪ ، مكررتان و 0.2٪ ، ستة مكررات). تم حساب المتوسط ​​و STDEV عبر جميع المواقع بدون المواقع غير المتجانسة. لا يمكن اكتشاف تسعة عشر من أصل 168 موقعًا غير متجانسة بتردد مختلط يبلغ حوالي 0.2٪ في DCSs (MAFs) الموضحة باللون الأحمر) ، ولكن جميعها كانت موجودة في SSCSs. DCS ، تسلسل الإجماع المزدوج MAF ، تردد أليل ثانوي SSCS ، تسلسل إجماع أحادي الخيط STDEV ، الانحراف المعياري.

ملاحظة S1. ترشيح الطفرات الخاصة بالأنسجة بناءً على حدوثها في السلالتين.

ملاحظة S2. تحليل الاختيار: إحصائيات hN / hS.

ملاحظة S3. تحليل الاختيار: عشرات phastCons.

ملاحظة S4. الطفرات في مناطق حلقة D التنظيمية.


طفرات الميتوكوندريا الكامنة وراء السرطان

قد تلعب الطفرات التي تؤثر على الحمض النووي للميتوكوندريا دورًا رئيسيًا في الإصابة بالسرطان. ومع ذلك ، فإن الطفرات الدقيقة المرتبطة بالسرطان لا تزال مجهولة. فحصت الدكتورة فاطيماتا مباي ومعاونوها من جامعة داكار في السنغال تسلسل منطقتين من جينوم الميتوكوندريا لتحديد الطفرات التي قد تكون بمثابة مؤشرات حيوية للتشخيص المبكر للأمراض.

اقرأ المزيد عن هذا العمل في Research Outreach ، أو ابحث عن الورقة الأصلية على: doi.org/10.31557/APJCP.2019.20.7.2203

أهلا ومرحبا بكم في Research Pod! شكرا لك على الاستماع والانضمام إلينا اليوم.

في هذه الحلقة سنلقي نظرة على بحث الدكتورة فاطيماتا مباي والمتعاونين من جامعة داكار ، السنغال. يبحث الباحثون في دور الطفرات الجينية في جينوم الميتوكوندريا في السرطان.

تلعب الطفرات التي تؤثر على الحمض النووي للميتوكوندريا دورًا رئيسيًا في الإصابة بالسرطان. ومع ذلك ، فإن الطفرات الدقيقة المرتبطة بالسرطان لا تزال مجهولة.

فحصت الدكتورة فاطيماتا مباي ومتعاونون من جامعة داكار بالسنغال تسلسل منطقتين من جينوم الميتوكوندريا لتحديد ومقارنة الطفرات التي تحدث في السرطانات المختلفة.

يمكن أن يؤدي فهم العلاقة بين طفرات الميتوكوندريا ودورها في السرطان في النهاية إلى استخدام الحمض النووي للميتوكوندريا كمؤشر حيوي للأورام لتشخيص السرطان في مراحل مبكرة.

على الرغم من أن السرطان هو أحد الأسباب الرئيسية للوفيات في جميع أنحاء العالم ، إلا أن اكتشاف السرطانات مبكرًا بما يكفي لمعالجتها لا يزال يمثل تحديًا اليوم.

السرطان معقد. يمكن إشراك آليات مختلفة وبعضها لم يتم فهمه بعد

تتميز معظم السرطانات بعدم الاستقرار الجيني. الطفرات الجسدية (أي التغيرات في الحمض النووي التي تحدث بعد الحمل) تتراكم وتحول الخلايا ، على سبيل المثال منحها خصائص تكاثرية واجتياحية غير طبيعية. في حين أن معظم الجينوم موجود في النواة ، فإن جزءًا من الجينوم موجود في الميتوكوندريا ، وهناك أدلة متزايدة على أن الطفرات الجسدية في الميتوكوندريا يمكن أن تكون مرتبطة بالسرطان.

الميتوكوندريا هي عضيات تُعرف باسم قوى الخلية. تولد معظم الطاقة الكيميائية اللازمة لتشغيل جميع التفاعلات الكيميائية الحيوية الخلوية. يتم تخزين هذه الطاقة الكيميائية في جزيئات صغيرة تسمى أدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP).

عندما يدخل مصدر للطاقة مثل الكربوهيدرات (السكريات والألياف) أو الدهون أو البروتينات إلى الخلية ، يتم إحضارها إلى الميتوكوندريا وتحويلها من خلال سلسلة من التفاعلات تسمى دورة كريبس (أو دورة حمض الستريك).

ثم تُستخدم منتجات دورة كريبس في مسار استقلابي ثانٍ يسمى الفسفرة المؤكسدة. من خلال الفسفرة المؤكسدة ، يتم إنشاء ATP ، عملة الطاقة العالمية في الخلايا.

أنواع الأكسجين التفاعلية (أو ROS) هي منتجات جانبية من الفسفرة المؤكسدة. يلعب ROS أدوارًا متنوعة تعود بالنفع على الجسم. فهي ضرورية في الجهاز القلبي الوعائي والجهاز المناعي ، على سبيل المثال.

ومع ذلك ، يمكن أن تكون أنواع الأكسجين التفاعلية أيضًا سامة: فهي تمتلك إلكترونًا غير مزدوج مما يجعلها شديدة التفاعل وبالتالي قادرة على إتلاف البروتينات والدهون والأحماض النووية (مثل الحمض النووي) الموجودة في الخلية. لذلك يحتاج الجسم إلى توازن في مستويات ROS لأن الزيادة الزائدة ستؤدي إلى الإجهاد التأكسدي بينما يؤدي المستوى المنخفض جدًا إلى إجهاد مختزل يمكن أن يسبب أمراضًا تتراوح من اعتلال عضلة القلب إلى السرطان.

إلى جانب دورها المميز كقوة للخلية ، فإن الميتوكوندريا لها خصوصية أخرى: فهي المكان الوحيد خارج النواة حيث يمكن العثور على الحمض النووي. في حين أن الجينوم النووي خطي ، فإن الحمض النووي للميتوكوندريا هو كروموسوم دائري صغير. تحتوي كل خلية على العديد من الميتوكوندريا وتحتوي كل ميتوكوندريا على عشرات النسخ من جينوم الميتوكوندريا الخاص بها.

هذا يعني أن الخلية يمكن أن تحتوي على آلاف النسخ من جينوم الميتوكوندريا الخاص بها ، بينما تحتوي على نسختين من جينومها النووي.

جينوم الميتوكوندريا صغير ، مكون من 16.569 نيوكليوتيد يشفر 13 بروتينًا ، بينما يتكون الجينوم النووي من 3.3 مليار نيوكليوتيد. تشارك جميع البروتينات الـ 13 المشفرة بواسطة جينوم الميتوكوندريا في مسار الفسفرة المؤكسدة - مما يمكّن الميتوكوندريا من توليد الطاقة.

تحدث الطفرات بشكل طبيعي في كل خلية.ومع ذلك ، فإن معدل طفرة الحمض النووي في الميتوكوندريا أعلى بعدة مرات من معدل الحمض النووي. التفسير الأول هو أنه ، في النواة ، هناك نظام يسمى

يتعرف إصلاح عدم التطابق على الأخطاء ويصلحها في تسلسل الحمض النووي ، وبالتالي يمكن إرجاع طفرات تسلسل الحمض النووي.

في الميتوكوندريا ، يكون نظام التعويض هذا أقل كفاءة. التفسير الثاني هو أن أنواع الأكسجين التفاعلية ، التي يتم إنتاجها أثناء الفسفرة المؤكسدة التي تحدث في الميتوكوندريا ، يمكن أن تتلف الحمض النووي وتفضل الطفرات.

قد تعدل طفرات الميتوكوندريا وظيفة سلسلة الفسفرة المؤكسدة الطبيعية وتؤدي إلى إنتاج غير لائق لأنواع الأكسجين التفاعلي السامة للجينات. سيؤدي هذا في النهاية إلى تعطيل الخلية.

يقبل العلماء على نطاق واسع فكرة أن الميتوكوندريا تلعب دورًا مهمًا في عمليات الشيخوخة لكل من الخلايا والأفراد. تم الإبلاغ عن زيادة تراكم طفرات الحمض النووي للميتوكوندريا في أنسجة الشيخوخة مثل الدماغ والعضلات الهيكلية والأرومات الليفية وفي العديد من الحالات المرضية بما في ذلك الاضطرابات العصبية والتمثيل الغذائي والاضطرابات المرتبطة بالعمر.

كما لوحظت طفرات الميتوكوندريا بشكل متكرر في السرطانات البشرية وتم اقتراحها كواسمات حيوية للأورام. ومع ذلك ، فإن الطفرات الميتوكوندريا التي هي بالضبط

المسؤول عن التسبب في السرطان لا يزال غير واضح. لتسليط الضوء على هذا ، تقوم الدكتورة مباي وفريقها بفحص طفرات الميتوكوندريا في السرطان والتركيز على منطقتين محددتين: منطقة D-Loop وجين Cytochrome b.

تركز الدكتورة مباي ومعاونوها على منطقة D-Loop من الحمض النووي للميتوكوندريا لأن هذه المنطقة ضرورية لتكرار جينوم الميتوكوندريا والتعبير عنه. يحتوي على محفزات نسخية ضرورية للتعبير الجيني. كما أنه يحتوي على أصل الخيط الرئيسي للتكرار ، وهو خيط ثالث من الحمض النووي يبدأ في تكرار الجينوم.

يمنح هذا الخيط الثالث هذه المنطقة بنية DNA مميزة ثلاثية الشرائط تجعلها أكثر عرضة للطفرات الجسدية.

كما أن أبحاث الدكتور مباي ومساعديه شحذت أيضًا جين السيتوكروم ب ، الذي يوفر تعليمات لصنع بروتين يسمى السيتوكروم ب.

السيتوكروم ب هو واحد من 11 مكونًا لمجموعة من البروتينات تسمى المركب III ، والتي تشارك في مسار الفسفرة المؤكسدة. يعتبر جين السيتوكروم ب مثيرًا للاهتمام أيضًا لأنه متغير للغاية بين الأنواع وبين الأفراد.

يعتبر سرطان الفم سادس أكثر أنواع السرطان شيوعًا في العالم. يتم اكتشاف معظم سرطانات الفم في مرحلة متقدمة ، وهي ليست مثالية لرعاية المرضى وعلاجهم. يمكن أن يساعد العثور على المؤشرات الحيوية للأورام في تشخيص سرطانات الفم في مرحلة مبكرة.

مع أخذ ذلك في الاعتبار ، قام الدكتور مباي بفحص تسلسل الجين Cytochrome b وتسلسل D-Loop لجينوم الميتوكوندريا في 45 سرطانًا في تجويف الفم: تم تحليل مناطق الجين D-Loop و Cytochrome b من الحمض النووي للميتوكوندريا المشتقة من أنسجة السيطرة والأورام ، وتم تحليل أي منها اعتبرت الاختلافات في تسلسل الحمض النووي طفرات جسدية.

من بين أنسجة ورم تجويف الفم ، ما يقرب من 90 ٪ تحمل طفرات الميتوكوندريا.

كانت الطفرات أكثر تواترًا في منطقة D-Loop مقارنة بجين السيتوكروم ب: ما يقرب من 80٪ من الطفرات التي لوحظت كانت في منطقة D-Loop بينما أثرت 20٪ فقط على جين السيتوكروم ب.

هذا لا يعني بالضرورة أن الطفرات تحدث بشكل طبيعي في منطقة D-Loop أكثر من جين السيتوكروم ب ، ولكنه يشير إلى أن الطفرات في منطقة D-Loop من المرجح أن يكون لها عواقب وخيمة وتفضل السرطان أكثر من الطفرات التي تحدث في الجينات الأخرى. أجزاء من جينوم الميتوكوندريا.

كما لاحظ الدكتور مباي وجود تغايرية عالية داخل الأورام: فليس كل الخلايا داخل ورم معين تحمل نفس الطفرات. يمكن أن يكون هذا التباين عاملاً مقيدًا في تحديد العلاج المناسب لأن خصائص الورم لا يمكن أن تُعزى إلى طفرة معينة.

على سبيل المثال ، من غير الواضح أي من منطقتي الميتوكوندريا (جين السيتوكروم ب أو الحلقة D) يرتبط بتكوين الأورام ، بما في ذلك التغيرات في دورة الخلية وموت الخلية والتمايز.

ومن غير المعروف أيضًا أي الطفرات في المنطقتين مسؤولة عن إعطاء السرطان خصائصه الغازية.

الآن بعد أن قدمت الدكتورة مباي وفريقها دليلًا على النظرية القائلة بأن معظم سرطانات الفم تحتوي على طفرات ميتوكوندريا ، ستكون الخطوة التالية هي فحص الطفرات في السرطانات الأخرى.

في السنغال ، حيث يقع مقر الدكتور مباي ، يعتبر سرطان الثدي مشكلة صحية كبيرة تؤثر على 20.7٪ من النساء. سرطان المبيض شائع أيضًا.

في دراستهم الجديدة ، سيقوم الفريق بفحص تسلسل الجين Cytochrome b و D-Loop لجينوم الميتوكوندريا في عينات سرطان الثدي وسرطان المبيض وسرطان الفم.

سيكون هدفهم هو مقارنة ملفات الطفرات وتحديد طفرات الميتوكوندريا المشتركة في السرطانات الثلاثة المختلفة. قد يشير العثور على أوجه التشابه بين ملفات تعريف الطفرات إلى عملية مرضية شائعة في السرطانات المختلفة.

بالنظر إلى المعدل المرتفع لطفرات الميتوكوندريا والخلل الوظيفي الراسخ في الميتوكوندريا في السرطان ، فإن جينوم الميتوكوندريا ، وفقًا للدكتورة مباي وفريقها ، وسيلة غير مكتشفة للبحث عن إمراض السرطان. تؤكد دراستهم أن نسبة عالية من طفرات الميتوكوندريا مرئية في السرطان.

هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات الآن لتوضيح العلاقة بين طفرات الميتوكوندريا ، والعملية المرضية ومعدل البقاء على قيد الحياة لدى مرضى السرطان. من خلال فهم الطفرات التي تلعب دورًا رئيسيًا في السرطان ، يمكن أن يكون الحمض النووي للميتوكوندريا مصدرًا مرشحًا مثيرًا للعلامات الحيوية التي من شأنها أن تساعد في اكتشاف السرطانات في مرحلة مبكرة.

هذا كل شيء في هذه الحلقة - شكرًا على الاستماع ، وابقَ مشتركًا في Research Pod للحصول على المزيد من أحدث العلوم. نراكم مرة أخرى قريبا.


الطفرات في الحمض النووي للميتوكوندريا تنظم أمراض الميتوكوندريا والنقائل ولكنها لا تنظم الشيخوخة

تقترح نظرية الميتوكوندريا للشيخوخة أن تراكم الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) مع الطفرات المسببة للأمراض ، وعيوب التنفس الناتجة ، ليست مسؤولة فقط عن أمراض الميتوكوندريا ولكن أيضًا عن الشيخوخة والاضطرابات المرتبطة بالعمر ، بما في ذلك تطور الورم. هذه النظرية مدعومة جزئيًا بالنتائج التي تم الحصول عليها من الفئران الناقلة للحوض (الفئران الميتو) ، والتي تؤوي mtDNA مع الطفرات المتعامدة مع تلك الموجودة في المرضى الذين يعانون من أمراض الميتوكوندريا: تعبر الفئران الميتوكونية عن أنماط ظاهرية للمرض فقط عندما تعبر عن عيوب في التنفس ناجمة عن التراكم. من mtDNA المتحور. فيما يتعلق بتطور الورم ، فإن طفرات mtDNA المحددة التي تحفز أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تعزز التحول الخبيث لخلايا سرطان الرئة إلى خلايا ذات إمكانات نقيلية عالية. ومع ذلك ، فإن عيوب التنفس المرتبطة بالعمر في الخلايا الليفية البشرية المسنة لا ترجع إلى طفرات mtDNA ولكن إلى التنظيم اللاجيني للجينات المشفرة نوويًا ، كما يتضح من حقيقة أن وظيفة الجهاز التنفسي الطبيعية يتم استعادتها عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية المسنة.


نقاش

لقد درسنا تعديلات mtDNA الموجودة في مريض يعاني من مشاكل عصبية واستقلالية متعددة مميزة لمرض الميتوكوندريا. من المحتمل أن تكون العديد من التغييرات في mtDNA ضارة ، على الرغم من أنه لم يتم إثبات أن أيًا منها هو طفرات مسببة للأمراض. تم اكتشاف تغيير من السيتوزين إلى الثايمين عند 4936 في جين MT-ND2 كتغيير غير متجانس ، مما يشير إلى طفرة ضارة مفترضة (8 ، 9). ينتج عن هذا البديل تغيير من ثريونين إلى إيزولوسين عند aa 156 في الوحدة الفرعية المعقدة 1. هذا المتغير نادر (0.1٪ تردد) ، تم العثور عليه 3 مرات فقط بين 2700 فرد يتمتعون بصحة جيدة على ما يبدو من أعراق مختلفة ، وتم الإبلاغ عن أنهم ينتمون إلى haplogroup M1b1 (تم تحديده من خلال التغييرات 4936 C & gtT ، و 13111 T & gtC ، و 15247 C & gtG المرجع 19). يتم حفظ الأحماض الأمينية في هذا الوضع من خلال القردة العليا ، على الرغم من عدم حفظها جيدًا في الأنواع الدنيا.

تشير الطبيعة غير المتجانسة لتعديل النيوكليوتيدات 4936 C و gtT في جين MT-ND2 إلى أنه قد يساهم بشكل جيد في النمط الظاهري السريري. تم إنشاء خلايا سيبريد ترانسيتوكوندريا تحمل متغير mtDNA 4936 C & gtT غير المتجانسة بالإضافة إلى متغير mtDNA 4936 C و gtT لدراسة العلاقة بين تراكم طفرة mtDNA وخلل الميتوكوندريا المرتبط بهذه الطفرة والخلل الخلوي. مع زيادة الحمل من MT-ND2 mtDNA الطافر ، انخفض التنفس الداخلي تدريجيًا ، مما أدى إلى انخفاض معدل تخليق ATP ونمو الخلايا المقيد مقارنةً بالخلايا التي تحتوي على mtDNA من النوع البري. في الوقت نفسه ، انخفضت مستويات ROS داخل الخلايا والميتوكوندريا بشكل عكسي ، مما يشير إلى أن نازعة الهيدروجين NADH المختلة وظيفيًا (المركب I) لم تكن فعالة في نقل الإلكترونات إلى ETC ، وبالتالي تقليل ROS المتولدة. قد يكون الخلل موجودًا في مسار نقل الإلكترون قبل الوصول إلى إنتاج ROS. نظرًا لعدم توفر البنية ثلاثية الأبعاد للمركب I ، فقد قررنا اختبار ما إذا كان هذا المتغير قد أثر على تجميع المركب 1 وقمنا بإجراء تجربة PAGE Blue باستخدام جسم مضاد 1 معقد. تظهر نتائجنا أن هذه الطفرة لا تؤثر على التجميع المعقد 1 بشكل كبير (البيانات غير معروضة).

في اختبار الآجار الناعم الخاص بنا لاختبار قدرة تكوين الأورام للخلايا السيبريدية عبر الخلايا ، فقط الخلايا ذات المستعمرات المتغيرة mtDNA 4936 C & gtT المتجانسة ، مما يشير إلى أن طفرة MT-ND2 المتجانسة قد تعزز العديد من التغييرات المظهرية ، مثل فقدان التلامس والتثبيط الاستقلال ، مما يسهل التحول الخلوي في ظل انخفاض توتر الأكسجين ويحد من تركيز المغذيات. ومن المثير للاهتمام ، في سعينا لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة (iPS) من الخلايا الليفية لجلد المريض ، لم نتمكن من الحصول على خلايا iPS ذات محتوى mtDNA 4936 C & gtT من النوع البري أو منخفض البلازما المتغايرة. كان لمعظم خطوط iPS المنشأة تغيير نيوكليوتيد متماثل أو قريب من متماثل 4936 C & gtT في جين MT-ND2 (البيانات غير معروضة). تشير كل هذه النتائج إلى أن طفرة MT-ND2 الخاصة قد يكون لها تأثير معزز على نمو الخلايا و / أو القدرة على التوسع الاستعماري. لتحديد ما إذا كان تغيير النيوكليوتيدات المتجانسة 4936 C & gtT في MT-ND2 مرتبطًا بالفعل بتكوين الورم ، من المهم إجراء المزيد من التجارب في الجسم الحي فى المستقبل.

يعتمد النموذج السيبيري على إعادة توطين خط خلوي خالٍ ، مشتق عادةً من السرطان ، وخالٍ سابقًا من mtDNA الأصلي ولكن تم استبداله بالميتوكوندريا الطافرة المشتقة من المريض (12 ، 13 ، 18). تحافظ الخلايا السرطانية على معدل تحلل مرتفع للجلوكوز حتى في وجود الأكسجين ، وهي ظاهرة تم وصفها لأول مرة منذ 70 عامًا وكانت معروفة تاريخيًا باسم تأثير واربورغ (20). في الواقع ، تحلل السكر هو المسار الرئيسي لتوليد ATP للخلايا المستنبتة التي تزرع في وسط غني بالجلوكوز ، فقط كمية قليلة من البيروفات تتأكسد إلى CO.2 والمياه في الميتوكوندريا لتوليد ATP من خلال الفسفرة المؤكسدة (21). يحتوي الجالاكتوز على 6 ذرات كربون مثل الجلوكوز ويختلف عن الجلوكوز فقط في الكيمياء الفراغية 1 كربون ، C4. إن إنزيمات استقلاب الكربوهيدرات محددة بدرجة كافية بحيث يجب تغيير الجالاكتوز إلى الجلوكوز قبل أن يدخل تحلل السكر. لتحويل الجالاكتوز إلى جلوكوز ، يتم فسفرته أولاً بواسطة galactokinase لإنتاج الجالاكتوز -1 فوسفات. ثم يتم تبادل الجالاكتوز مع مجموعة الجلوكوز في UDP-glucose لإنشاء UDP-galactose وإطلاق الجلوكوز -1-فوسفات. يغير إنزيم epimerase الكيمياء الفراغية لـ C4 في UDP-galactose ، مما يؤدي إلى تكوين UDP-glucose. في الجولة التالية من تفاعل النقل ، يتم تحرير هذا الجلوكوز في صورة جلوكوز -1 فوسفات. بمجرد إطلاقه ، يتم تحويل الجلوكوز 1 فوسفات إلى جلوكوز 6 فوسفات ويمكن أن يدخل في تحلل السكر لتوليد الطاقة. في وسط الجالاكتوز الخالي من الجلوكوز ، تُجبر الخلايا المستنبتة على استخدام الجالاكتوز ، ويحدد التدفق المحدود للجالاكتوز إلى الجلوكوز -6-فوسفات تكوين القليل جدًا من اللاكتات لأن البيروفات ، التي تتشكل بمعدل أبطأ بكثير ، تتأكسد بشكل أكبر داخل الميتوكوندريا (17 ، 22). وهكذا ، غالبًا ما تموت الخلايا المستنبتة ذات التمثيل الغذائي المعيب للميتوكوندريا بسرعة عند زراعتها في وسط الجالاكتوز الخالي من الجلوكوز (17 ، 22). تم الإبلاغ عن ضعف نمو الخلايا الهجينة عبر الخلايا الحاملة للطفرات الممرضة LHON عندما تم تحضين الخلايا في وسط يحتوي على الجالاكتوز بدلاً من الجلوكوز (15 ، 18 ، 23).

في هذه الدراسة ، وجدنا بشكل مفاجئ أن الخلايا الهجينة ذات النيوكليوتيدات من النوع البري في الموضع 4936 في جين MT-ND2 ماتت بشكل أسرع عندما تم تحضين الخلايا في وسط جالاكتوز خالٍ من الجلوكوز من تلك الخلايا ذات النيوكليوتيدات غير المتجانسة أو المتجانسة. يوجد تعديلين إضافيين لـ LHON في نازعة الهيدروجين NADH 1 (MT-ND1) وجينات MT-ND2 (4216 T & gtC و 4917 A & gtG) في الميتوكوندريا للمريض. ومع ذلك ، لا يتم حفظ هذين النيوكليوتيدات بشكل جيد من خلال التطور وهما موجودان في السكان عند ترددات

9 و 5٪ على التوالي. يتم تضمينها أيضًا بين تعدد الأشكال لمجموعة هابلوغروب T (MITOMAP). تم تحديدها على أنها طفرات ثانوية قد تغير من شدة LHON عندما تحدث مع إحدى طفرات LHON الأولية (24 ، 25). نظرًا لعدم اكتشاف طفرات LHON أولية في هذا المريض ، فمن غير المحتمل أن يكون هذان التعديلين ضارين في هذا المريض.

تم العثور على متغير خطأ مثلي نادر في جين ATPase 6 (9181 A & gtG) في mtDNA للمريض. ينتج عن هذا المتغير تغيير من السيرين إلى الجلايسين في aa 219 ، والذي يتم حفظه بشكل كبير في أنواع الثدييات وكذلك في الحمض النووي للميتوكوندريا للدجاج والأسماك ، مما يشير إلى أنه مهم لوظيفة بروتين ATPase 6. هذا المتغير نادر جدًا ، يتم الإبلاغ عنه مرة واحدة فقط بين

2700 تسلسل mtDNA من أفراد أصحاء من مجموعات عرقية متعددة (التردد 0.04٪ المرجع 26). على حد علمنا ، لم يتم اكتشافه في الأفراد المصابين بمرض الميتوكوندريا. من المحتمل أن يكون متغير الخطأ هذا ضارًا ، لكن حجم مساهمته في العرض السريري غير مؤكد. إذا كان هذا المتغير غير متجانسة عند مستوى 80-90٪ ، فإن احتمالية أن يكون مساهمًا رئيسيًا في الصورة السريرية ستزداد بشكل كبير. تعتبر حقيقة أن الخلايا التي تحتوي على السيتوزين من النوع البري في الموضع 4936 في جين MT-ND2 قد ماتت بشكل أسرع في وسط الجالاكتوز مقارنة بالخلايا الهجينة ذات التعديلات غير المتجانسة أو المتجانسة ، تشير إلى أن متغير 9181 A & gtG هو على الأرجح ضار ، لأن كل cybrid تحتوي الخلايا في دراستنا على هذا المتغير في جين ATPase 6. بالنسبة للخلايا التي تحتوي على السيتوزين من النوع البري عند 4936 ، قام نازع هيدروجيناز NADH (المركب I) بتجريد الإلكترونات بكفاءة من الركيزة ، ونقلها إلى ETC ، وضخ البروتونات في الفضاء بين الغشاء الميتوكوندريا ، على الرغم من أن سينسيز ATP المعيب كان يجب أن يعيق ارتداد سلس للبروتونات إلى مصفوفة الميتوكوندريا لزيادة تجمع الإلكترون داخل الميتوكوندريا. نفترض أن هذا الفائض من الإلكترونات جنبًا إلى جنب مع الإلكترونات الإضافية المتسربة من ETC سيؤدي إلى زيادة ROS ، مما يؤدي إلى تأثير proapoptosis (5). في الخلايا الهجينة التي تحتوي على ثايمين متغير عند 4936 ، فإن التدفق البطيء للإلكترونات إلى ETC الناجم عن خلل NADH ديهيدروجينيز (المركب I) يحافظ على تجمع الإلكترون داخل الخلايا داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى انخفاض مستويات ROS داخل الخلايا والميتوكوندريا وتأثير مضاد للتوازن.

معظم متغيرات التسلسل الأخرى التي لوحظت في mtDNA لدى المريض هي تعديلات قديمة عمرها آلاف أو مئات الآلاف من السنين. على الرغم من أنها ليست مسببة لمرض هذا المريض ، إلا أنه لا يمكن استبعاد احتمال أنها قد تساهم في زيادة خطر الإصابة بحالات معينة بطريقة متعددة العوامل. تشير نتائجنا إلى أن طفرة معينة في mtDNA قد تساهم في النمط الظاهري السريري المعدل بواسطة خلفية mtDNA وتوافر العناصر الغذائية. يمكن أن تكون عواقب متغيرات mtDNA خاصة بالأنسجة ، مما يساهم في تنوع الأعراض السريرية في أمراض الميتوكوندريا.


شاهد الفيديو: ما هو الكروموسوم - what is a chromosome (كانون الثاني 2022).