معلومة

أصل مصطلح "التقاء" في زراعة الخلايا


منذ أن كنت أقوم بزراعة الخلايا ، تم استخدام كلمة التجمع لوصف النسبة المئوية لنمو الخلايا أو المنطقة التي تغطيها. ومع ذلك ، لا يوجد قاموس وجدته يستخدم هذه الكلمة. كنت أتساءل عما إذا كان بإمكان أي شخص أن يذكر بشكل موثوق من أين يأتي المعنى أو كيف بدأ الارتباط ، وماذا يعني ذلك حقًا. لا أعتقد أنه يمكنني نشر هذا على موقع آخر لأن الكلمة ليس لها حتى معنى مشابه في القاموس. تعد زراعة الخلايا جزءًا لا يتجزأ من بيولوجيا الخلية والبحث الطبي والتصنيع البيولوجي. وهذا المصطلح جزء لا يتجزأ من ثقافة الخلية. لقد فوجئت بعدم تمكني من التحقق من معناها بشكل موثوق.


إلى جانب التفسير الاشتقاقي الذي قدمه @ aandreev ، يستخدم هذا المصطلح في ثقافة الخلية بشكل شائع لوصف كثافة الخلايا الملتصقة ويستخدم كمقياس لتكاثرها. عادة ما يتم دمجه مع نسبة تقديرية (أو محسوبة) ، لذا فإن 10٪ التقاء يعني أن 10٪ من سطح الطبق أو القارورة المستخدم مغطى بالخلايا ، 100٪ يعني أنه مغطى بالكامل. تنمو الخلايا ثنائية الأبعاد على سطح القارورة في هذه الحالة. توضح الصورة أدناه (من هنا) مستويات مختلفة من التقاء:

مستوى التقاء مهم لأن الخلايا تغير نموها مع تغير الكثافات. عادة ما تنمو الخلايا منخفضة الكثافة (10-20٪) بشكل أبطأ من 50٪ من الخلايا المتكدسة. إذا كانت الصفيحة مكتملة النمو بالخلايا ، فإنها تميل إلى النمو بشكل أبطأ كثيرًا مرة أخرى. يؤثر هذا على برنامجهم الجيني وسلوكهم في التجارب والاختبارات.

كما أشارRoland ، من المهم أن نقول إن التقاء ليس مقياسًا صعبًا ، ولكنه تقدير لكثافة الخلية. سيحصل الأشخاص المختلفون على تقديرات مختلفة ، ولكن يجب أن يكون الاتجاه هو نفسه.


con- (com-) هي بادئة تعني عادةً "التماسك" ، الانضمام. طلاقة الجذر / الطلاقة تأتي من اللاتينية فلوري، يتدفق.

المصدر: تعريفات Google لـ يخدع و الطلاقة (المعلومات مأخوذة من مطبعة جامعة أكسفورد).


الكلمة التقاء هو البديل للكلمة التقاء نهرين، على الرغم من أن هذا المتغير يظهر فقط مع أي تكرار في سياق ثقافة الخلية [1]. الكلمة التقاء نهرين ظهرت نفسها في القرن الخامس عشر وهي مشتقة من أواخر اللاتينية ملتف تعني "تتدفق معا" [2]. في اللغة الإنجليزية ، تم استخدامه في البداية لتدفق تيارين أو أكثر معًا ، ولكنه اكتسب مجموعة كبيرة ومتنوعة من المعاني التصويرية [3].

الكلمة التقاء نهرين (و لكن نادرا التقاء) يحدث في سياقات بيولوجية مختلفة في النصف الأول من القرن العشرين [4] ، ولكن المثال الأول الذي يمكن أن أجده فيما يتعلق بزراعة الخلايا أحادية الطبقة كان في عام 1961 [5] ، على الرغم من أن المصطلح مجتمع ظهر في الخمسينيات [6]. الاستمارة التقاء يبدو أنه ظهر في نفس وقت ظهور التقاء نهرين [7]. منذ الستينيات ، تم استخدام كلا النموذجين من قبل مؤلفين مختلفين ، حاليًا بتكرار مماثل [8]. يستخدم بعض المؤلفين أحدهما أو الآخر حصريًا ، بينما يستخدمه الآخرون التقاء عند الإشارة إلى تعيين النسبة المئوية و التقاء نهرين للإشارة إلى المفهوم المطلق - أو والعكس صحيح [9].

السبب في أن التقاء لم يتم تعريفه في القواميس العامة (أو حتى في قاموس أكسفورد للبيولوجيا [10]) لا يمكن تخمينه إلا. لم تقدم أي من القواميس على الإنترنت التي راجعتها [11] استخدام ثقافة الخلية كمثال على التقاء نهرين، مما يشير إلى أن استخدامه أقل تكرارا مما هو عليه في السياقات الفنية الأخرى ، حيث يكون المعنى مشابهًا. مع هذا الاستخدام التقاء نهرين لا يُعتقد أنه يستحق ذكرًا منفصلاً (بغض النظر عن أهمية أو غير ذلك من ثقافة الخلية) ، فإن الحاجة إلى تحديد شكل بديل لم تكن لتظهر.

يجب إضافة أن هناك يكون أ ويكيبيديا دخول ل التقاء [12] ولكن ، على الرغم من العنوان ، يستخدم هذا المصطلح التقاء نهرين في تعريفه:

"في بيولوجيا زراعة الخلايا ، التقاء نهرين يشير إلى النسبة المئوية لسطح طبق الثقافة المغطى بالخلايا الملتصقة. على سبيل المثال ، 50 بالمائة التقاء نهرين يعني أن نصف السطح مغطى تقريبًا ، بينما 100 بالمائة التقاء نهرين يعني أن السطح مغطى بالكامل بالخلايا ، ولم يتبق مزيد من المساحة للخلايا لتنمو كطبقة أحادية ".

ملحوظات

[1] الضربات التي أبلغت عنها Google Book ngram للكلمة التقاء بين عامي 1800 و 1954 تم تحليلها بشكل فردي ، حيث غالبًا ما تحتوي نتائج المجلة من ngrams على تواريخ خاطئة. كان هناك مثال واحد (1829) لحدوثه قبل عام 1900 ، و 13 قبل عام 1950 ، حوالي نصفه فيما يتعلق باللقاحات أو الظواهر البيولوجية.

[2] أصل اسم التقاء نهرين الواردة في القاموس الاشتقاقي على الإنترنت هي: أوائل القرن الخامس عشر الميلادي ، "تتدفق معًا ، خاصة من دفقين أو أكثر" ، من اللاتينية المتأخرة ملتفمن اللاتينية ملتف (اسمي يتجمع) ، النعت المضارع من التقاء "تتدفق معا" ، من شكل استيعابها كوم "مع ، معا" (انظر con-) + فلوري "للتدفق" (انظر بطلاقة). أود أن أؤكد أن كلمة التقاء هي ليس مركب يتكون في اللغة الإنجليزية عن طريق إضافة بادئة إلى الكلمة الطلاقة ، ولكنه مشتق من الكلمة المركبة ، ملتف، تطورت بالفعل في أواخر اللاتينية (أي بحلول القرن السادس).

[3] يقتبس قاموس أكسفورد الإنجليزي مثالًا مبكرًا لتوسيع معنى كلمة التقاء (1606) على أنه "في هذا التقاء نهرين الكثير من النجاحات المزدهرة ". يمكن العثور على مجموعة متنوعة من الأمثلة ، التي يبدو أنها تأتي من مجالات السياسة والفلسفة والرياضيات ، في قاموس كامبردج عبر الإنترنت لتعريفه الثاني لـ التقاء نهرين، "موقف يلتقي فيه شيئين أو يجتمعان".

[4] يمكن ملاحظة ذلك بالذهاب إلى المواقع الإلكترونية لبعض المجلات البيولوجية القديمة (مثل Journal of the National Cancer Institute أو The Journal of Experimental Medicine) والبحث عن الكلمة التقاء نهرين.

[5] الكتاب السنوي لمعهد كارنيجي بواشنطن لعام 1961 (ص 66).

[6] على سبيل المثال ، استخدمه دبليو آر إيرل (من محلول إيرل الملحي) في ورقة بحثية عن نمو الخلايا الليفية في عام 1951 ، واستخدمه تي تي باك (من محلول بوك الملحي) في مقال نشر عام 1958 في اكسبرينتيا. الاستخدام السابق لـ مجتمع (أيضًا من أصل القرن الخامس عشر) فيما يتعلق بالثقافة أحادية الطبقة تشير إلى أن الكلمة التقاء، بدلا من كونها فساد التقاء نهرين، ربما تكون قد تشكلت من الصفة - ربما في الجهل أن شكل الاسم موجود بالفعل.

[7] كونيغسبيرغ وآخرون. (1960) J. Biochem. بيوفيز. سيتول. 8 333-343.

[8] يبدو أنه كان هناك انقسام في البداية. في الولايات المتحدة ، استخدم هاري إيجل وريناتو دولبيكو المصطلح التقاء، بينما استخدم هوارد جرين وجورج تودارو التقاء نهرين. ما يمكن للمرء أن يشير إليه على أنه مدرسة غلاسكو تستخدم دائمًا التقاء نهرين: John Paul) في معهد Beatson وطالبه Ian Freshney ، وكلاهما مؤلفان لكتب مؤثرة في ثقافة الخلية. يمكن الحكم على تكرار الاستخدام الأحدث من Google ngram من أجل "التقاء الخلايا مقابل التقاء الخلايا".

[9] البحث عن التقاء نهرين في Journal of Cell Science ، ويؤدي فحص الإصدارات الحديثة إلى نتائج لكليهما التقاء نهرين و التقاء. تستخدم هذه الورقة الأخيرة التقاء نهرين حصريًا كمفهوم مطلق وكنسبة مئوية ، في حين أن هذه الورقة الحديثة ، على سبيل المثال ، تستخدم التقاء حصريًا بالمعنى المطلق والعددي. تشير ورقة أخرى إلى التقاء، ولكن إلى 70٪ التقاء نهرين، ولكن تم العثور على العكس تمامًا في هذه الورقة التي تشير إلى التقاء نهرينولكن 70-80٪ التقاء. بعض الأوراق - على سبيل المثال هذا البديل عشوائيا. من الواضح أن محرري المجلة لا يهتمون.

[10] قاموس أكسفورد للبيولوجيا لا يحتوي على أي شيء بين إدخالات مخروط و متحد البؤر.

[11] كولينز, الغرف, كامبريدج, معجم أو ميريام وبستر.

[12] ويكيبيديا دخول ل التقاء.


ثقافة الأنسجة: التعريف والتاريخ والأهمية

زراعة الأنسجة هي طريقة & # 8216in vitro & # 8217 زراعة الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء النباتية أو الحيوانية & # 8211 على وسط غذائي تحت ظروف معقمة عادة في وعاء زجاجي. يشار إلى زراعة الأنسجة أحيانًا باسم & # 8216 الثقافة المعقمة & # 8217 أو & # 8216 في المختبر & # 8217 الثقافة. بهذه التقنية يمكن الحفاظ على الخلايا الحية خارج جسم الكائن الحي لفترة طويلة.

وفقًا لـ Street (& # 821777) ، تتم الإشارة إلى زراعة الأنسجة إلى أي ثقافة متعددة الخلايا ذات استمرارية بروتوبلازمية بين الخلايا وتنمو على وسط صلب أو أتا وتغذى إلى طبقة سفلية وتتغذى بوسط سائل.

من خلال زراعة الأنسجة النباتية ، يمكن تربية نباتات جديدة في وسط صناعي من أجزاء صغيرة جدًا من النباتات ، مثل طرف الجذع ، أو طرف الجذر ، أو الكالس ، أو البذور ، أو الجنين ، أو حبوب اللقاح ، أو البويضة ، أو حتى خلية واحدة ، سواء كان النسيج المستنبت يتطور في نبات أو ينمو بشكل غير منظم يعتمد على الإمكانات الوراثية للأنسجة والبيئة الكيميائية والفيزيائية.

وفقًا للأجزاء المستخدمة في الاستزراع ، قد تكون ثقافة النباتات المعقمة من الأنواع التالية والخجولة:

(أ) إذا تم استزراع الشتلات ، فإنها تسمى ثقافة النبات.

(ب) عندما يُزرع الجنين يُعرف باسم زراعة الأجنة.

(ج) إذا تمت زراعة الأعضاء النباتية ، مثل أطراف النبتة ، أو أطراف الجذور ، أو بدائية الأوراق ، أو براعم الزهرة أو الثمار غير الناضجة ، فإنها تسمى ثقافة الأعضاء.

(د) تسمى زراعة الأنسجة غير المنظمة من تكاثر الخلايا لأجزاء من أعضاء النبات زراعة الكالس. تتشكل تكاثر الخلايا في النبات المستأصل بسبب الإصابة الناتجة عن الختان.

(هـ) عندما يتم استزراع خلية مفردة أو مجموعة خلايا صغيرة في حالة مشتتة ، فإنها تسمى ثقافة تعليق الخلية. ومن المعروف أيضا باسم ثقافة الخلية.

تسمى ثقافة الخلية المفردة أحيانًا استنساخ خلية مفردة. يسمى جزء النبات لبدء الاستزراع نبات نباتي. تسمى الثقافة المشتقة من نبات نباتي واحد استنساخًا. من أجل الحفاظ على الثقافة لفترة أطول نسبيًا ، يتم تغيير الثقافة me & shydium من وقت لآخر.

ستزيل هذه العملية المواد المطروحة الضارة التي تراكمت بسبب التمثيل الغذائي. يتم نقل جزء من الثقافة الأم إلى ثقافة فرعية متوسطة جديدة. يسمى هذا الجزء من اللقاح.

تاريخ زراعة الأنسجة:

في عام 1832 قال تيودور شوان أنه يمكن زراعة الخلايا خارج جسم الكائن الحي إذا تم تزويدها بظروف خارجية مناسبة. في عام 1835 قام ويلهلم رو بزراعة خلايا جنينية من الدجاج في محلول ملحي. قال Reichinger (1839) إن الأجزاء التي يزيد سمكها عن 1.5 مم كانت قادرة على النمو ولكن الأجزاء التي تقل عن هذا الحد فشلت في النمو. لم يستخدم أي مغذيات في تجربته.

لاحظ أرنولد (1885) وجولي (1903) النمو والانقسام الخلوي لخلايا الكريات البيض في السمندل في المزرعة. في عام 1907 نجح عالم الحيوان الأمريكي روس جرانفيل هاريسون في زرع خلايا عصبية من الضفدع في الليمفاوية الصلبة. يُعرف هاريسون بأنه أب زراعة الأنسجة.

MJ Burrows (1910) الأنسجة الجنينية المزروعة للدجاج في البلازما. تم زراعة خلايا الثدييات لأول مرة بواسطة Alexis Carrel. من خلال الزراعة الفرعية المتكررة ، تمكن من زراعة الأنسجة لمدة 34 عامًا. تم إجراء زراعة الأعضاء لأول مرة بواسطة D.H. Fell (1929) في إنجلترا. استخدم البلازما المتصلبة والمستخلص الجنيني كوسيط مغذي.

تاريخ زراعة الأنسجة النباتية:

حاول عالم النبات الألماني جوتليب هابرلاند أولاً زراعة الأنسجة النباتية & # 8216in vitro & # 8217. بدأ عمله في عام 1898. استخدم خلايا من أنسجة حواجز الأوراق وخلايا من اللب والبشرة وشعر البشرة من نباتات مختلفة للزراعة في الوسائط - التي تحتوي على محلول Knop & # 8217s ، والرشاشين ، والببتون والسكروز.

الخلايا المستنبتة عاشت لعدة أشهر ولكن الخلايا فشلت في التكاثر.

قد يكون هذا بسبب:

(أ) استخدام وسائط بسيطة للغاية ،

(ب) ثقافة الخلايا شديدة التباين و

(ج) لم يتم استخدام التقنيات المعقمة والخجول.

في تجارب مماثلة قام بها بعض العمال اللاحقين ظلت الخلايا على قيد الحياة لفترة طويلة لكنها فشلت في الانقسام.

بدأت زراعة الأنسجة البائسة في أوائل القرن العشرين. قام روبين بتربية أطراف الجذر المعزولة لأول مرة في عام 1922. كما عمل كوتي بشكل مستقل (& # 821722) ملاحظات مماثلة. قام روبن ومانيفال (& # 821723) بتربية الجذور والحفاظ على الثقافة لمدة 20 أسبوعًا عن طريق الزراعة الفرعية.

في عام 1934 ، نجح وايت في استنبات جذور الطماطم المعزولة لأول مرة في سكروز متوسط ​​وملمع ، وأملاح الحديد غير العضوية ، والثيامين ، والجليسين ، والبيريدوكسين ، وحمض النيكوتين ، إلخ. لبضعة أشهر تحت ظروف معقمة. استخدم لاحقًا (& # 821737 ، & # 821738) وسيطًا مكملًا بفيتامينات ب و IAA.

في عام 1937 ، أدرك وايت أهمية فيتامينات ب لنمو مزارع الجذور. اكتشف Went و Thimann (& # 821737) أهمية auxin (IAA). حصل Nobecourt (& # 821737، & # 821738) على بعض النمو في ثقافة إإكسبلنتس جذر الجزر. كما أشار إلى تمايز الجذور في زراعة الأنسجة. في عام 1938 تمت زراعة أنسجة ورم هجين التاباكو بنجاح وخجل.

في عام 1939 ، عمل ثلاثة علماء بشكل مستقل ، وهم وايت في الولايات المتحدة الأمريكية ونوبكورت وجوثريت في فرنسا ، على زراعة أنسجة الكالس بنجاح على وسط صناعي بشكل مستمر. قال Gautheret (& # 821739) أن زراعة الجزر تتطلب محلول Knop & # 8217s مكملًا بخليط Bertholots & # 8217 الملح والجلوكوز والجيلاتين والسيستين HC1 و IAA.

لاحظ الأبيض (& # 821739a) في زراعة الأنسجة ما قبل الحمل من الجذع الصغير للهجين Nicotiana glauca × N. langsdorfii نموًا غير محدود وغير متمايز. أظهر أن هذا النسيج يمكن أن يُزرع بشكل متكرر. سجل White (& # 821739b) تطور البراعم الورقية في زراعة الأنسجة للهجين N. glauca × N.langsdorfii في وسط المغذيات.

تمت زراعة الأنسجة من نباتات مختلفة في وقت لاحق. لوحظ أن الثقافات القديمة تظهر درجة متزايدة من التنظيم. كما تم الاعتراف بدور الفيتامينات في نمو النبات. قام كل من Wetmore و Wardlaw (& # 821751) بتربية أطراف النبتة pteridophytes (Selaginella و Equisetum والسراخس) بنجاح.

تمت زراعة أنسجة سيكويا semipervirens بواسطة Ball (& # 821755). تمت زراعة حبوب اللقاح من تاكسوس والجنكة بيلوبا بواسطة Tulecke (& # 821759). تمت زراعة الأنسجة الصنوبرية بنجاح بواسطة Harvey and Grasham (& # 821769).

من دراسات زراعة الأنسجة يمكن الحصول على معلومات مهمة حول علاقة إطلاق الجذر. أبلغ العديد من العلماء عن العوامل التي تتحكم في تمايز الأنسجة الوعائية من دراسات زراعة الأنسجة.

قام Van Oberbeck (& ​​# 821741) بتربية أجنة الداتورة على وسط مكمل بحليب جوز الهند. تم التعرف على أهمية حليب جوز الهند و 2-4D كمغذيات. يرجع السبب في تحفيز حليب جوز الهند إلى وجود الزياتين.

تم العثور على عامل الانقسام الخلوي الفعال ليكون كينتين ، وهو 6 فورفوريلامينوبورين. السيتوكينين هو مركب أميني-بيورين 6 معوض ، والذي يمكن أن يحفز انقسام الخلايا في زراعة الأنسجة النباتية. تمت زراعة الأنسجة أحادية النواة بنجاح على وسط يحتوي على حليب جوز الهند.

أنتجت زراعة الكالس في Tagetus erecta و Nicotiana tabacum على وسط المزرعة السائلة عند تحريكها على شاكر معلقًا من الخلايا المفردة أو مجاميع الخلايا (Muir & # 821753). يمكن أن يكون تعليق الخلية هذا مثقفًا.

تم إجراء دراسات على cul & shyture تعليق الخلية بواسطة Muir و Hildebrandt و Riker (& # 821754) و Street و Shigomura (& # 821757) و Torrey و Reinert (& # 821761) و Reinert و Markel (& # 821762). طور موير (& # 821753) تقنية ممرضة طوافة ورقية لزراعة خلية واحدة.

في هذه الطريقة ، تم وضع خلايا مفردة معزولة على ورق ترشيح مربع ، ووضعها على أنسجة ممرضة نشطة ، والتي توفر العناصر الغذائية المطلوبة للخلية المنفردة النامية. في طريقة أخرى ، تم تعليق الخلايا على قطرة خجولة في غرفة دقيقة.

Bergman (& # 821760) يعمل مع الثقافات المعلقة من Nicotiana tabacum var. sansum و Phaseolus vulgaris var. "قضيب ذهبي مبكر & # 8217 طور تقنية طلاء أجار لاستنساخ خلية واحدة. في هذا ، تم فصل جزء الخلية الواحدة عن طريق الترشيح ، وخلطه مع أجار دافئ ثم مطلي بطبقة رقيقة.

لاحظ Melchers و Bergmann (& # 821759) أنه بعد عدة ثقافات من تبادل لاطلاق النار أحادي الصيغة الصبغية لـ Antirrhinum majus ، كان هناك زيادة في ploidy. لاحظت كرة (& # 821746) إمكانية تجديد النبات بالكامل في زراعة طرف النبتة لنباتات كاسيات البذور. حصل كل من Wetmore و Wardlaw (& # 821751) ، Morel (& # 821760) على نباتات كاملة من استزراع القرود التي تحتوي على ورقة أو ورقتين. استخدم Morel (& # 821764) هذه الطريقة لزراعة بساتين الفاكهة.

تسمى الخلية التي يمكن أن تتطور إلى كائن حي كامل عن طريق التجدد خلية to & shytipotent. صاغ مورغان هذا المصطلح في عام 1901. وفقًا لـ White (& # 821754) إذا كانت جميع خلايا الكائن متعدد الخلايا كاملة القدرة ، فإن هذه الخلايا في حالة معزولة و shytion تستعيد قوتها الانقسام ويمكنها إنتاج نباتات كاملة. في الكائن الحي تظل هذه القدرة مكبوتة.

لوحظ أن الخلايا المفردة قادرة على إنتاج نباتات جديدة. تم الحصول على أجنة أحادية الصيغة الصبغية من حبوب اللقاح وثقافة أنثرية. طريقة الاستزراع الميكروي لنيكوتيانا وداتورا تم تطويرها بواسطة Nitsch (& # 821774 ، & # 821777). كان قادرًا على مضاعفة عدد الكروموسوم وحصل على نباتات ثنائية الصبغيات متماثلة اللواقح.

من زراعة أخرى للتبغ Bourgin و Nitsch (& # 821767) ، حصل ناكاتا وتاناكا (& # 821768) على أنسجة أحادية الصيغة الصبغية وأجنة أحادية الصيغة الصبغية.

سجل التويتر (& # 821760) إطلاق البروتوبلاست من خلايا طرف الجذر باستخدام السليلوز الفطري في 0.6 م سكروز. كان قادرًا على استزراع البروتوبلاست المعزولة ، والتي تجدد جدران الخلايا الجديدة وتنتج مستعمرات خلوية وفي النهاية نبيتات.

في العديد من مزارع تعليق النبات تم إطلاق البروتوبلاستس الخلوية بنجاح. تستخدم تقنية زراعة الأنسجة النباتية لدراسة فسيولوجيا الورم.

تمكن White and Brown (& # 821742) من استنبات ورم مرارة التاج الخالي من البكتيريا. في Scorzonera hispanica Gautheret (& # 821746) لاحظ أن ثقافة الكالس التي كانت تتطلب في البداية أوكسين ، أنتجت بعض التكاثر الذي يمكن أن ينمو في وسط نقص الأكسين.

تسمى هذه التغييرات الوراثية والمختلة التي تحدث في المتطلبات الغذائية (خاصة التي تتضمن أوكسين) لخلايا الثقافة التعود. لا تستبعد ثقافة الأوكسين المعتادة الإمداد بالأوكسين الخارجي (الجزار & # 821777). لاحظ بوتشر (& # 821777) أنه عندما يتم تطعيم أنسجة الأوكسين والسيتوكينين المعتادة في نبات صحي ، يتم إنتاج الأورام.

يمكن الحصول على نباتات خالية من مسببات الأمراض عن طريق زراعة نسيج قمي & # 8217.

بحلول أواخر 70 & # 8217 ، كان من الواضح أن تقنية زراعة الأنسجة النباتية يمكن استخدامها بنجاح في مختلف مجالات الزراعة ، مثل إنتاج ثقافة خالية من مسببات الأمراض ، وإخراج المنتجات الثانوية ، والتكاثر النسيلي ، والثقافة الطافرة ، والتربية الفردية والهندسة الوراثية.

عن طريق زراعة الأنسجة ، تم إنتاج مزارع خالية من مسببات الأمراض. هذه التقنية غير مهمة وغير مهمة للتحقيقات المرضية للنبات. تستخدم البروتوبلاست في الثقافة لعدوى الفيروس والدراسات البيوكيميائية.

من ثقافة التعليق يمكن تصنيع المنتجات الثانوية بكميات كبيرة. بعض هذه المواد هي الإنزيمات ، والفيتامينات ، والنكهات الغذائية ، والمحليات ، وقلويدات المضادة للالتهاب والشيمور والمبيدات الحشرية. في اليابان تم تحقيق ثقافة & # 8216in vitro & # 8217 على المستوى الصناعي.

تم تحقيق التكاثر النسيلي لبساتين الفاكهة والعديد من نباتات الزينة والاقتصاد الأخرى بواسطة ثقافة & # 8216in vitro & # 8217. في البطاطا تم تحقيق التكاثر النسيلي عن طريق زراعة الخلايا الأولية للخلايا الورقية. باستخدام المطفرات في الثقافة متبوعًا بانتقاء النباتات الطافرة المقاومة للأمراض أو المقاومة للإجهاد.

عن طريق الاستيلاد أحادي العدد ، تم إنتاج عدد قليل من المزارعين. تم إنتاج الأنواع الهجينة من الأنواع ذات الصلة ولكن غير المتوافقة جنسياً عن طريق اندماج البروتوبلاست. من خلال هذه التقنية تم إنتاج هجين بين البطاطس والطماطم. عن طريق الاندماج الخلوي للخلايا المعزولة من نوعين مختلفين يتم إنتاج نباتات التبغ الهجينة.

يمكن تقصير فترة سكون البذور عن طريق استئصال البذور وزراعة جنينها على وسط صناعي (زراعة الأجنة). يمكن زراعة الجنين الفاشل بنجاح عن طريق زراعة الأجنة.

يمكن إدخال الجينات الأجنبية ذات السمات المرغوبة المرتبطة بالبلازميد في البروتوبلاست العاري عادةً عن طريق الجسيمات الشحمية. لا يزال التعبير عن الجين الذي تم إدخاله في النبات الناضج موضع شك.

أهمية زراعة الأنسجة:

لزراعة الأنسجة أهمية كبيرة في دراسات تكوين النبات ، الفيزيولوجيا وعلم الأجنة ، الكيمياء الحيوية ، علم الأمراض ، علم الأجنة ، علم الخلايا إلخ. يمكن ملاحظة التغييرات المختلفة التي تحدث في الخلية من الثقافة النسيليّة.

يمكن دراسة العلاقة المتبادلة بين خليتين في زراعة الأنسجة. بمساعدة طور التباين السينمائي-التصوير المجهري ، من الممكن فهم واضح جدًا للانقسام والانقسام الاختزالي في زراعة الأنسجة. أشار هابرلاند إلى أهمية زراعة الأنسجة في دراسة تشكل النبات. يمكن فهم العلاقة بين النمو والتمايز جيدًا من مثل هذه الثقافة.

في نباتات التكاثر الخضري ، تتشكل العديد من النبتات بسرعة كبيرة من زراعة الكالس أو استزراع إإكسبلنتس. يمكن أن تشكل نباتات الأوركيد ، التي تنتشر ببطء شديد ، العديد من النبتات بسرعة كبيرة في زراعة أطراف الجذع. لوحظ هذا أيضًا في car & shynation.

من خلال طريقة زراعة الأنسجة ، يمكن الحصول على أنواع نباتية جديدة عن طريق عزل الجينات والخلايا الفريدة من نوعها. يتم تكوين نباتات جديدة من زراعة الكالس من التبغ والجزر والهليون وما إلى ذلك. تظهر مثل هذه النباتات التباين الجيني.

من خلال دراسات الخلايا الطافرة ، يمكن فهم العملية البيوكيميائية والتطورية للكائن الحي بشكل أفضل. في زراعة الأنسجة ، يمكن إحداث طفرة بسهولة ويمكن إنتاج نباتات متحولة من هذه الخلايا الطافرة.

في التبغ ، يتم إنتاج الأرز وما إلى ذلك من نبيتات أحادية الصيغة الصبغية من زراعة الأنثر. عن طريق مضاعفة الكروموسوم يتم الحصول على النباتات متماثلة اللواقح بسرعة أكبر. لذلك ، هذه العملية لها أهمية كبيرة في تربية النبات.

تم استخدام تقنية زراعة الأنسجة بنجاح في أبحاث التغذية. يمكن دراسة تأثير الأملاح المعدنية والفيتامينات وغيرها على النمو في الثقافة. يمكن الحصول على العديد من المعلومات المهمة حول استقلاب الجلوكوز واستقلاب النيتروجين وإنتاج الهرمونات من ثقافة & # 8216in vitro & # 8217.

يمكن استخدام ثقافة التعليق في ظل ظروف خاضعة للرقابة لحل العديد من المشكلات الفسيولوجية أو الكيميائية الحيوية ، كما توفر نظامًا لإنتاج منتجات نباتية مهمة ، مثل قلويدات النبات.

من خلال زراعة الخلايا والأعضاء في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة ، يمكن دراسة العمليات الغذائية والتغذوية والتمثيل الغذائي. لا يمكن أن تنمو بعض الخلايا الطافرة في وسط لا يحتوي على مغذيات خاصة. من هذه الخطوات البيوكيميائية للعملية يمكن تحديدها.

زراعة الأنسجة لها أهمية كبيرة في الدراسات المرضية. يمكن دراسة تأثير الأدوية المختلفة على الخلايا المصابة بمسببات الأمراض في زراعة الأنسجة.

تمت معالجة زراعة خلايا الذرة من النباتات المعرضة للسلالة T من Helminthosporium maydis بالباتوتوكسين للفطر. تمكن العلماء من الحصول على خلايا مقاومة لهذه الفطريات. من هذه الخلايا تم إنتاج نباتات مقاومة أيضًا.

يتم استخدام تقنية زراعة الأنسجة في دراسات أمراض أورام النبات وعلاقة الطفيل بالعائل. يمكن إنتاج نباتات خالية من الأمراض عن طريق زراعة الأنسجة te & shychnique. لزراعة الأنسجة أهمية كبيرة في إنتاج اللقاح. في عام 1949 ، تم إنتاج لقاح لشلل الأطفال بعد ملاحظة أن فيروس شلل الأطفال يمكن أن يهاجم الخلايا البشرية. تم استخدام اللقاحات اللاحقة ضد النكاف ، واللحمة ، والأنفلونزا.

تمت دراسة عملية هجوم الفيروس وتأثيره على الخلايا اللاحقة وكيفية إنتاج فيروسات جديدة وما إلى ذلك في زراعة الأنسجة. تمت دراسة سلوك المواد التي يمكن أن تمنع هجوم الفيروس على الخلايا المصابة بالفيروس.

في زراعة الأنسجة يمكن دراسة سلوك الخلايا الطبيعية والسرطانية. لوحظ أن بعض الفيروسات والمواد الكيميائية المسببة للسرطان يمكن أن تسبب السرطان. تمت دراسة تأثير الإشعاع والمواد الكيميائية على الخلايا الطبيعية والسرطانية. من خلال هذه الدراسات ، قد يكون من الممكن معرفة المواد الكيميائية التي يمكنها تدمير الخلايا السرطانية.

من دراسات زراعة الأنسجة تم الحصول على معلومات حول بعض الأمراض الوراثية للإنسان. يمكن أيضًا التعرف على ناقلات بعض الأمراض من خلال تقنية انسداد الأنسجة. من ثقافة الكريات البيض ، تم التخلص من سبب المنغولية في الإنسان. من هذه الثقافة تم التعرف على كروموسوم فيلادلفيا غير الطبيعي. هذا الكروموسوم له بعض العلاقة مع ابيضاض الدم الحبيبي المزمن.

عندما تتم زراعة الأنسجة من شخص إلى آخر ، في بعض الأحيان يكون هناك رفض للأنسجة. لذلك من الضروري مطابقة أنسجة المتبرع والمتلقي قبل الزرع الفعلي. يمكن القيام بذلك عن طريق زراعة الكريات البيض المختلطة للمانح والمتلقي.

عادة لا يتم تهجين الأنواع ذات الصلة البعيدة. يمكن حذف هذه الصعوبة عن طريق اندماج الخلية وتقنية انصهار البروتوبلاست. أنتج كارلسون في عام 1972 بنجاح نباتات هجينة عن طريق اندماج البروتوبلاست بين Nicotiana glauca X N. langsdorfii. حصلت القوة (& # 821776) على هجينة بين البطونية الهجينة و P. parodii عن طريق اندماج البروتوبلاست.

أنتج Kaw and Wetter (& # 821777) أنواعًا هجينة بين التبغ وفول الصويا عن طريق الاندماج الخلوي. وبالتالي فإن اندماج الخلايا وتقنيات اندماج البروتوبلاست والشيك لهما أهمية كبيرة في تربية النبات. تم الحصول على هجينة Lolium و Festuca الخصبة الرباعية الصبغية عن طريق اندماج الخلايا الجسدية.

يمكن عادة زراعة تلك الأجنة التي تفشل في إنتاج ثمار ناضجة ويتم إنتاج نباتات من مزارع الأجنة هذه. كما تمنع زراعة الأجنة سكون البذور. حصل كوبر (& # 821778) على نباتات هجينة بين الشعير والجاودار عن طريق زراعة الأجنة.

حفظ الأصول الوراثية:

عن طريق زراعة الأنسجة يمكن تخزين الأصول الوراثية النباتية.

يمكن أن تكون هذه الطريقة ناجحة وتستخدم بخجل لحل المشكلات المختلفة:

(أ) العديد من البذور ، مثل بذور Citrus sp. و Coffea sp. و Hevea brasiliensis وما إلى ذلك ، تحتفظ بقدرتها على البقاء لفترة قصيرة. يمكن حفظها عن طريق زراعة الأنسجة.

(ب) النباتات التي يتم تكاثرها نباتيًا (مثل الموز والبطاطا والبطاطا الحلوة واليام) التي لا تنتج البذور أو التي تكون متغايرة الزيجوت ، يتم تخزينها كعقل أو درنات. هذا يتطلب الكثير من رسوم العمالة ومكلف للدعاية والخجل. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق زراعة الأنسجة.

تتكاثر العديد من أشجار الفاكهة في الوردية عن طريق التبرعم والتطعيم والطبقة والخجل. من خلال زراعة الأنسجة ، يمكن التكاثر السريع لمثل هذه النباتات.

(ج) في العديد من المصانع الاقتصادية ، مثل جوز الهند ، وبلام التمر ، وما إلى ذلك ، لا يحدث عادة إنتاج نباتي و shypagation. يمكن الحفاظ على الأصول الوراثية لهذه النباتات من خلال زراعة الأنسجة.

(د) تتكاثر العديد من الأشجار ببطء شديد. عن طريق زراعة الأنسجة ، يمكن أن تتكاثر هذه الدهانات بسرعة وتتشكل العديد من النباتات ذات الأنماط الجينية الأبوية.

للحفاظ على البلازما الجرثومية ، يجب تخزين الخلايا في مثل هذه الحالة التي تسمح بحد أدنى من انقسام الخلايا. إحدى الطرق التي تمت تجربتها هي تخزين الخلايا في نيتروجين سائل بدرجة حرارة - 196 درجة مئوية.

لحفظ الأصول الوراثية ، يمكن تخزين نصائح أو نباتات صغيرة. يمكن استخدام هذه المواد المخزنة عند الاقتضاء.

في زراعة الأنسجة يمكن كبح انقسام الخلايا بطرق مختلفة:

(ط) يمكن إضافة مثبط النمو المتوسط. المواد المستخدمة هي حمض الأبسيك ، المانيتول ، السوربيتول ، هيدرازيد الماليك ، حمض السكسينيك ، إلخ. يتم تخزين براعم البطاطس بنجاح في وسط يحتوي على هيدريزيد الماليك.

(2) درجة الحرارة المنخفضة مفيدة لتخزين الخلايا في الثقافة. يمكن تخزين مزارع البطاطا والبطاطا الحلوة والشمندر والعنب والتفاح وغيرها بهذه الطريقة. عادة ما يتم تخزين المحاصيل المعتدلة (مثل البطاطس) عند درجة حرارة من 0-6 درجة مئوية والمحاصيل الاستوائية (مثل البطاطا الحلوة) عند 15-20 درجة مئوية. بهذه الطريقة ، تم الحفاظ على استزراع المريستم للفراولة لمدة ست سنوات.

(3) يمكن تغيير تركيز المغذيات في وسط الثقافة. قد يتم توفير بعض المواد اللازمة للنمو الطبيعي بتركيز أقل أو قد لا يتم توفيرها على الإطلاق.

(4) يمكن تغيير تركيبة الغاز داخل وعاء الاستزراع. يمكن خفض ضغط atmos & shypheric أو تركيز الأكسجين للحفاظ على الخلايا.

إنتاج المنتجات الأيضية الثانوية:

تنتج بعض النباتات منتجات أيضية ثانوية ، مثل ، القلويد ، ومضادات الشيبيوتيك ، والجليكوزيد ، والراتنج ، والتانين ، والصابونين ، والزيت المتطاير ، وما إلى ذلك ، والتي لها أهمية اقتصادية كبيرة.

عن طريق زراعة الخلايا ، تم تصنيع مستقلبات ثانوية مختلفة (مثل الأرجين) بشكل مصطنع. يمكن تحسين زراعة النباتات التي تنتج مستقلبات ثانوية بشكل ملحوظ عن طريق زراعة الأنسجة. هناك عيوب معينة في إنتاج المستقلبات الثانوية عن طريق زراعة الأنسجة.

(1) يحدث تخليق الأيضات الثانوية والأقنعة في زراعة الخلايا بمعدل أقل مما يحدث في النبات بأكمله ،

(2) بعد الثقافة المطولة & # 8216in vitro & # 8217 ، قد ينخفض ​​إنتاج المستقلبات الثانوية أو حتى يتوقف ،

(3) تكلفة الإنتاج على نطاق واسع من المستقلبات الثانوية في ثقافة الخلية مرتفعة. لذلك ، يتم إنتاج مستقلبات ثانوية نادرة جدًا وباهظة الثمن فقط عن طريق زراعة الأنسجة.


متى الثقافة الفرعية؟

تتشابه معايير تحديد الحاجة إلى الثقافة الفرعية في الثقافات الملتصقة والمعلقة ، ومع ذلك ، هناك بعض الاختلافات بين خطوط خلايا الثدييات والحشرات.

خطوط الخليةكثافة الخليةاستنفاد الوسيط
خلايا الثدياتيجب مرور الثقافات الملتصقة عندما تكون في مرحلة السجل ، قبل أن تصل إلى نقطة التقاء. تتوقف الخلايا الطبيعية عن النمو عندما تصل إلى نقطة التقاء (تثبيط التلامس) ، وتستغرق وقتًا أطول للتعافي عند إعادة زرعها. يمكن أن تستمر الخلايا المحولة في التكاثر حتى بعد أن تصل إلى التقاء ، لكنها عادة ما تتدهور بعد حوالي مرتين. وبالمثل ، يجب أن يتم تمرير الخلايا المعلقة عندما تكون في مرحلة النمو اللوغاريتمي قبل أن تصل إلى التقاء. عندما تصل إلى الالتقاء ، تتكتل الخلايا الموجودة في التعليق معًا ويبدو الوسط عكرًا عندما يتم تدوير دورق الثقافة.يشير الانخفاض في الرقم الهيدروجيني لوسط النمو عادةً إلى تراكم حمض اللاكتيك ، وهو منتج ثانوي لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. يمكن أن يكون حمض اللاكتيك سامًا للخلايا ، ويمكن أن يكون انخفاض درجة الحموضة دون المستوى الأمثل لنمو الخلايا. يعتمد معدل تغير الأس الهيدروجيني بشكل عام على تركيز الخلية في تلك الثقافات عند وسط عادم عالي التركيز للخلية أسرع من تركيزات الخلايا الأقل. يجب أن تقوم بتربية خلاياك الفرعية إذا لاحظت انخفاضًا سريعًا في درجة الحموضة (& gt0.1 - 0.2 وحدة pH) مع زيادة في تركيز الخلايا.
خلايا الحشراتيجب أن تتم زراعة خلايا الحشرات بشكل فرعي عندما تكون في مرحلة السجل ، قبل أن تصل إلى نقطة التقاء. بينما يمكن تمرير خلايا الحشرات الملتصقة بإحكام عند التقاء ، مما يسمح بفصل أسهل عن وعاء الاستزراع ، فإن خلايا الحشرات التي يتم تمريرها مرارًا وتكرارًا عند كثافات عرض التقاء التقاء قلصت مرات مضاعفة ، وانخفضت قابليتها للحياة ، وانخفضت القدرة على الارتباط. من ناحية أخرى ، فإن مرور خلايا الحشرات في مزرعة ملتصقة قبل أن تصل إلى التقاء يتطلب المزيد من القوة الميكانيكية لإخراجها من الطبقة الأحادية. عندما يتم تربيتها بشكل متكرر قبل التقاء ، تظهر هذه الخلايا أيضًا أوقاتًا مضاعفة منخفضة وتقل مضاعفة مرات العرض ، وتقلل من قابليتها للحياة ، وتعتبر غير صحية.تُزرع خلايا الحشرات في وسط نمو يكون عادةً أكثر حمضية من تلك المستخدمة في خلايا الثدييات. على سبيل المثال ، يحتوي وسيط TNM-FH و Grace المستخدم في زراعة خلايا Sf9 على درجة حموضة تبلغ 6.2. Unlike mammalian cell cultures, the pH rises gradually as the insect cells grow, but usually does not exceed pH 6.4. However, as with mammalian cells, the pH of the growth medium will start falling when insect cells reach higher densities.

You will get useful cell numbers in various sizes of tissue cell culture dishes, plates and flasks. We provides useful numbers, such as, growth surface area, volumes of dissociation EDTA-Trypsin solution, culture medium, seeding density and cell numbers at 100% confluent, are given below for Greiner Bio One and Nest Biotechnology cell culture dishes, cell culture plates and cell culture flasks. This can be a reference for cell culture dishes, plates, flasks from other companies, such as Corning, TPP, ThermoFisher Scientific, Sigma, etc according to the same cell growth surface area.

In mammalian tissue cell culture, confluence is commonly used to estimate the number of adherent cells in a culture dish, plate or a flask, referring to the proportion of the surface which is covered by cells. For example, 70% confluence means roughly 70 percent of the growth surface is covered by cells, and there is still room for cells to grow. 100% confluence means the cell growth surface is completely covered by the cells, and no more room is left for the cells to grow as a monolayer.

Different cell lines exhibit differences in growth rate. Most cells are typically passaged before becoming fully confluent in order to maintain their proliferative phenotype. Some cell lines are not limited by contact inhibition, such as immortalized cells, may continue to divide and form layers on top of the parent cells. To achieve optimal and consistent results, experiments must be conducted at certain confluence, depending on the cell type. The cell number listed in the growth chart here is based on Hela cells, and provided as a reference. For your specific cell type you may have to gain empirical numbers.


المصطلح

Compiled by the 1990 Terminology Committee
Members: Dr. Stephen Mueller,
Dr. Michael Renfroe, Dr. Jerry W. Shay, and Dr. James Vaughn
(Originally published in In vitro Cell. Dev. Biol. 26:97-101, January 1990)

When areas of research become interdisciplinary their jargon, techniques and bodies of information are utilized widely in diverse disciplines. At such times, reciprocal use of terminology by individuals who had not previously used it is often misused and, therefore, confusion occurs. This confusion is especially acute in the field of vertebrate, invertebrate and plant cell culture. There is hardly a field of biological investigation in which culturing of such cells is not employed. Similarly, molecular biology and molecular genetics are lending their technology to an ever widening group of researchers who are communicating in a more global sense via scientific presentations, publications and research proposals. Unfortunately often the writer and reader represent different areas of specialization who have been brought together by the common technology used in their work. As such, misuse of terminology can prove unfortunate indeed anything from inability to repeat a piece of research to problems in publishing a paper or obtaining funding of a research proposal. The following glossary, approved by the Society for In Vitro Biology, Terminology Committee is published in an effort to increase communication between scientists and between scientists and the lay community.


الملخص

Mechanical phenotyping of adherent cells has become a serious tool in cell biology to understand how cells respond to their environment and eventually to identify disease patterns such as the malignancy of cancer cells. In the steady state, homeostasis is of pivotal importance, and cells strive to maintain their internal stresses even in challenging environments and in response to external chemical and mechanical stimuli. However, a major problem exists in determining mechanical properties because many techniques, such as atomic force microscopy, that assess these properties of adherent cells locally can only address a limited number of cells and provide elastic moduli that vary substantially from cell to cell. The origin of this spread in stiffness values is largely unknown and might limit the significance of measurements. Possible reasons for the disparity are variations in cell shape and size, as well as biological reasons such as the cell cycle or polarization state of the cell. Here, we show that stiffness of adherent epithelial cells rises with increasing projected apical cell area in a nonlinear fashion. This size stiffening not only occurs as a consequence of varying cell-seeding densities, it can also be observed within a small area of a particular cell culture. Experiments with single adherent cells attached to defined areas via microcontact printing show that size stiffening is limited to cells of a confluent monolayer. This leads to the conclusion that cells possibly regulate their size distribution through cortical stress, which is enhanced in larger cells and reduced in smaller cells.


Cell culture basics

Culture conditions


For cell survival and proliferation, it is essential that the culture environment replicates, as best as possible, the physiological environment of cells. Culture conditions that can be controlled include temperature, relative humidity and CO2 levels as well as factors associated with the media, such as nutrient composition, pH, osmolality and the volume and frequency of replenishment. These variables can fluctuate over time so they should be monitored. Table 3 highlights the optimal culture conditions for most mammalian cell cultures, however exceptions do exist. 5

Table 3: Optimal cell culture conditions for most mammalian cells. 1 , 2 , 4 , 8


6. Large-scale retrieval of stem cells for clinical applications

(a) Cell detachment

Cell detachment is a critical step for subculturing surface adherent cells. At a small scale, mechanical detachment methods are well established for different types of cells and are traditionally used for PSCs. However, for large-scale cell expansion these methods cannot be used. In principle, the efficiency of cell detachment depends on the cells to be detached, the microcarrier and carrier surface, and thus the interaction of the cells with the microcarrier and, of course, also the detachment agent. Traditionally, proteolytic enzymes, in particular, trypsine or its recombinant and/or animal-free substitutes, are used for the efficient generation of single cell suspensions.

In addition to genomic instability seen to be readily generated in systems where enzymatic dissociation is used [138], there are further disadvantages when using proteases for cell detachment. Goh وآخرون. [90] showed that trypsin was the most efficient detachment agent with respect to speed and efficiency for detaching human fetal MSCs from Cytodex 3 carriers, followed by collagenase I and TrypLE Express with an overall viability of the detached cells of more than 95% for all agents. However, all of the cells detached with protease showed (osteogenic) differentiation efficiency significantly lower than that observed for the non-treated/non-harvested cells the differentiation efficiencies were 26� µg Ca ++ -deposition/10 6 cells (i.e. indicator for osteogenic differentiation) and 71 ± 4 µg Ca ++ -deposition/10 6 cells, respectively.

This indicates very clearly the negative impact of protease treatment for cell detachment on cell fate due to the degradation of ECM proteins, destruction of cytoskeletal structures and cell-to-cell contacts. Similar effects caused by proteolytic cell detachment, for instance, have been reported by Canavan وآخرون. [139] for the detachment of bovine aortic endothelial cell monolayers. Specifically for hMSCs, Potapova وآخرون. [140] reported a decrease of CD105 expression with time of exposure to trypsin over a range of 5� min. These results clearly indicate that the exposure to trypsin or any other proteolytic agent should be as short as possible. Based on this observation, Nienow وآخرون. [141] evaluated a novel two-step protocol for trypsinization of hMSCs comprised of the addition of and incubation with trypsin-ETDA for 7 min at a fivefold increased agitation rate (30 → 150 r.p.m., followed by 200 r.p.m. for the last 5 s) leading to an increase in the maximal specific energy dissipation rate (ɛ) from approximately 9 × 10 𢄤 to 0.11 W kg 𢄡 . This equates to a reduction of the Kolmogorov length from about 180 µm (well above the eddy size at which damaging occurs, as suggested by Croughan وآخرون. [31,36]) to 55 µm, which is well above the size critical for isolated cells, however sufficient to detach cells. The second step consisted of the inactivation of trypsin and the removal of the carriers via filtration. Nienow وآخرون. [141] reported a recovery of more than 95% of the cells which maintained their specific characteristics.

With respect to the detachment of hiPSCs, there is only limited literature available. In principle, when aiming to get to a single cell suspension, trypsin or equivalent (recombinant) proteases, including Accutase, Accumax or TrypLE, are preferable because the protein bridges between the cells are also degraded. However, the generation of single cell suspension of hiPSCs is characterized by high cell loss due to dissociation-induced apoptosis after passaging as single cells, which could be solved by the use of Rho kinase inhibitors, such as Y-27632 or ROCKi [142]. Another way to circumvent this problem is dissociation into aggregates because it has been shown that microcarrier cultures of PSCs can also be seeded with cell aggregates/clumps and that single cell suspensions are not required [143]. The only issue of importance is the fact that the size of aggregates has to be uniform during the culture, which is achieved by agitation generating the required turbulences (see above).

Dissociation of cultures into aggregates can be achieved by using other proteases and agents, including collagenase IV, dispase or hypertonic Na-citrate solution. In this context, Nie وآخرون. [106] showed that the use of hypertonic Na-citrate solution led to superior results with respect to viability and total viable cell number obtained over several passages when compared with detachment using collagenase, dispase or mechanical methods (order of decreasing efficiency). The cells detached using the hypertonic citrate solution kept their ability to express pluripotency markers and could differentiate to all three germ layers after 30 passages.

Thus, in general, the use of non-proteolytic cell detachment means (absence of proteases) has an undeniable positive effect on subcultivation and differentiation of stem cells. These few references show very clearly that any proteolytic cell detachment should be avoided in order to maintain the organization of the cellular cytoskeleton as well as the cell-to-cell interaction as much as possible and to reduce cell damage. For regenerative medicine purposes, protocols for non-proteolytic cell sheet detachments have been developed (e.g. [144]), mainly based on the use of a temperature-responsive poly(ن-isopropylacrylamide (pNIPAAm) modified polystyrene surface allowing the detachment of cells by a reduction of temperature (below the lower critical solution temperature) leading to hydrophilic surface properties and cell detachment [145]. Since, no proteases are used, the cells detach as cell sheets because the intercellular proteinous bridges are preserved. In order to improve cell adhesion and proliferation such thermo-responsive surfaces can be functionalized, including grafting on heparine for binding bFGF [146], the cell-binding domain RGDS [147] or the cyclic RGD peptide CRGDC [148] because of its high affinity binding to the αv㬣, αv㬥 or 㬕㬡 integrins of cells, to mention just a few possibilities.

Only recently, microcarriers grafted with poly(ن-isopropylacrylamide allowing the non-invasive harvesting of anchorage-dependent cells had been evaluated. That this principle can be implemented was shown by Kenda-Ropson وآخرون. [149] and Tamura وآخرون. [150] for the detachment of CHO-K1 from modified microhex carriers (pNIPAAm-grafted 2D-polystyrene carriers) and from chloro-methylated polystyrene beads (pNIPAAm-grafted), respectively. Furthermore, Yang وآخرون. [151] and Gümü𕿞relioğlu وآخرون. [152] showed the efficient detachment of human bone marrow-derived MSCs from Cytodex 3 grafted with pNIPAAm and of mouse fibroblasts (L929) and human keratinocytes (HS2) from cross-linked poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) beads grafted with pNIPAAm. In all cases, the reduction of the temperature from 37ଌ to less than 30ଌ led to cell detachment, though more in the form of cell clumps than isolated cells. Although this is a very promising development, few advances have been performed in this specific domain with respect to thermo-responsive microcarriers and further efforts are necessary in order to solve many still existing technological hurdles before large-scale implementation.

With respect to the use of such temperature-responsive culture supports for the expansion of iPSCs, it is highly probable that they can be used for this type of cells without any drawbacks, since their differentiation potential as well as genetic stability is not affected by temperature reduction and exposure to 25ଌ and 4ଌ for up to 2 days [153]. More details on the possibilities and use of thermo-responsive and, in general, of stimuli-responsive cell culture supports can be found in the review by Brun-Graeppi وآخرون. [154].

(b) Separation of non-differentiated cells and of carriers: problem of carrier breakage

Removal of undifferentiated cells is a particular concern in clinical applications of differentiated progenies derived from iPSCs because undifferentiated PSCs are teratogenic [78]. On a small scale, fluorescence activated cell sorting for the isolation of differentiated cells, such as cardiomyocytes [155], neural [156] or endothelial cells [157], can be used. A similar technique is immunomagnetic cell sorting [158], allowing separation at a larger scale. The selective removal of undifferentiated cells using cytotoxic antibodies, such as the cytotoxic mAb 84 [159], is also of high interest and can be coupled to immunomagnetic cell sorting [158] reducing further the risk of teratoma formation. In certain cases, such as the separation of PSC-derived cardiomyocytes from non-cardiomyocytes and undifferentiated cells, the separation is enabled by distinct metabolic flow. Tohyama وآخرون. [160] reported that in a glucose-depleted and lactate-enriched medium only cardiomyocytes survived and that no tumours were formed after transplantation. More extended information can be found in recent reviews by Chen وآخرون. [15], Abbasalizadeh & Bahavand [161] and Diogo وآخرون. [162]. Nevertheless, it has to be mentioned that to date no systematic studies on harvesting PSCs and separation their differentiated progenies have been performed.

Another important issue should be touched here very briefly: Gupta وآخرون. [163] found that 𠆎xcessive’ stirring of microcarrier (Cytodex 3) cultures (r.p.m. > 25) in Bellco spinner flasks can lead to bead breakage. This is a known problem for soft carriers like Cytodex 1 or 3, but is also of concern when the expanded and differentiated cells are used في الجسم الحي, because these preparations have to be free of any residual microcarrier or sub-particles derived from these carriers. Sieving is a principle way to get rid of entire carriers however, breakage products are removed with difficulty or not at all. There are two main potential solutions to this problem: either using rigid carriers which are resistant to breakage, like beads made from polystyrene or glass, or using soft carriers which can be dissolved using proteases, such as gelatin- or collagen-based carriers. However, it should be recalled that the choice is critical because the rigidity/stiffness of the support may have an influence on the stem cell fate (see above). On the other hand, it is evident that aggregate cultures without using carriers as an initial support would also present a solution for this specific problem.


Cell confluence in cell cultures - myoblast c2c12 in particular (Feb/01/2011 )

Hi to all. I'm a grad student and I work on cell cultures. I'd like to ask you one thing about the tecnique, I hope you can help me to understand sorry if my english is not perfect.

I work with the myoblasts cell line c2c12. I know that cells must not reach confluence becouse otherwise they begin differentiate. furthermore they must be at 60-80% confluence before passing or splitting them.

Does the term "confluence" mean that cells cover the entire surface of the plate?
How can I see when cells reach 60-80% confluence? Do you know if I can find somewhere some images about cell coltures at different grade of confluence?

Thank you very much for your precious help!

Correct, confluency is the amount of culture surface that is covered by cells. Your best bet for learning how to assess the confluency is to get an experienced person to look at your cells and tell you how confluent they are and learn from that.

You can think of it like this. 25% confluent is a quarter of the surface area covered by cells, 50% is half the area and 75% is 3/4 of the area.


Types of Animal Cell Culture

On the basis of cell growth and division, the animal cell culture is subdivided into the following two types:

Primary Cell Culture

It is defined as the cell culturing from the tissue of the host animal. The cells can be obtained directly by the mechanical method and indirectly by the enzymatic action. Once, the cells are obtained, they have to be cultured on a suitable container that must be provided with all the nutrients required for the cell division and growth. The growth of primary cells either occurs as an adherent monolayer on the solid media or as a suspension in a liquid medium.

  1. Adherent cells: These cells adhere to the solid surface and produce a cell population in the monolayer pattern. Adherent cells are sometimes called a confluent cell, in which the cells merge or contract to fill the surface area. Fibroblasts and epithelial cells are examples of adherent cells. The properties of the adherent cells include:
    • Adherent cells are anchorage-dependent.
    • Grows in a monolayer pattern.
    • Growth occurs on the solid surface or we can say on the solid media.
    • Adherent cells fill the entire surface area of the container or vessel as a monolayer.
    • Adherent cells follow the property of contract inhibition, in which the cell itself ceases the growth of some cells to maintain the synchronized state through chemical signalling. Once a monolayer is formed, the formation of new cells is inhibited by the adherent cells.
  2. Suspension cells: These are the cells that do not adhere to the surface of the medium. Suspension cells are the type of cells that float as the suspension over the liquid medium. The properties of the suspension cells include:
    • Suspension cells are anchorage-independent.
    • Floats as a suspension of cells over the liquid culture medium.
    • Growth occurs in the liquid nutrient medium.
    • Suspension cells grow much faster than the adherent cells.
    • There is a short lag phase in the suspension cells.
    • Enzyme action is not required for the dissociation of cells.

Secondary Cell Culture

It is defined as the subculturing of the primary cells, which later produce secondary cells lines. The passaging or subculturing of the primary cells result in a phenotypic and genotypic uniformity of the cell population. After the subculturing, the cell-lines will become different from the original cells. Based on the cell’s life span, the cell lines can be categorized into:

  1. Finite cell lines: Here, the cells possess a limited life span and show a limited cell division. Passaging value is less because the cells after some time lose the ability to grow or proliferate and enter into the phase of senescence or ageing.
    Example: Normal cells produce finite cell lines.
  2. Continuous cell lines: In continuous cell lines, the number of cell division and passaging value is indefinite. The passaging value is more because the continuous cells do not lose the ability to divide, i.e. these can grow and divide by an infinite number of times.
    Example: Cancerous cells produce infinite or continuous cell lines.

معالجة

The process of animal cell culture can be summarized into the following series:

  1. Tissue explant: It involves the removal of tissue from the organ.
  2. Cell extraction: It is carried out either mechanically or enzymatically. The extraction is mostly carried out by the enzyme action or by the process of trypsinization.
  3. Culturing in a nutrient medium: After that, the cells are cultured either on a solid nutrient medium or liquid nutrient medium. The primary cells form a monolayer over a solid nutrient medium, whereas appears as a cell suspension over the liquid medium.
  4. Subculturing: It is also called cell passaging. The subculturing is carried out after the formation of primary cells and it is important to continuously study or to grow the cells. This is the most important step in cell culture, which helps us to understand the cell type.

Normal cells: These cells possess a low passaging value because they lose their ability to divide after some time due to cell ageing. Therefore, the cell divides to produce definite cell lines.

Continuous cells: These cells possess a high passaging value because the cells have the ability to continuously divide. Therefore, the cell divides to produce indefinite cell lines.

Passaging value is directly proportional to the cell type and cell division.

  • For continuous cells, the passaging value increases, by which the cell division will be more.
  • For normal cells, the passaging value decreases as the cell ages, by which the cell division capacity will also decrease.

Difference Between Normal and Continuous Cells

  • The normal cell produces a monolayer, whereas the continuous cell does not.
  • The continuous cell does not follow the property of contract inhibition, while the normal cells follow.
  • A normal cell has a property to divide for definite times, whereas the continuous cell has a property to divide again and again.
  • The continuous cells possess a high passage value, whereas the normal cells possess a low passage value.
  • The capacity of dividing in the continuous cell remains the same as the first passaging, whereas the capacity of dividing decreases as a result of cell ageing in the normal cells.

Advantages

  • Animal cell culture makes the use of a low amount of reagents.
  • Serial passaging maintains the homogeneity of the cell types.
  • Provides controlled physiological conditions.
  • Provides controlled physiochemical conditions like temperature, oxygen concentration, ph etc.

سلبيات

  • Animal cell culture requires high technical skills to interpret and to regulate the animal cell culturing.
  • It is a very expensive method to carry out.

Applications

The animal cell culture provides a model to study the effects of drugs, biochemistry etc. of the cell. By animal cell culture, we can perform tissue engineering. It also helps us to identify the cancerous cell as both the normal and continuous cells can be grown in the animal cell culture.

We can also study the replication and life cycle of the virus, so it plays an important role in the field of علم الفيروسات. In animal cell culture, we can also study the effect of different drugs on different cell types, so it also helps in toxicity testing.


2 - Cell culture techniques

Cell culture is a technique that involves the isolation and maintenance in vitro of cells isolated from tissues or whole organs derived from animals, microbes or plants. In general, animal cells have more complex nutritional requirements and usually need more stringent conditions for growth and maintenance. By comparison, microbes and plants require less rigorous conditions and grow effectively with the minimum of needs. Regardless of the source of material used, practical cell culture is governed by the same general principles, requiring a sterile pure culture of cells, the need to adopt appropriate aseptic techniques and the utilisation of suitable conditions for optimal viable growth of cells.

Once established, cells in culture can be exploited in many different ways. For instance, they are ideal for studying intracellular processes including protein synthesis, signal transduction mechanisms and drug metabolism. They have also been widely used to understand the mechanisms of drug actions, cell–cell interaction and genetics. Additionally, cell culture technology has been adopted in medicine, where genetic abnormalities can be determined by chromosomal analysis of cells derived, for example, from expectant mothers. Similarly, viral infections can be assayed both qualitatively and quantitatively on isolated cells in culture. In industry, cultured cells are used routinely to test both the pharmacological and toxicological effects of pharmaceutical compounds. This technology thus provides a valuable tool to scientists, offering a user-friendly system that is relatively cheap to run and the exploitation of which avoids the legal, moral and ethical questions generally associated with animal experimentation.


شاهد الفيديو: زراعة الاعضاء وعمليات التجميل من مبحث التربية الاسلامية للصف الحادي عشر (كانون الثاني 2022).