معلومة

ما مقدار الملح [NaCl] الذي يمثل نسبة كبيرة جدًا في ترسيب الحمض النووي؟


في عمليات استخراج الحمض النووي ، ما مقدار الملح في محلول استخلاص CTAB؟ البروتوكولات تحوم حول 2.5 مولار. إذا تجاوزت هذا (على سبيل المثال 25 مولر) ، فهل ستشبع المحلول الخاص بك ، وترسب الحمض النووي في وقت مبكر جدًا؟

الخلفية: تقارب معظم بروتوكولات استخراج الحمض النووي ما يلي:

  1. ~ التحلل الجسدي
  2. ~ التحلل الكيميائي (المنظفات)
  3. فصل الطور (خطوة الفينول - كلوروفورم - أيزو أميل)
  4. راسب ، جاف

المتغيرات كثيرة ، ولكن السمة الشائعة للخطوات 1 2 هي تضمين CTAB و NaCl في المخزن المؤقت للاستخراج - تساعد المنظفات والأملاح على تمزق غشاء الخلية ، ولكن (ربما الأهم) مركبات CTAB 'الانتقائية' وترسب الشوائب العضوية (السكريات والبروتينات ...) بينما تترك DNA / RNA في محلول.

لكي ينجح ذلك ، يجب تحييد الشحنة السلبية الصافية لفوسفات الحمض النووي (PO4-) العمود الفقري للسماح للحمض النووي بالبقاء في المحلول: تنجذب أيونات الصوديوم (Na +) إلى المجموعات العادية (PO4-) ، بينما تكون أكثر انتظامًا ترتبط الشحنات المتباعدة * في البروتينات وما إلى ذلك بإحكام بـ CTAB ، و "تسقط" من المحلول: تحافظ على الحمض النووي الخاص بك في الطور السائل وتنقيته ، مع غسل الملح الزائد في النهاية باستخدام عمليات غسل متكررة من EtOH بنسبة 70٪.

هل سيزيد Na + / Cl- بشكل فعال من الخصائص "الانتقائية" لـ CTAB؟ يتم استخدام "تمليح" الحمض النووي من المحلول (تعطيل قشرة الذوبان) في الخطوة 4 ، غالبًا مع أسيتات الصوديوم و 2-بروبانول: ما مقدار الملح الذي يمكن استخدامه في الخطوات 1 2 قبل ترسيب الحمض النووي مع الآخرين المواد العضوية؟ هل هناك اعتبارات أخرى (مثل الأملاح والمذيبات العضوية في الخطوة 3)؟

أول وصف وجدته لهذا هو Zhou (1996) ، لكن البروتوكول الجيد حقًا هو Wilson (2001).

*: محتمل؟


قد يؤدي الإفراط في تناول الملح إلى تلف الأوعية الدموية ويؤدي إلى ارتفاع ضغط الدم

قد يؤدي تناول نظام غذائي غني بالملح لعدة سنوات إلى تلف الأوعية الدموية - مما يزيد من خطر الإصابة بارتفاع ضغط الدم ، وفقًا لبحث نُشر في مجلة جمعية القلب الأمريكية. الدوران.

الأشخاص الذين يعانون من هذا النوع من تلف الأوعية الدموية والذين يتبعون نظامًا غذائيًا عالي الملح هم أكثر عرضة للإصابة بارتفاع ضغط الدم أو ارتفاع ضغط الدم. يلمح هذا البحث إلى وجود "حلقة تضخيم الصوديوم" حيث يؤدي تناول الكثير من الملح لفترة طويلة إلى إتلاف الأوعية الدموية ، مما يؤدي إلى فرصة أكبر للإصابة بارتفاع ضغط الدم إذا استمر النظام الغذائي عالي الملح.

لم يقم الباحثون بتقييم علاقة السبب والنتيجة بين تناول الملح وارتفاع ضغط الدم. لكن نتائج الدراسة "تضيف إلى الدليل المعقول على أن اتباع نظام غذائي غني بالملح يرتبط ارتباطًا وثيقًا بارتفاع ضغط الدم" ، كما قال جون فورمان ، العضو المنتدب ، المؤلف الرئيسي للدراسة وطبيب الكلى في مستشفى بريغهام والنساء وكلية الطب بجامعة هارفارد في بوسطن. ، كتلة.

وقال فورمان: "بالإضافة إلى ذلك ، تعزز هذه الدراسة المبادئ التوجيهية التي تدعمها جمعية القلب الأمريكية وغيرها من المنظمات المهنية التي توصي بتقليل استهلاك الملح لتقليل مخاطر الإصابة بارتفاع ضغط الدم".

جرام واحد من الصوديوم يساوي 2.5 جرام من ملح الطعام (كلوريد الصوديوم).

أجرى الباحثون دراسة قائمة على الملاحظة (PREVEND) حيث تتبعوا كمية الصوديوم التي تناولها 5556 رجلاً وامرأة من عموم سكان جرونينجن بهولندا. تم تقييم مدخول الصوديوم من خلال جمع عينات بول متعددة على مدار 24 ساعة ، والتي تعتبر الطريقة المثلى لقياس مدخول الصوديوم.

حلل الباحثون العلاقة بين استهلاك الصوديوم ومستويات حمض البوليك والألبومين في الدم - وكلاهما علامات لتلف الأوعية الدموية - في المشاركين الذين لا يتناولون أدوية ارتفاع ضغط الدم.

خلال متابعة متوسطها 6.4 سنوات ، تم إجراء 878 تشخيصًا جديدًا لارتفاع ضغط الدم.

ارتبط تناول كميات كبيرة من الصوديوم بزيادة مستويات حمض البوليك والألبومين بمرور الوقت. وجد الباحثون أنه كلما ارتفعت مستويات هذه العلامات ، زاد خطر الإصابة بارتفاع ضغط الدم إذا كان تناول الملح الغذائي مرتفعًا. مقارنة بالمشاركين الذين تناولوا أقل كمية من الصوديوم (حوالي 2200 ملليجرام في اليوم) ، فإن أولئك الذين تناولوا أكثر (حوالي 6200 مجم / يوم) كانوا أكثر عرضة بنسبة 21٪ للإصابة بارتفاع ضغط الدم. ومع ذلك ، فإن أولئك الذين لديهم مستويات عالية من حمض اليوريك وتناولوا الكثير من الملح كانوا أكثر عرضة بنسبة 32 في المائة للإصابة بارتفاع ضغط الدم ، في حين أن أولئك الذين لديهم مستويات عالية من الألبومين في البول وأعلى تناول للملح كانوا أكثر عرضة بنسبة 86 في المائة للإصابة بارتفاع ضغط الدم.

يُعتقد أن النظام الغذائي الغني بالملح مسؤول عن 20 في المائة إلى 40 في المائة من جميع حالات ارتفاع ضغط الدم في الولايات المتحدة.

نظرًا لأن الدراسة شملت القوقازيين الأوروبيين فقط ، يجب تكرار النتائج لدى ذوي الأصول الأسبانية والأمريكيين من أصل أفريقي وغيرهم في الولايات المتحدة ، ومع ذلك ، فقد وجد باحثون آخرون صلة بين اتباع نظام غذائي عالي الملح وارتفاع ضغط الدم لدى هؤلاء السكان الآخرين ، وفقًا لما قاله فورمان. .

المؤلفون المشاركون هم لينيكي شيفين ، دكتوراه في الطب بول دي يونج ، دكتوراه في الطب ستيفان باكر ، دكتوراه. غاري كورهان ، (دكتور في الطب) ورون جانسيفورت ، (دكتور في الطب)

قامت جمعية القلب الأمريكية والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى ومؤسسة الكلى الهولندية بتمويل الدراسة.


يمتص الملح ، وتنتفخ الخلايا

يتحرك الماء في الخلايا نحو أعلى تركيز للملح. إذا كان هناك ملح في الخلية أكثر من خارجه ، فسوف ينتقل الماء عبر الغشاء إلى الخلية ، مما يؤدي إلى زيادة حجمها ، وتضخمها عندما يملأ الماء الخلية في ضرورة أن تتحد مع الملح. إذا تم وضع تركيز أعلى من الملح خارج غشاء الخلية ، فإن الماء سيترك الخلية لتلتصق به. يؤدي فقدان الماء من هذه الحركة إلى تقلص الخلايا النباتية وذبولها. هذا هو السبب في أن الملح يمكن أن يقتل النباتات لأنه يرشح الماء من الخلايا. كما أن حركة الماء لترك خلية حيوانية ستؤدي أيضًا إلى تقلص هذه الخلايا وتسبب الجفاف. لهذا السبب يمكن أن يموت الإنسان من الجفاف إذا شرب كمية كافية من ماء البحر.

بوني كرو هي أم لمراهقين وهي معلمة ومؤلفة كتب ومناهج ومقالات للأطفال حول قواعد اللغة الإنجليزية ، والأدب ، والتكنولوجيا ، والفن ، والأبوة والأمومة ، وأدلة المهنة لطلاب المدارس الثانوية. هي مديرة سابقة لـ AOL Parenting ، وعضو في SCBWI ، وخريجة من جامعة كاليفورنيا ، بيركلي.


ترسيب الحمض النووي من استخراج CTAB: هل حصلت على طبقة غائمة بعد إضافة الإيثانول ، ولكن بدون الحبيبات؟

عادةً ما أقوم باستخراج الحمض النووي من الخلايا الحيوانية ، لكن علي الآن استخراج الحمض النووي من النباتات. لقد أجريت عملية استخراج CTAB ، على النحو الذي اقترحته Google. وصلت إلى جزء ترسيب الحمض النووي. أضفت أسيتات الصوديوم والإيثانول البارد ، وظهرت طبقة غائمة تمامًا مثل ما جربته من قبل في مستخلصات الحمض النووي من الحيوانات. ومع ذلك ، لم تتشكل أي حبيبات DNA بعد الطرد المركزي. ومع ذلك ، كان لا يزال هناك طبقة غائمة في الأنبوب. أعتقد أن الحمض النووي لا يزال في تلك الطبقة الغائمة. هل لديكم أي فكرة يا رفاق لماذا لا يترسب الحمض النووي & # x27t؟

هل قمت باستخراج الكلوروفروم: IAA قبل الترسيب؟ كلما حصلت على أي من الواجهة في المادة الطافية ، لا تتشكل الحبيبات.

& # x27ll تتضمن بروتوكول CTAB I & # x27m الذي يستخدم لـ اللبخ يترك أدناه. استخدم طالب جامعي كنت أعمل معه هذا البروتوكول لاستخراج حجم أكبر بمقدار 10 أضعاف في المرة الواحدة مما أفعله ، وحصل على نتيجة مماثلة لنتيجة (طبقة غائمة بدلاً من الحبيبات ، بغض النظر عن المدة التي قام فيها بالطرد المركزي). قلنا له للتو أن يحصل على أكبر قدر ممكن من الأيزوبروبانول ، ثم تابع غسل الإيثانول كالمعتاد.

☐ ضبط الحاضنة على 65 درجة مئوية. ضع 100٪ أيزوبروبانول في الفريزر.

ضع قطعة من الورقة في الأنبوب مع 2x حبات معدنية. اكسر الورقة بالملاقط أو المقص.

☐ طحن بسرعة 30 لفة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة.

☐ أضف 600 ميكروليتر من عازل CTAB في درجة حرارة الغرفة. دوامة.

كرر الطحن مرتين أخريين ، مع طرق ودوامة الأنبوب بينهما لإخراج جميع المواد الورقية.

☐ احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. دوامة كل 15 دقيقة.

☐ جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقتين.

☐ انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد (حوالي 450 ميكرولتر).

أضف 100 ميكروليتر من 24: 1 كلوروفورم: كحول أيزو أميل.

☐ دوامة تماما. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.

☐ دوامة مرة أخرى ، ثم جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقتين.

☐ نقل المادة الطافية (المرحلة العليا فقط) إلى أنبوب جديد (حوالي 400 ميكرولتر).

☐ كرر الكلوروفورم: استخلاص الأيزو أميل (الخطوات الأربع أعلاه - حجم طاف حوالي 300 ميكرولتر).

☐ أضف 1.5 حجمًا من -20 درجة مئوية أيزوبروبانول (حوالي 450 ميكرولتر).

☐ احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

☐ جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق. سوف تتشكل بيليه. إذا تشكلت طبقة سائلة ثقيلة ، فقد تم ترحيل بعض C: IAA.

☐ إزالة المادة الطافية ، مع الاحتفاظ بالمرحلة السفلية.

أضف 600 ميكروليتر 70٪ إيثانول في درجة حرارة الغرفة.

☐ اعكس اتجاه إخراج الحبيبات من قاع الأنبوب. احتضان عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (أو لمدة 2 ساعة على الأقل).


ترسيب مكتبات الحمض النووي PEG - كيف يعمل Ampure أو SPRIselect

أحد الأسئلة التي تم طرحها علينا ، وهو أحد الأسئلة التي يتم طرحها بشكل متكرر على موفري خدمة NGS ، هو كيف يقوم PEG من حيث المبدأ بتعجيل الحمض النووي في الجيل التالي من تنظيف إعداد مكتبة التسلسل؟ عادةً ما نسمع السؤال المطروح على النحو التالي: كيف تختار خرزات Ampure XP أو SPRI من Agencourt ترسيب الحمض النووي؟ تتعلق الإجابة بالخصائص الكيميائية للحمض النووي والبولي إيثيلين جلايكول (PEG) والخرز المستخدم والماء. البوليسترين - حبيبات المغنتيت (Ampure) مغلفة بطبقة من مجموعات الكربوكسيل سالبة الشحنة. إن العمود الفقري للفوسفات عالي الشحن في الحمض النووي يجعله قطبيًا ، مما يسمح له بالذوبان في الماء (قطبي أيضًا). عندما ربط [H- (O-CH2-CH2)ن-OH] يضاف إلى محلول الحمض النووي في حالة التشبع ، ويشكل الحمض النووي ملفات عشوائية كبيرة. تؤدي إضافة هذا الجزيء المحب للماء مع التركيز الصحيح للملح (Na +) إلى تراكم الحمض النووي وترسيب المحلول من نقص المحلول (1 ، 2). الكثير من الملح وسيكون لديك الكثير من الحمض النووي المالح ، والقليل جدًا سيؤدي إلى ضعف الانتعاش. تحمي أيونات Na + العمود الفقري للفوسفات السالب مما يتسبب في التصاق الحمض النووي ببعضه البعض وعلى أي شيء آخر في الجوار (بما في ذلك الخرز الكربوكسيل). بمجرد أن تصبح جاهزًا لاستخراج الحمض النووي الخاص بك وإعادته إلى المحلول (بعد الانتهاء من اختيار الحجم أو إزالة الإنزيمات والنيوكليوتيدات ، وما إلى ذلك) ، تتم إضافة محلول مائي مرة أخرى (TE أو الماء) لترطيب الحمض النووي بالكامل و نقله من الحالة المجمعة إلى الحل. تقوم الشحنة السالبة لخرز الكربوكسيل الآن بطرد الحمض النووي ، مما يسمح للمستخدم باستخراجه في المادة الطافية. يمكن أن يساعد تغيير كمية PEG وتركيز الملح في تحديد حجم الحمض النووي (2). هذه طريقة شائعة في إعداد مكتبة NGS حيث يهتم المستخدم بتحديد حجم جزء من حجم معين. غالبًا ما تستخدم لاستبدال خطوات الهلام في إعداد مكتبة NGS. هناك بالفعل ثروة من الأدبيات حول شروط تحديد حجم الحمض النووي ، ما عليك سوى إجراء بحث بسيط على google. المقالة الأولى التي وجدناها والتي تصف هذا التحديد مذكورة أدناه (3).

منذ هذا المنشور في 7 مايو 2014 ، هناك العديد من خرزات الاختيار ذات الحجم الشبيه بالأمبير في السوق:


دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها لاستخراج الحمض النووي الجيني وتنقية أمبير (NEB # T3010)

هل تحتاج إلى بعض المساعدة في تنقية الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي الجينومي من مونارك (NEB # T3010)؟ & rsquore هنا للمساعدة. يوضح دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها أدناه بعض نقاط الألم الأكثر شيوعًا التي يواجهها العلماء أثناء تنقية gDNA. يمكنك أيضًا العثور على إرشادات حول اختيار كميات الإدخال المناسبة في موردنا عبر الإنترنت ، واختيار كميات الإدخال لمجموعة Monarch Genomic DNA Purification Kit. هل ما زلت تواجه مشكلة؟ اتصل بالدعم الفني في أي وقت.

  • قم بإذابة كريات الخلية ببطء على الجليد ونفض الأنبوب عدة مرات لتحرير الحبيبات من قاع الأنبوب. تأكد من استخدام PBS البارد لإعادة التعليق ، وأعد التعليق بلطف عن طريق الأنابيب لأعلى ولأسفل 5 و ndash10 مرات حتى يتم الحصول على تعليق خلية عكر بشكل موحد ويتم إذابة الحبيبات تمامًا.
  • أضف بروتيناز K و RNase A لأخذ عينات وخلط جيدًا قبل إضافة مخزن تحلل الخلية ، وإلا فإن اللزوجة العالية للمحلول ستعيق الخلط المناسب للأنزيمات.
  • احتفظ بعينات الدم المجمدة وأضف بروتيناز K و RNase A و Blood Lysis Buffer مباشرة إلى العينات المجمدة. ابدأ التحلل على الفور واترك العينات تذوب عند حضانة التحلل.
  • يجب ألا يزيد عمر الدم الكامل الطازج (غير المجمد) عن أسبوع. ستظهر العينات القديمة كمية تدريجية من تدهور الحمض النووي وفقدان المحصول.
  • قد يؤدي هضم عينات الدم الكامل من بعض الأنواع الحيوانية التي تحتوي على نسبة عالية من الهيموجلوبين (مثل خنزير غينيا) إلى تراكم معقدات الهيموجلوبين غير القابلة للذوبان التي تلوث الغشاء وتسده ، مما يؤدي إلى انخفاض المحصول والنقاء. قلل وقت تحلل البروتين K من 5 إلى 3 دقائق لمنع تكوين هذه الرواسب.
  • قطع مواد البدء إلى أصغر قطع ممكنة أو طحنها بالنيتروجين السائل. في قطع الأنسجة الكبيرة ، تقوم نوكليازات بتدمير الحمض النووي قبل أن يتمكن بروتيناز K من تحلل الأنسجة وإطلاق الحمض النووي.
  • يؤدي هضم البروتين K للأنسجة الليفية (مثل العضلات والقلب والجلد ومشابك الأذن) وأنسجة المخ وجميع الأنسجة المستقرة لاحقًا إلى إطلاق ألياف بروتينية صغيرة غير قابلة للهضم والتي غالبًا ما تعطي مظهرًا متعكرًا. سوف تمنع هذه الألياف مواقع الربط لغشاء السيليكا مما يقلل العائد ويسبب تلوث البروتين. لإزالة الألياف ، جهاز الطرد المركزي المحللة بأقصى سرعة لمدة 3 دقائق ، كما هو مبين في البروتوكول. لمقاطع الأذن وأنسجة المخ ، لا تستخدم أكثر من 12 & ndash15 mg من مادة الإدخال ، وإلا فلن تكتمل إزالة الألياف.
  • العينات التي يتم تخزينها لفترات طويلة في درجة حرارة الغرفة ، 4 & deg C أو -20 & deg C ستظهر تدهور وفقدان محتوى gDNA بمرور الوقت. عينات الأنسجة المجمدة مع النيتروجين السائل أو الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية. بدلاً من ذلك ، استخدم كواشف استقرار لحماية gDNA وتمكين التخزين لفترات أطول من الوقت عند 4 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية.
  • تحتوي أنسجة الأعضاء مثل البنكرياس والأمعاء والكلى والكبد على كميات كبيرة من نوكليازات. يجب معالجتها بعناية فائقة وتخزينها بشكل صحيح لمنع تدهور الحمض النووي. يُحفظ مجمداً وعلى الثلج أثناء تحضير العينة. ارجع إلى البروتوكول لمعرفة الكمية الموصى بها من مادة البداية و Proteinase K لاستخدامها.
  • بعض أنسجة الأعضاء (مثل الطحال والكلى والكبد) غنية جدًا بالحمض النووي الجيني. ستؤدي محاولة معالجة الكميات الأكبر من كميات المدخلات الموصى بها إلى تكوين سحب من gDNA المتشابك طويل الشظية التي لا يمكن التخلّص منها من غشاء السيليكا. قلل كمية المواد المدخلة للحصول على عائد أعلى.
  • يتم هضم معظم العينات باستخدام 10 & microl Proteinase K ، ولكن بالنسبة لمقاطع الدماغ والكلى والأذن ، فإن استخدام 3 & microl سيوفر عوائد أفضل.
  • العينات التي يتم تخزينها لفترات طويلة في درجة حرارة الغرفة ، 4 & deg C أو -20 & deg C ستظهر تدهور وفقدان محتوى gDNA بمرور الوقت. عينات الأنسجة المتجمدة بالصدمة مع النيتروجين السائل أو الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية. بدلاً من ذلك ، استخدم كواشف استقرار مثل RNAlater لحماية gDNA وتمكين التخزين لفترات أطول من الوقت عند 4 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية.
  • قطع مواد البدء إلى أصغر قطع ممكنة أو طحنها بالنيتروجين السائل. في قطع الأنسجة الكبيرة ، تعمل النيوكليزات على تحلل الحمض النووي قبل أن يتمكن بروتيناز K من تحلل الأنسجة وإطلاق الحمض النووي.
  • تحتوي أنسجة الأعضاء مثل البنكرياس والأمعاء والكلى والكبد على نسبة عالية جدًا من نوكلياز. يجب معالجتها بحذر شديد (انظر & lsquo ؛ لم يتم تخزين العينة بشكل صحيح & القسم rsquo أعلاه) لمنع تدهور الحمض النووي. يُحفظ مجمداً وعلى الثلج أثناء تحضير العينة.
  • يجب ألا يزيد عمر الدم الكامل الطازج (غير المجمد) عن أسبوع. ستظهر العينات القديمة كمية تدريجية من تدهور الحمض النووي وفقدان المحصول.
  • يؤدي ذوبان عينات الدم المجمدة إلى إطلاق الدناز ، مما يتسبب في تدهورها. الاحتفاظ بعينات الدم المجمدة مجمدة وإضافة الإنزيمات ومحلول التحلل مباشرة إلى العينات المجمدة. ابدأ التحلل على الفور واترك العينات تذوب عند حضانة التحلل.

تم نقل ملح Guanidine إلى الشطف:

يحتوي المخزن المؤقت للربط على ثيوسيانات الغوانيدين (GTC) ، والذي يُظهر امتصاصًا قويًا جدًا عند 220 و ndash230 نانومتر.

الطريقة الأكثر شيوعًا لإدخال الملح في الشطف هو السماح لمزيج العازلة / المحللة بالاتصال بمنطقة العمود العلوي.

    عند نقل مزيج المخزن المؤقت المحللة / الربط ، تجنب لمس منطقة العمود العلوي بطرف الماصة دائمًا الماصة بعناية على غشاء السيليكا.


تكيف الإشريكية القولونية ATCC 8739 إلى 11٪ كلوريد الصوديوم

الإشريكية القولونية (بكتريا قولونية) هو ميكروب غير مهلوف ويستخدم للإشارة إلى التلوث البرازي. الملح (كلوريد الصوديوم ، NaCl) هو مضاف غذائي شائع ويستخدم في المواد الحافظة لمواجهة نمو الميكروبات. تأثير كيف بكتريا قولونية يتفاعل مع الملح الموجود في النظام الغذائي للإنسان غير واضح. وبالتالي ، من المهم التحقيق في هذه العلاقة. من أجل التكيف والبقاء على قيد الحياة مع التغيرات في البيئة ، بكتريا قولونية قد يخضع للتطهير. في هذه الدراسة ، لاحظنا التغيرات الجينية وحركية النمو بكتريا قولونية ATCC 8739 تحت 3٪ -11٪ كلوريد الصوديوم على 80 مقطعًا. نتائجنا تشير إلى ذلك بكتريا قولونية تتكيف مع 1٪ زيادة في كلوريد الصوديوم كل شهر مع تكيف ناجح مع 11٪ كلوريد الصوديوم. أظهر تلطيخ الجرام و PCR / RFLP أن الثقافات سالبة الجرام وأن ملامح الحمض النووي لجميع التكرارات الأربعة متشابهة ، مما يشير إلى أن الثقافات لم تكن ملوثة.

1 المقدمة

الإشريكية القولونية هو مثال كتابي للبكتيريا غير المهلوفة وهو مؤشر حي لتلوث المياه بالبراز ه. القولونية هو مؤشر أكثر اتساقًا للإصابة بأمراض الجهاز الهضمي من المؤشرات البكتيرية الأخرى في الماء [1]. هذا يؤكد بيرتون وآخرون. [2] الذي اقترح ذلك ه. القولونية كان مؤشرًا مناسبًا لـ السالمونيلا المعوية السيروفار نيوبورت في رواسب المياه العذبة المختلفة ولوحظ أنها تعيش لفترة طويلة أو أطول من السالمونيلا spp. ، وبالتالي ، تلبية متطلباتها كمؤشر للبكتيريا المسببة للأمراض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بقاء ه. القولونية مستقل عن كمية المادة العضوية [2]. هذا يشير إلى أن ه. القولونية هو مؤشر مناسب لأنه يمكنه البقاء على قيد الحياة في وسائط غنية بالعناصر الغذائية المختلفة.

الدراسات السابقة [3-6] حول التكيف وتطور بكتريا قولونية أجريت باستخدام المضادات الحيوية والأدوية. ومع ذلك ، فإن المضافات الغذائية الشائعة مثل الملح ، والتي تستخدم للحفاظ على الغذاء وتثبيط الكائنات الحية الدقيقة ، ليست مفهومة بشكل أقل من حيث بكتريا قولونيةعلى الرغم من أن الدراسات الحديثة [7 ، 8] اقترحت ذلك بكتريا قولونية قادر على التكيف مع المضافات الغذائية على الثقافة الممتدة. هذا يشير إلى أن بكتريا قولونية قد تكون قادرة على التكيف مع تركيزات أعلى من المضافات الغذائية ولكن هذا لم تتم دراسته بعد. أظهر دودوروف [9] أن العدد القابل للتطبيق لـ ه. القولونية تم تربيتها سابقًا في وسط ماء عذب عادي ثم نقلها إلى محاليل مغذية ملحية بقيت عند تركيز ثابت يصل إلى 7٪ من كلوريد الصوديوم. انخفض العدد القابل للتطبيق بشكل تدريجي مع زيادة أخرى في التركيز مما يشير إلى ذلك بكتريا قولونية غير مهلوفيل و 7٪ كلوريد الصوديوم مضاد للجراثيم. ذكر هرينوفيتش وإيفانكوفيتش [10] أن نمو ه. القولونية هو الأمثل أقل من 5٪ كلوريد الصوديوم. تكيف بكتريا قولونية قد يشير الملح إلى مقاومة مماثلة للمواد الحافظة الأخرى وقد يتم التقليل من قدرته على النمو في البيئة المالحة.

تهدف هذه الدراسة إلى ملاحظة التكيف التدريجي لـ بكتريا قولونية ATCC 8739 ، سلالة متسلسلة بالكامل ، مزروعة في وسط مكمل بكلوريد الصوديوم حتى 8 ٪ كلوريد الصوديوم على 80 مقطعًا. نتائجنا تشير إلى ذلك بكتريا قولونية تتكيف مع 1٪ زيادة في كلوريد الصوديوم كل شهر مع تكيف ناجح مع 11٪ كلوريد الصوديوم. أظهر تلطيخ الجرام وبصمات الحمض النووي عن طريق تعدد الأشكال لطول جزء من PCR / تقييد في الممر 72 أن الثقافات سلبية الجرام وأن ملامح PCR-RFLP لجميع التكرارات الأربعة متشابهة. هذا يشير إلى أن الثقافات لم تكن ملوثة المكورات العنقودية الذهبية، وهي موجبة الجرام والأكثر احتمالاً أنها ملوثة بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية هو متعايش يتحمل الملح ويوجد على جلد الإنسان.

2. المنهجية

أجريت تجربة الثقافة الرئيسية مع لقاح أولي من

بكتريا قولونية خلايا ATCC 8739 من الممر 70 من Lee et al. [8] كأول ممر في كل من 4 مكررات من 10 مل من مرق المغذيات 1X بتركيز ثابت من كلوريد الصوديوم (نشير إلى هذا باسم وسط التكيف) ويتم تربيته في أنابيب مخروطية بسعة 15 مل بإحكام. تم إجراء الثقافة الفرعية باستخدام 1 ٪ من الثقافة السابقة في كل يوم فردي ما عدا يوم الأحد (3 ثقافة فرعية في الأسبوع). كان تركيز كلوريد الصوديوم للممرات كما يلي: الممرات من 1 إلى 15 عند 3٪ كلوريد الصوديوم ، الممرات من 16 إلى 31 عند 4٪ كلوريد الصوديوم ، الممرات من 32 إلى 39 عند 4.5٪ كلوريد الصوديوم ، الممرات 40 إلى 50 عند 5٪ كلوريد الصوديوم ، الممرات من 51 إلى 62 عند 6٪ كلوريد الصوديوم ، والممرات من 63 إلى 74 بمعدل 7٪ كلوريد الصوديوم ، والممرات من 75 إلى 80 بنسبة 8٪ كلوريد الصوديوم.

كانت مراقبة التلوث على النحو التالي. تم رصد الثقافات بشكل روتيني للتلوث باستخدام تلوين غرام وبصمة الحمض النووي. تم إجراء بصمة الحمض النووي بواسطة تعدد أشكال طول جزء التقييد / PCR باستخدام الإجراء في دراسة تكيف سابقة مماثلة [8] حيث تم استخدام كل من البادئات الثلاثة (التمهيدي 5 ، CgCgCTggC Primer 6 ، gCTggCggC و Primer 7 ، CAggCggCg) كلاهما للأمام وعكس الاشعال. تم إجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (Hybaid Limited ، PCR express) في ظل حالة التدوير للتمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق 35 دورة تضخيم عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 27 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 72 درجة مئوية. لمدة 3 دقائق متبوعًا بالتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل الهضم بوحدة واحدة من نوكلياز تقييد TaqI لمدة 16 ساعة عند 65 درجة مئوية قبل التحليل على 2 ٪ (وزن / حجم) هلام agarose مع 1X GelRed.

كانت مراقبة المرور على النحو التالي. تمت مراقبة ظروف النمو لكل ممر بالكثافة الضوئية بطول موجة 600 نانومتر (قراءات OD600) باستخدام مقياس الطيف الضوئي Shimadzu UV-1601 للأشعة فوق البنفسجية / الضوء. تم أخذ قراءة OD لكل تكرار قبل كل ثقافة فرعية لتقدير كثافة اللقاح. تم أخذ قراءات OD 600 في اليومين الخامس والسابع بعد التلقيح لتقدير كثافة الخلية في المرحلة الثابتة. في كل فقرة ثالثة ، 10

L من بكتريا قولونية تم تلقيح الثقافة من كل مكرر (A ، B ، C ، D) في 1 مل من مرق المغذيات 1X وقراءات OD 600 مأخوذة على فترات تصل إلى 360 دقيقة ويمكن استخدامها لتقدير وقت التوليد.

للثقافة MIC ، 1٪ من بكتريا قولونية تم تلقيح الثقافة من كل مكررات (A ، B ، C ، D) في 1 مل من مرق مغذي 1X مكمل بـ 0 ٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم ، 1 ٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم ، 3 ٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم ، 5٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم ، 7٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم ، 9٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم ، و 11٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم بتركيزات ملح مختلفة. بالنسبة للمستعمرة MIC ، كل عينة من بكتريا قولونية تم وضع خطوط على أجار المغذيات واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. تم أخذ عشر مستعمرات بشكل عشوائي من كل طبق وتم تلقيحها في 1 مل من مرق المغذيات 1X وحضنت طوال الليل عند 37 درجة مئوية قبل التلقيح في 1 مل من مرق مغذي 1X مكمل بتركيزات ملح مختلفة. تم تحضين الوسط الملقح لمدة 21-23 ساعة عند 37 درجة مئوية قبل أخذ قراءات OD.

3. وصف مجموعة البيانات

تتكون مجموعة البيانات المرتبطة بورقة مجموعة البيانات هذه من 5 عناصر موصوفة على النحو التالي.

عنصر مجموعة البيانات 1 (الجدول). قراءات OD لكل تكرار مأخوذة في يوم الثقافة الفرعية التالية والتي يمكن استخدامها لتقدير كثافة اللقاح لكل ممر وعدد الأجيال بين كل ثقافة. الجدول في تنسيق طويل حيث يحتوي كل صف على سمة بيانات مقاسة واحدة فقط. في هذه الحالة ، ستكون البيانات المقاسة هي قراءات OD. السمات الأخرى هي واصفات لخاصية البيانات المقاسة. يتعارض هذا مع التنسيق العريض حيث يتم إعطاء الواصفات لقراءة OD600 معينة كتسميات الصفوف والأعمدة. يحتوي الجدول على 3 سمات فقط: Passage و Replicate و OD600 القراءة التي تشير إلى رقم المرور ، والنسخ المتماثلة المسمى من "A" إلى "D" ، وقياس OD600 ، على التوالي.

  • العمود 1: ممر
  • العمود 2: استنساخ
  • العمود 3: القراءة OD600

عنصر مجموعة البيانات 2 (الجدول). قراءات OD لكل تكرار مأخوذة في اليومين الخامس والسابع بعد التلقيح لتقدير كثافة خلية المرحلة الثابتة. الجدول في تنسيق طويل حيث يحتوي كل صف على سمة بيانات مقاسة واحدة فقط. في هذه الحالة ، ستكون البيانات المقاسة هي قراءات OD. السمات الأخرى هي واصفات لخاصية البيانات المقاسة. يتعارض هذا مع التنسيق العريض حيث يتم إعطاء الواصفات لقراءة OD600 معينة كتسميات الصفوف والأعمدة. يحتوي الجدول على 4 سمات: Passage ، Replicate ، Day ، OD600 القراءة التي تشير إلى رقم المقطع ، التكرارات المسمى من "A" إلى "D" ، سواء تم إجراء قراءة OD في اليوم الخامس أو السابع بعد التلقيح ، و OD600 القياس ، على التوالي.

  • العمود 1: ممر
  • العمود 2: استنساخ
  • العمود 3: يوم
  • العمود 4: القراءة OD600

عنصر مجموعة البيانات 3 (الجدول). قراءات OD600 المأخوذة عند التلقيح (الوقت صفر أو صفر دقيقة) ، 2 ساعة بعد التلقيح ، وعلى فترات منتظمة بعد الساعة الثانية. يمكن استخدام هذه البيانات لتقدير وقت التوليد. الجدول في تنسيق طويل حيث يحتوي كل صف على سمة بيانات مقاسة واحدة فقط. في هذه الحالة ، ستكون البيانات المقاسة هي قراءات OD. السمات الأخرى هي واصفات لخاصية البيانات المقاسة. يتعارض هذا مع التنسيق العريض حيث يتم إعطاء الواصفات لقراءة OD600 معينة كتسميات الصفوف والأعمدة. يحتوي الجدول على 4 سمات: المرور ، والنسخ المتماثل ، والدقائق ، وقراءة OD600 التي تشير إلى رقم المقطع ، والنسخ المكررة المسمى من "A" إلى "D" ، ومقدار الوقت بالدقائق بعد التلقيح عند أخذ قراءات OD600 ، و OD600 القياس ، على التوالي.

  • العمود 1: ممر
  • العمود 2: استنساخ
  • العمود 3: الدقائق
  • العمود 4: القراءة OD600

عنصر مجموعة البيانات 4 (جدول). قراءات OD600 من تجربة MIC لكل تكرار. الجدول في تنسيق طويل حيث يحتوي كل صف على سمة بيانات مقاسة واحدة فقط. في هذه الحالة ، ستكون البيانات المقاسة هي قراءات OD. السمات الأخرى هي واصفات لخاصية البيانات المقاسة. يتعارض هذا مع التنسيق العريض حيث يتم إعطاء الواصفات لقراءة OD600 معينة كتسميات الصفوف والأعمدة. يحتوي الجدول على 4 سمات: Passage ، Replicate ، [NaCl] ، و OD600 القراءة التي تشير إلى رقم المرور ، والنسخ المكررة المسمى من "A" إلى "D" ، وتركيز NaCl لتقدير MIC ، وقياس OD600 ، على التوالي (انظر يحتوي الجدول 1 على بيانات مكررة مقدمة بتنسيق واسع لسهولة الرجوع إليها).

  • العمود 1: ممر
  • العمود 2: استنساخ
  • العمود 3: [كلوريد الصوديوم]
  • العمود 4: القراءة OD600

عنصر مجموعة البيانات 5 (الجدول). قراءات OD 600 من تجربة MIC لكل مستعمرة حيث تم اختيار 10 مستعمرات عشوائية لكل تكرار (تم اختيار إجمالي 40 مستعمرة) بعد عزل مستعمرة واحدة من كل من النسخ المتماثلة الأربعة. في هذه الحالة ، ستكون البيانات المقاسة هي قراءات OD. السمات الأخرى هي واصفات لخاصية البيانات المقاسة. يتعارض هذا مع التنسيق العريض حيث يتم إعطاء الواصفات لقراءة OD600 معينة كتسميات الصفوف والأعمدة. يحتوي الجدول على 5 سمات: Passage و Replicate و Colony و [NaCl] و OD600 القراءة التي تدل على رقم المقطع ، والنسخ المكررة المسمى من "A" إلى "D" ، والمستعمرة في أبجديتين حيث تشير الأبجدية الأولى إلى التكرار و تشير الأبجدية الثانية إلى المستعمرة وتركيز كلوريد الصوديوم لتقدير MIC وقياس OD600 على التوالي. على سبيل المثال ، المستعمرة المسماة "DA" تمثل مستعمرة "A" من النسخ المتماثل "D" (انظر الجداول 2 و 3 و 4 التي تحتوي على بيانات مستعمرة MIC المعطاة بتنسيق واسع لسهولة الرجوع إليها).

  • العمود 1: ممر
  • العمود 2: استنساخ
  • العمود 3: مستعمرة
  • العمود 4: [كلوريد الصوديوم]
  • العمود 5: القراءة OD600

4. ملاحظات ختامية

أظهرت نتائج MIC الخاصة بنا زيادة في قراءات OD من 11٪ (وزن / حجم) وسائط المغذيات المكملة بكلوريد الصوديوم بعد مرور 60 (الشكل 1) مما يشير إلى ذلك ه. القولونية تكيفت مع 11٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم. تم التحقق من ذلك أيضًا بواسطة MIC في المستعمرات المختارة عشوائيًا في الممر 72 (الجدول 4). وبالتالي ، توفر هذه الدراسة مجموعة من البيانات التي يمكن استخدامها كمعيار لدراسات التكيف الأخرى. أظهر تلطيخ الجرام و PCR-RFLP استنادًا إلى الدراسات السابقة [7 ، 8] في الممر 72 (الشكل 2) أن الثقافات سالبة الجرام وأن ملامح PCR-RFLP لجميع التكرارات الأربعة متشابهة. هذا يشير إلى أن الثقافات لم تكن ملوثة.


تربة سوديك المالحة

تشبه التربة الملحية الصودية التربة المالحة ، إلا أنها تحتوي على تركيزات أعلى بكثير من أملاح الصوديوم مقارنة بأملاح الكالسيوم والمغنيسيوم.

عادةً ما يكون للتربة الملحية - الصودية EC أقل من 4 ممهو سم -1 ، ودرجة الحموضة بشكل عام أقل من 8.5. تزيد نسبة الصوديوم القابلة للتبديل عن 15 بالمائة من قدرة التبادل الكاتيوني (CEC). CEC هو مقياس لقدرة التربة على حمل الكاتيونات ، وهي الكالسيوم والمغنيسيوم والبوتاسيوم والصوديوم والهيدروجين والألمنيوم. كلما ارتفعت نسبة CEC ، زادت صعوبة إزالة مشكلة الملح وعلاجها.

يتحرك الماء عبر هذه التربة بقدر ما يتحرك في التربة المالحة ، على الرغم من اختلاف خطوات تصحيح التربة المالحة. سيؤدي ترشيح الأملاح من هذه التربة ببساطة إلى تحويلها من تربة مالحة إلى تربة سوديك.


Rat Kallikrein 10 ، بروتيناز الغدة اللعابية K.

النشاط والخصوصية

يُظهر بروتيناز K تفضيلًا لشق روابط Arg-X في ركائز جزيئية صغيرة ، ويطلق T-kinin من T-kininogen. كما أنه يشكل مجمعات SDS- ومستقرة للحرارة مع البروتين المرتبط بالجرذان المؤتلف المنقى. في المختبر [6]. عمل الإنزيم (كمستضد γ) على T-kininogen مع a كم من 29 ± 4 ميكرومتر و كقط/كم 140 م -1 ث -1. مع H- و L-kininogens ، تم إطلاق 7.4 و 10 ميكروغرام من kinin h −1 mg 1 ، على التوالي ، [4].

تبين أن بروتيناز K (مثل T-kininogenase) يختلف عن نسيج kallikrein في تفاعلاته في المواقع الفرعية S2 و S1 ′ و S2 ′. للاستفادة من هذه الاختلافات ، تم تصميم ركائز مضان انتقائية ، تحتوي على Abz (ا-aminobenzoyl) على شكل فلوروفور ، و EDDnp (2،4-dinitrophenyl-ethylenendiamine) كمخمد. Abz-Phe-Arg ↓ Ser-Arg-EDDnp ، مع Arg عند P2 ، هو ركيزة جيدة لأنسجة كاليكرين من الحصان والخنزير والفئران ، ولكن ليس للبروتينات K. في المقابل ، Abz-Phe-Arg ↓ Leu-Val -EDDnp و Abz-Phe-Arg ↓ Leu-Val-Arg-EDDnp (تسلسل T-kininogen) هي ركائز جيدة للبروتيناز K ، ولكن ليس للأنسجة kallikrein. Arg في P1 ′ ، P2 أو P3 يخفض كم قيم بروتيناز K ، بينما يزيد Val عند P2 kقط [7]. ينشق بروتين K على وجه التحديد بعد بقايا Arg ، مثل الأنسجة الحقيقية kallikrein ، لكنه يختلف عن نسيج kallikrein في قدرته على استيعاب المخلفات القطبية أو غير القطبية في P2.

بشكل غير عادي بالنسبة إلى بروتين سيرين ، يزداد نشاط بروتيناز K بمقدار 10 أضعاف بوجود مركب ثيول مثل DTT. شملت الموانع ليوببتين ، أبروتينين ، توس-ليس-سي إتش2مثبطات الكلور وفول الصويا التربسين. لم يمنع البيبستاتين و PMSF الإنزيم [3،8].

يبلغ الرقم الهيدروجيني الأمثل حوالي 8.0 [3]. يتم إجراء الاختبارات بشكل أكثر ملاءمة باستخدام ركائز الببتيد الفلوروجيني المروى داخل الجزيء Abz-Phe-Arg ↓ Leu-Val-EDDnp و Abz-Phe-Arg ↓ Leu-Val-Arg-EDDnp [7].


نقاش

NaCl يمنع إصلاح PSII

أظهرت الدراسات السابقة لآلية التمثيل الضوئي في الجسم الحي أن إجهاد الملح يعزز تعطيل نشاط PSII الناجم عن الضوء (Neale and Melis، 1989 Lu and Zhang، 1999). في هذه الدراسة ، أكدنا الآثار السلبية التآزرية للإجهاد الخفيف وضغط الملح على مجمع PSII في متزامن. يعكس مدى التعطيل الناجم عن الضوء لـ PSII التوازن بين معدل حدوث الضرر ومعدل إصلاح PSII (Greer et al. ، 1986). In our experimental system, the light-induced damage to PSII and the repair of PSII were clearly separate phenomena. Damage was inflicted by strong light (500 μE m −2 s −1 ) in the presence of lincomycin (Fig. 1), whereas repair was achieved in weak light (70 μE m −2 s −1 ) after PSII had been damaged by exposure of cells to very strong light (2,000 μE m −2 s −1 Figs. 2 and 3). Salt stress (1.0 m NaCl) strongly inhibited repair, but had no effect on the light-induced damage to PSII.

In natural habitats, photosynthetic organisms are often exposed to light stress and, in many instances, salt stress is combined with light stress. Thus, the combined effects of salt and light stress are of considerable importance in nature and agriculture.

NaCl Inhibits the Synthesis of Proteins de Novo

A schematic representation of the proposed steps required for expression of psbA genes and the synthesis of D1, with sites of apparent inhibition by high levels of NaCl (T bars weaker inhibition is indicated by broken T bars). A, 1.0 m NaCl. B, 0.5 m NaCl.

A schematic representation of the proposed steps required for expression of psbA genes and the synthesis of D1, with sites of apparent inhibition by high levels of NaCl (T bars weaker inhibition is indicated by broken T bars). A, 1.0 m NaCl. B, 0.5 m NaCl.

We observed two bands after western blotting with antibodies against the carboxy-terminal extension of pre-D1, namely, the amino acid sequence SGEGAPVALTAPAVNG. Shestakov et al. (1994) demonstrated that pre-D1 is converted to D1 by CtpA, a specific carboxy-terminal-processing protease. Inagaki et al. (2001)demonstrated that this processing involves two separate steps and, moreover, that the top and bottom bands observed after gel electrophoresis correspond to pre-D1 (pre-D1-1) and an intermediate in the processing of pre- D 1-1, namely, pre-D1-2.

Western-blotting analysis of pre-D1 (Fig. 6) indicated that levels of pre-D1-1 and pre- D 1-2 in cells that had been incubated in the presence of 0.5 m NaCl were about 50% of those in low-salt medium (20 m m NaCl), which might correspond to the 50% level of recovery of PSII activity shown in Figure 2. The level of pre-D1 is the result of a balance between the synthesis, processing, and degradation of the protein, and the results in Figure 7 indicate that NaCl had no effect on the processing and degradation of either form of pre- D 1. Northern-blotting analysis, for which results are shown in Figures 8 and 9, demonstrated that in the presence of 0.5 m NaCl, the accumulation of psbAtranscripts was delayed, but the maximum level of psbAtranscripts was unaffected. These observations suggest that translation of psbA transcripts to yield pre-D1 was partially inhibited by 0.5 m NaCl.

Taken together, our results indicate that NaCl inhibited the transcription and translation of psbA genes (Fig. 10). However, inhibition of transcription was the salient factor that was primarily responsible for inhibition of the repair of the PSII complex at 1.0 m NaCl, whereas inhibition of translation was most responsible for the partial inhibition of repair at 0.5 m NaCl.

The Overall Transcription and Translation of Genes Is Affected by NaCl

The results of DNA microarray analysis (Table I) demonstrated that 1.0 m NaCl completely inhibited the light-induced accumulation of the transcripts of all the light-inducible genes, confirming the results of labeling with [ 35 S]Met. These observations suggest that inhibition of transcription by 1.0 m NaCl was the primary cause of inhibition of the light-induced synthesis of light-inducible proteins (Fig. 10). At 0.5 m NaCl, transcription of most of the light-inducible genes ceased to be inducible by light. However, the light inducibility of some light-inducible genes was enhanced to some extent. These results might correspond to the synthesis of a protein of 25 kD (Fig. 5), whose light inducibility was enhanced in 0.5 m NaCl. However, it is unclear which gene encoded the 25-kD protein.

The results of labeling with [ 35 S]Met (Fig. 5) demonstrated that 1.0 m NaCl inhibited the light-induced synthesis de novo not only of D1, but also of all other proteins. At 0.5 m , NaCl also inhibited the light-induced synthesis of all the light-inducible proteins, with a few exceptions, for example, the 25-kD protein. At 0.5 m NaCl, the light inducibility of the synthesis of D1 de novo was reduced and synthesis of the 25-kD protein appeared to be enhanced. Thus, the salt stress due to NaCl significantly depressed the light inducibility of the synthesis de novo of almost all of the light-inducible genes.


Drop Dialysis

1. Pour 30&ndash100 ml of dialysis buffer, usually double-distilled water or 1X TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0), into a petri plate or beaker.

2. Float a 25 mm diameter, Type-VS Millipore membrane (MF type, VS filter, mean pore size = 0.025 &mum, Millipore, Inc. #VSWP 02500) shiny side up on the dialysis buffer. Allow the floating filter to wet completely (

5 minutes) before proceeding. Make sure there are no air bubbles trapped under the filter.

3. Pipette a few &mul of the DNA droplet carefully onto the center of the filter. If the sample has too much phenol or chloroform, the drop will not remain in the center of the membrane and the dialysis should be discontinued until the organics are further removed. In most cases, this is performed by alcohol precipitation of the sample. If the test sample remains in the center of the membrane, pipette the remainder on to the membrane.

4. Cover the petri plate or beaker and dialyze for 1 to 4 hours. Do not allow the sample to flip or become covered with dialysis buffer.

5. Carefully retrieve the DNA droplet with a micro-pipette and place in a microcentrifuge tube. Rinse the spot on the membrane with 50 &mul of 1X TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) and add to the microcentrifuge tube.

6. Estimate the concentration of the DNA product using agarose gel electrophoresis or a spectrophotometer.

ملحوظات
Step 4 may be tricky for those with shaky hands or poor handeye coordination. The filter has a tendency to move briskly around the surface as you touch it with the pipette tip. Practice with buffer droplets to master the technique before using a valuable sample.

Dialysis against double-distilled water is also recommended, especially if proceeding to another manipulation where EDTA might be a problem.

Steps 2 to 4 can be repeated with fresh buffer or for longer times if additional dialysis is required.


شاهد الفيديو: How To Extract DNA From BABANA! كيفية استخلاص الحمض النووي من الموز (كانون الثاني 2022).