معلومة

هل يمكن لبروتين أن يخرج من النواة بعد دخوله بإشارة توطين نووية (NLS)


لجعل بروتين (على سبيل المثال Cas9 ، GFP ...) قادرًا على دخول النواة ، نحتاج إلى إضافة علامة NLS له. فهل ستتمكن من الخروج من النواة بعد دخولها؟


يبدو أنني بحاجة إلى إضافة NES (إشارة تصدير نووية) إذا كنت أرغب في جعلها قادرة على تصدير النواة: https://en.wikipedia.org/wiki/Nuclear_export_signal.


يساعد. تسلسل الإشارة مقابل إشارة التوطين النووي

هل يمكن للبعض أن يشرح الفرق بين هذين المفهومين من فضلك:

تسلسل الإشارة وإشارة التعريب النووي أمبير

أعلم أن إشارة التوطين النووي هي عندما تضع علامة على بروتين بحيث ينتقل إلى النواة .. لست متأكدًا مما إذا كان هذا & # x27s دقيقًا: /

ظهر المفهوم على هذا السؤال ، وسجل AAMC:

واو ، لقد شرحت AAMC بالفعل الإجابة على سؤال بشكل مناسب لمرة واحدة.

حسنًا ، لذا فإن تسلسل التوطين النووي هو ما قلته: إنه في الأساس إشارة توجه جزيء البروتين إلى النواة. هذا مفيد لأعلى / لأسفل لتنظيم بعض العمليات والمنتجات الخلوية.

تسلسل الإشارة هو ما يسمح للبروتينات بدخول الشبكة الإندوبلازمية الخشنة (RER). الآن عليك أن تسأل نفسك ، & quot ما هي أنواع البروتينات التي تدخل إلى RER؟ & quot بشكل عام ، هذه بروتينات إما سيتم إفرازها من الخلية أو تؤدي وظيفتها داخل غشاء الخلية. في المقطع ، تنص على أن بروتينك النهائي (AT1) سيكون ناقلًا. أين يقع الناقلون؟ غشاء بلازمي! كيف تصل إلى غشاء البلازما؟ من خلال المرور بنظام الغشاء الداخلي! كيف تدخل في نظام الغشاء الداخلي؟ تسلسل الإشارة!


خصائص أنظمة الاستيراد النووي في النباتات

تم إنشاء أنظمة استيراد في المختبر باستخدام بروتوبلاستيدات التبغ المنفذة واستخدامها لتوصيف مسار استيراد البروتين NLS في النباتات. تم تطوير اختبار استيراد نووي غير مباشر باستخدام بروتينات البقدونس المفرغة من نوع Triton X-100-permeabilized. يسمح النفاذية لمعظم بروتينات العصارة الخلوية بالتسرب من الخلية ، وتسمح للجزيئات الكبيرة ، مثل الأجسام المضادة ، بدخول الخلية. في هذا الاختبار ، تتم إضافة الأجسام المضادة للبروتينات التي من المفترض أن تذهب إلى النواة إلى البروتوبلاستس النفاذة ، ويتم قياس استيراد معقد الأجسام المضادة للمستضد عن طريق فحوصات حماية البروتياز للأجسام المضادة داخل النواة عن طريق تحليل اللطخة المناعية (Harter et al. ، 1994) .

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نظام استيراد في المختبر يقيس استيراد بروتين NLS بشكل مباشر وتمييزه باستخدام البروتوبلاستيدات النفاذة المفرغة والمشتقة من مزارع معلقات التبغ (Hicks et al.، 1996 Merkle et al.، 1996). عادةً ما تكون الفجوات عبارة عن عضيات هشة إلى حد ما تحتوي على مستويات عالية من نشاط التحلل المائي وتمثل 80٪ من إجمالي حجم الخلية. استخدمنا البروتوبلاست المفرغة في هذه التجارب لأنها مستقرة جدًا وقابلة للحياة تمامًا وسهلة العمل معها. تم تحقيق النفاذية في هذه التجارب عن طريق خفض التناضح في الوسط (Hicks et al. ، 1996) أو عن طريق إضافة كميات منخفضة من Triton X-100 (Merkle et al. ، 1996). في هذا النظام ، تمت إضافة ركائز NLS ذات العلامات الفلورية إلى البروتوبلاستيدات المنفصلة وتم قياس الاستيراد عن طريق الفحص المجهري الفلوري. كان الاستيراد سريعًا ومحددًا لركائز NLS الوظيفية ، وعلى عكس أنظمة استيراد الخميرة والفقاريات ، يمكن أن يحدث استيراد بروتين NLS في غياب جزء عصاري خلوي مضاف خارجيًا ونظام تجديد ATP. تشير هذه النتائج إلى أن عوامل استيراد NLS يتم الاحتفاظ بها في البروتوبلاستيدات النفاذة.

تظهر دراسات تحديد المواقع المناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد متماثل نبات أرابيدوبسيس المستورد α (At-IMPα) أنه يتم الاحتفاظ بـ importin α في السيتوبلازم والنواة في الخلايا المنفصلة ، حتى في وجود المنظفات (Hicks et al. ، 1996). بالإضافة إلى ذلك ، تُظهر دراسات التألق المناعي والكيمياء الحيوية أن importin α يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالنواة وربما NPC (Smith et al. ، 1997). تشير الأدلة غير المباشرة أيضًا إلى أن ران لم ينضب تمامًا من هذا النظام (Merkle et al. ، 1996). وبالتالي ، من الممكن أن تظل جميع عوامل استيراد NLS مرتبطة بالنواة ، وربما الهياكل الأخرى في السيتوبلازم ، بعد نفاذية البروتوبلاست. على الرغم من أن هذه الملاحظات فريدة من نوعها بالنسبة للنباتات ، إلا أنه من الصعب اختبار وظيفة عوامل استيراد النباتات NLS المفترضة كيميائيًا لأنها لا تنضب من البروتوبلاستيد النفاذية.

ميزة أخرى فريدة لعملية استيراد النباتات هي أن استيراد البروتين NLS يمكن أن يحدث عند 4 درجات مئوية (Hicks et al.، 1996 Merkle et al.، 1996). من المثير للاهتمام أن الاستيراد إلى البلاستيدات الخضراء (Leheny and Theg ، 1994) والميتوكوندريا (Knorpp et al. ، 1994) في النباتات العليا يحدث أيضًا عند 4 درجات مئوية ، مما يشير إلى أن النباتات طورت آليات تسمح بعمليات الاستيراد المختلفة هذه في درجات حرارة منخفضة .

من المحتمل أن يتم الحفاظ على متطلبات الطاقة للاستيراد في حقيقيات النوى ، لأنه لا يمكن منع الاستيراد النووي إلا عن طريق نظائر GTP غير القابلة للتحلل في الفقاريات والنباتات (Hicks et al.، 1996 Merkle et al.، 1996 Zupan et al.، 1996 Görlich، 1997). يعد Ran ضروريًا للتحلل المائي GTP في الفقاريات (Görlich ، 1997) ، مما يشير بقوة إلى دور Ran في الانتقال النووي المحفوظ وظيفيًا في حقيقيات النوى.

في الفقاريات ، يتم تعديل مجموعة فرعية من بروتينات NPC بمفردهاس-بقايا GlcNAc المرتبطة (انظر أدناه Davis ، 1995). راصات جرثومة القمح عبارة عن محاضرة ترتبط بشكل خاص ببقايا GlcNAc وبروتينات الجليكوزيلات في NPC. عندما يضاف راصات جرثومة القمح إلى الأنظمة المختبرية في الفقاريات ، يتم حظر انتقال البروتينات النووية ، ربما بسبب العائق الفراغي. كما هو الحال في الفقاريات ، تتعرف راصات جرثومة القمح أيضًا على البروتينات السكرية في محيط النوى و NPCs في النباتات (Heese-Peck et al.، 1995 Hicks et al.، 1996 Merkle et al.، 1996). ومع ذلك ، على عكس نظام الفقاريات ، لا يمنع agglutinin جرثومة القمح خطوة الانتقال لاستيراد بروتين NLS في البروتوبلاستيد المنفصل (Hicks et al.، 1996 Merkle et al.، 1996). قد يكون هذا نتيجة لتعديلات السكر المعقدة الفريدة الموجودة في بروتينات NPC من glycosylated للنباتات (Heese-Peck et al. ، 1995).

على عكس تفاعلات الاستيراد في الفقاريات والخميرة ، فإن إضافة الكسور الخلوية الخام المعزولة من الخلايا النباتية تمنع استيراد بروتين NLS وربطه بالنواة المنقاة. يوضح التجزيء الكيميائي الحيوي للعصارة الخلوية أن هذا المانع منخفضمص البروتين (GR Hicks و N.V. Raikhel ، بيانات غير منشورة). من المثير للاهتمام أن اثنين من المنظمين للاستيراد النووي في الفقاريات والخميرة ، p10 والبروتين الفيروسي R (Vpr) من فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، منخفضة-مصالبروتينات التي يمكن أن تحفز أو تمنع استيراد بروتين NLS في المختبر في أنظمة استيراد الفقاريات (Tachibana et al. ، 1996 Popov et al. ، 1998). يمكن أن يكون البروتين الشبيه بـ p10 أو Vpr هو منخفضمص المانع الموجود في الكسور الخلوية النباتية.


بيولوجيا الخلية 03: استهداف البروتينات للعضيات

هذه ملاحظات من ملحق هارفارد ودورة بيولوجيا الخلية # 8217s. ستركز هذه المحاضرة والمحاضرة التالية على العضيات (النواة والميتوكوندريا اليوم ، و & # 8216secretory pathway & # 8216 of ER و Golgi الأسبوع المقبل). توجد بقع خاصة بكل عضية ، ويمكنك استخدامها لمعرفة مكان وجود كل عضية داخل الخلية. سيكون التركيز الرئيسي اليوم على كيفية تحرك البروتينات (والجزيئات الأخرى) بين العصارة الخلوية والعضيات.

النواة

يحدث تكرار الحمض النووي ونسخ الحمض النووي DNA - و gt RNA في النواة. النواة تحمل الحمض النووي وتحافظ عليه منظمًا طوال دورة حياة الخلية. يحتوي تنظيمها على بعض نظائرها في منظمة الخلية بأكملها (غشاء ، هيكل (هياكل) ، مسام). فيما يلي بعض مكونات النواة:

  • المغلف النووي. هذا غشاء مزدوج & # 8211 طبقتان للدهون & # 8211 يحيطان بالنواة. إنها غير منفذة نسبيًا & # 8211 كل الحركة داخل وخارج النواة منظمة بإحكام. المسام النووية (انظر أدناه) التي تنظم هذه الحركة يجب أن تمتد عبر memrbanes النووية الداخلية والخارجية. الغشاء الخارجي مستمر مع غشاء ER. يحتوي الغشاء الداخلي على بروتينات سطحية متخصصة تسمح بربط الصفيحة وبروتينات المصفوفة.
  • الصفيحة النووية. داعمة & # 8216mesh & # 8217 داخل النواة مصنوعة من البروتينات الليفية. لها أدوار في تنظيم الكروماتين ، وتنظيم تكرار الحمض النووي وانقسام الخلايا ، وترسيخ مجمعات المسام النووية (انظر أدناه).
  • مصفوفة نووية. هذه شبكة ليفية داعمة أخرى توجد داخل النواة ، متميزة عن الصفيحة (أعلاه). وظيفتها ليست مفهومة جيدا.
  • المجالات الصبغية (الكروماتين). يأتي الحمض النووي على شكل كروماتين: DNA مكثف ملفوف بإحكام حول الهيستونات. تميل الكروموسومات الأكثر نسخًا إلى أن تكون موجودة في اتجاه مركز النواة ، مع وجود كروموسومات أقل نشاطًا بالقرب من المحيط.
  • مجمع المسام النووية (NPC). هذا مجمع ضخم من العديد من البروتينات التي تشكل مسامًا تمتد عبر الأغشية النووية الداخلية والخارجية. القاع (على الجانب النووي) يسمى السلة النووية ، وهي في الواقع تبدو مثل سلة على صورة مجهرية إلكترونية.

دعونا نتعلم المزيد عن NPC (الصورة بفضل مستخدم ويكيميديا ​​كومنز مايك جونز):

يبلغ متوسط ​​عدد خلايا الفقاريات 2000 شخصية. تزن NPCs بين الخلايا & # 8217s أكبر مجمعات البروتين ، في 60-80 MDa & # 8211 16x أكبر من الريبوسوم. وهي مصنوعة من 30 بروتينًا مختلفًا تسمى nucleoporins (nups). الفتحة المركزية مائية وكبيرة بما يكفي للأيونات والمستقلبات والبروتينات حتى 40 كيلو دالتون لتمريرها ببساطة عن طريق الانتشار السلبي. يجب أن تتحرك البروتينات الكبيرة جدًا بحيث لا يمكن نشرها بشكل سلبي عبر نموذج البوابة البراونية ، والذي يشبه الانتشار الميسر بالإضافة إلى النقل المسور الذي يعتمد على ATP.

يشتمل هيكل NPC & # 8217s على جزء & # 8216basket & # 8217 على الجانب النووي ، والذي يتم ربطه بواسطة خيوط ومثبت بالصفيحة. هناك أيضًا خيوط حشوية في الخارج. تحتوي بعض النيوكليوبورينات على أجزاء كارهة للماء غنية بالفينيل ألانين (F) والجليسين (G) ، وفقًا لذلك تسمى FG nups. تساعد FG nups في تنظيم الاستيراد والتصدير كما سنرى قريبًا. هناك أيضًا هياكل (ويعرف أيضًا باسم & # 8216symmetric & # 8217) nups مدمجة في الغلاف النووي والتي تشكل سقالة للمجمع بأكمله. تشكل مجمعات Y (16 منها لكل مسام) سقالة الهيكل الأساسي

استيراد وتصدير المواد النووية

من الواضح أن هناك حاجة إلى العديد من البروتينات في النواة & # 8211 polymerases ، الهليازات (المستخدمة في تكرار الحمض النووي) ، الهيستونات ، عوامل النسخ ، والقائمة تطول. كل هذه مترجمة في الخارج للنواة وبالتالي يجب أن تعود إلى الداخل بطريقة أو بأخرى. وبالطبع ، يتم نسخ mRNAs و tRNAs وبعض الوحدات الفرعية الريبوسومية في النواة ويجب أن تخرج إلى العصارة الخلوية. لا تزال البروتينات الأخرى تتحرك ذهابًا وإيابًا في كلا الاتجاهين.

يعتمد استيراد وتصدير المواد النووية على مجموعة من الجهات الفاعلة المختلفة: الواردات أو الصادرات على التوالي ، البروتينات المساعدة Ran Ran GEF و GAP GTP كمصدر للطاقة و FG nups في مجمع المسام النووي. دعونا نتعلم كيف يعمل.

عمليات الاستيراد والتصدير بأكملها بسيطة وأنيقة طالما أنك تراقب الطاقة وليس الاختصارات البشعة. يتم تشغيل الاستيراد / التصدير النووي بواسطة GTP ، عملة الطاقة & # 8220other & # 8221 للخلية. إذا كانت ATP بقيمة 1 دولار على بطاقة الخصم المدفوعة مسبقًا ، فإن GTP تشبه نوعًا ما بطاقة هدايا Starbucks بقيمة 1 دولار: نفس القيمة الاسمية ، ولكن يمكن استخدامها فقط في معاملات معينة. مثل ATP إلى ADP ، يتم تحلل GTP إلى الناتج المحلي الإجمالي لإطلاق الطاقة.

يعتمد الاستيراد النووي على بروتين مهم. يطفو Importin في العصارة الخلوية ويرتبط بإشارة توطين نووية (NLS) على بروتين & # 8216 Cargo & # 8217 ليتم استيراده. هناك مجموعة كاملة من العناصر المستوردة المختلفة التي تتعرف على مجموعة كاملة من NLSs المختلفة. تميل NLS إلى أن تكون غنية بـ K & amp R ، ويبدو أحد أشكال NLS الشائعة مثل PKKKRKV. هذه الخطوة من استيراد ربط NLS هي انحدار بقوة & # 8211 فكر في الاستيراد كمصيدة فئران محددة ، جاهزة للإغلاق الربيعي. تعد Importins (عادةً) في الواقع مجمعات غير متجانسة من بروتينين مختلفين & # 8211 وحدة فرعية ألفا ووحدة فرعية بيتا ، مع كون ألفا هو الذي يربط NLS و beta الذي يتفاعل مع FG nups للوصول إلى المسام النووية. (يُعتقد أن بيتا يمكن أن تعمل بمفردها أيضًا ، على الرغم من أننا لا نفهم كيف.)

بمجرد أن ترتبط شركة importin بشحنتها ، فإنها تتفاعل مع FG nups في المسام من أجل الوصول إلى النواة. وبمجرد وصوله إلى هناك ، يصادف ران مرتبطًا بجزيء GTP (غالبًا ما يسمى Ran-GTP). عندما وفقط عندما يتم تحميل Ran & # 8216 & # 8217 مع GTP ، يكون له صلة بالربط بالاستيراد. هذا ، أيضًا ، ينحدر بقوة & # 8211 مثل إغلاق مصيدة الفأر. عندما يلتزم Ran-GTP بالاستيراد ، فإنه يتسبب في تغيير توافقي يجعل الاستيراد يفرج عن شحنته. فويلا: تم استيراد الشحنة. لكننا شاركنا فقط في ردود الفعل على المنحدرات حتى الآن ، لذلك من الواضح أن ران ومستوردين قادران على القيام بذلك مرة أخرى ، يجب إنفاق الطاقة في مكان ما.

تميل Ran-GTP الملتزمة بالاستيراد إلى الانتشار مرة أخرى خارج من النواة ، حيث تصادف GAP (G TPase- بروتين منشط). Ran هو GTPase & # 8211 ، وهو قادر على التحلل المائي لـ GTP & # 8211 ولكنه لا يميل & # 8217t إلى القيام بذلك من تلقاء نفسه ، فهو يحتاج إلى GAP لتحفيزها. يتسبب GAP في جعل Ran & # 8216 ينفق & # 8217 GTP ، باستخدام الطاقة للحث على التغيير التوافقي الشاق بقوة والذي يطلق الاستيراد. الآن أصبح importin مجانيًا في العصارة الخلوية مرة أخرى وجاهز لاستيراد جزيء شحن آخر. بعد أن أنفق GTP الخاص به ، أصبح Ran الآن Ran-GDP ، والذي ينتقل مرة أخرى إلى النواة حيث يواجه GEF (g uanine nucleotide e xchange f agent) ، الذي يزيل الناتج المحلي الإجمالي ويعيد تحميل Ran باستخدام GTP جديد. الآن ران جاهز للالتزام بمجمع الاستيراد / الشحن التالي الذي يتجول فيه.

لاحظ أن هذه العملية برمتها تحافظ على تركيزات الاستيراد عالية في العصارة الخلوية ومنخفضة في النواة ، وتركيزات Ran-GTP (على عكس Ran-GDP) عالية في النواة ومنخفضة في العصارة الخلوية. يسمح هذا التدرج بالانتشار السلبي لتشغيل السفر أحادي الاتجاه إلى حد كبير لدورة الاستيراد. (على الرغم من أن هذا قد يكون تبسيطًا طفيفًا: تقول ويكيبيديا أن هناك بعض البروتينات الأخرى المشاركة في عملية النقل).

التصدير مشابه بشكل لا يصدق للاستيراد. يقوم Exportin بربط البروتينات داخل النواة التي تحتوي على إشارة تصدير نووية (NES) ويبدو أن الشكل # 8211 هو نموذج تسلسل شائع لـ NES هو LXXXLXXLXL. تمتلك شركة Exportin تقاربًا مع Ran-GTP وتشكل مجمعًا ثلاثي الجزيئات من exportin / Ran-GTP / البضائع. يحتوي المركب ثلاثي الجزيئات على تقارب أعلى لـ FG nups مقارنة بالتصدير وحده ، مما يؤدي إلى زيادة الصادرات. يتحرك المركب عبر المسام ويواجه Ran-GTP GAP الذي يعزز حرق GTP الذي يوفر الطاقة لفصل مجمع ثلاثي الجزيئات بالكامل. الآن ، يعود الناتج المحلي الإجمالي Ran إلى النواة ، حيث يعيد مرفق البيئة العالمية تحميله باستخدام GTP مما يجعله Ran-GTP.

لاحظ أن الطاقة للتصدير مماثلة لتلك الخاصة بالاستيراد. يرتبط الارتباط بالبضائع بانحدار ، ويكون الارتباط بـ Ran-GTP منحدرًا ، والانفصال عن Ran-GTP شاقًا ، مما يتطلب إنفاق GTP. الاختلاف الذي يجعل الاستيراد والتصدير الاستيراد هو أن importin يطلق حمولته عندما تكون ملزمة بـ Ran-GTP ، ويقوم Exportin بإصدار شحنته عند تحريرها بواسطة Ran-GTP.

جانبا: التفسير أعلاه للتصدير هو فقط لتصدير البروتينات. لا يستخدم تصدير mRNA Ran-GTP ، وبدلاً من ذلك يستخدم NXF1 و NXT1 ويتم تشغيله بواسطة ATP باستخدام قاعدة ATPase تسمى Dbn5.

يُظهر هذا الفيديو بروتين NFAT الذي يخضع استيراده / تصديره لتركيزات الكالسيوم:

تحدثنا أعلاه عن إشارات التعريب النووي وإشارات التصدير النووي. هذان مثالان فقط على إشارة الببتيدات. يمكن أن تحتوي البروتينات أيضًا على إشارات توطين خاصة بالميتوكوندريا أو المسار الإفرازي (ER + Golgi). تُشبه هذه الإشارة بالرمز & # 8216zip & # 8217. تسلسل الإشارات عبارة عن امتدادات من الأحماض الأمينية توجد عادة في بداية البروتينات (أي الطرف N). تعمل ببتيدات الإشارة من خلال وجود خصائص كيميائية تحدد ببساطة من خلال تسلسل الأحماض الأمينية التي توفر خصوصية ملزمة لمستقبلات النقل مثل الاستيراد. بالنسبة إلى NLS ، تظل الإشارات جزءًا من البروتين ، بينما ، على سبيل المثال ، تنقطع إشارات المسار الإفرازي في تعديل ما بعد الترجمة. (أول 22 من الأحماض الأمينية من PrP: MANLGCWMLVLFVATWSDLGLC عبارة عن تسلسل توطين مسار إفرازي يتم قطعه في تعديل ما بعد الترجمة).

وجدت البروتينات في على حد سواء قد تحتاج النواة والسيتوبلازم إلى NLS و NES & # 8211 ربما. تتم ترجمة البروتينات في السيتوبلازم ، لذلك اعتمادًا على التركيزات النسبية المطلوبة ، قد تقضي وقتًا كافيًا في السيتوبلازم قبل استيرادها النووي ويمكن أن تلبي احتياجاتها بدون NES.

الديجيتونين (الذي حقق نجاحًا عشوائيًا في شاشة UCSF & # 8217s المضادة للبريونات) هو منظف يعمل على ترطيب الغشاء السيتوبلازمي ولكنه يترك الغلاف النووي سليمًا. هذا يجعل من الممكن عزل النواة في المختبر. بمجرد الانتهاء من & # 8217 ، يمكنك اختبار لمعرفة ما إذا كان يتم استيراد بروتين مهم إلى النواة. (على الرغم من أنه من الواضح أن آلات الاستيراد مثل الاستيراد لا تزال بحاجة إلى أن تكون متاحة).

الميتوكوندريا

(صورة بفضل Wikigraphists مستخدم ويكيميديا ​​كومنز)

تحتوي الميتوكوندريا أيضًا على غشاء ثنائي الطبقة. الغشاء الخارجي (2) عبارة عن طبقة ثنائية بسيطة قابلة للاختراق للأيونات والجزيئات الصغيرة. الغشاء الداخلي (1) غير منفذة تمامًا لجميع الجزيئات من أي حجم ، إلا من خلال القنوات الحاملة. الغشاء الداخلي معقد وله شكل معقد يشبه سطح القشرة الدماغية ، مما يمنحه مساحة سطح إضافية. تسمح مساحة السطح الإضافية هذه بسعة أكبر لسلسلة نقل الإلكترون. يُطلق على الفراغ الموجود بين الغشاءين اسم الفضاء بين الغشاء (الأخاديد العميقة هي cristae (3)) وهو المكان الذي يتم فيه إنتاج ATP. الفضاء داخل الغشاء الداخلي هو مصفوفة الميتوكوندريا (4).

تقوم الميتوكوندريا بتسخير الطاقة عن طريق أكسدة الجلوكوز إلى البيروفات لإنتاج ATP باستخدام دورة حمض الستريك (دورة كريبس) وسلسلة نقل الإلكترون. تستهلك هذه العملية الأكسجين وتطلق ثاني أكسيد الكربون ، وبالتالي يطلق عليها غالبًا التنفس الخلوي. هذا فيديو منه:

داخل الغشاء الداخلي ، في ماتيركس الميتوكوندريا ، هو المكان الذي يعيش فيه كروموسوم الميتوكوندريا ، جنبًا إلى جنب مع بروتينات انقسام الميتوكوندريا وبعض الأشياء الأخرى. على الرغم من أن الميتوكوندريا لها الريبوسومات والـ tRNAs الخاصة بها ، إلا أنها ليست مستقلة تمامًا.في الواقع ، يتم ترميز غالبية البروتينات المطلوبة لتكرار الميتوكوندريا في النواة. يتم ترجمة هذه البروتينات المشفرة نوويًا في السيتوبلازم وشحنها إلى الميتوكوندريا. هذا يتطلب نظام استيراد / تصدير.

إشارة توطين الميتوكوندريا هي جزء من التسلسل ، هيكل الجزء. إنه & # 8217s حلزون ألفا أمفيباثي ، مع R & amp K (أحماض أمينية مشحونة) من جانب وأحماض أمينية كارهة للماء من الجانب الآخر. هذه الخاصية العامة أهم من أي تسلسل محدد. يتم قطع تسلسل الإشارة بعد الدخول في مصفوفة الميتوكوندريا & # 8211 حتى يحدث هذا ، تعتبر البروتينات & # 8216 بروتينات مقدمة & # 8217.

وهذا يتطلب مستقبلات غشائية في الميتوكوندريا تسمى ترانسموكونس. هناك عدد من الفدية من غشاء الرحم (Toms) و t ranslocons من غشاء i nner m (Tims). يحدث النقل إلى مصفوفة الميتوكوندريا فقط في الأماكن التي تكون فيها الأغشية الداخلية والخارجية متقاربة. المرافقة مثل Hsc70 (الجين: HSPA8) تحافظ على البروتينات الأولية في حالة غير مكشوفة & # 8211 ، أي مجرد سلسلة خطية من الأحماض الأمينية & # 8211 وهي غير مواتية بقوة وتتطلب إنفاق ATP & # 8211 ولكنها تجعلها صغيرة بما يكفي ونصف القطر- حكيم ، لتلائم المسام المستوردة. غالبًا ما يتم تصوير Hsc70 على أنه رجل باك مع فمه كجيب ربط عام للببتيدات المتعددة. يغلق ATP الفم ، مما يؤدي إلى انتزاع البروتين السلائف لمنعه من الطي. بالطبع ، لا يزال بإمكانها تشكيل بعض الهياكل الثانوية البسيطة & # 8211 مثل إشارة ألفا الحلزون المطلوبة لتوطين الميتوكوندريا. لكن Hsc70 يمنعه من تكوين هياكل كبيرة ضخمة من الدرجة الثالثة أو الرباعية.

تستقبل مستقبلات Tom 20/22 أو 70/22 في الغشاء الخارجي Hsc70 ، ويشتمل Tom40 على المسام الفعلية نفسها. تيم 23/17 و 44 في الغشاء الداخلي. هذه تقف ل transocon من الغشاء الداخلي / الخارجي. تقع هذه المواقع في & # 8216 مواقع الاتصال & # 8217 حيث يكون الغشاء الداخلي والخارجي قريبين من بعضهما البعض ، ويتم النقل عبر كلتا الطبقتين في وقت واحد ، أي في ضربة واحدة. تحتوي المصفوفة على بروتينات Hsc70 الخاصة بها والتي تساعد على سحب البروتين السلائف الوارد وإبقائه مكشوفًا حتى اكتمال الاستيراد ، الأمر الذي يتطلب ATP مرة أخرى. بمجرد اكتمال الاستيراد ، يشق البروتياز المصفوفة (& # 8216signal peptidase & # 8217) تسلسل الإشارة ثم يطوي البروتين النهائي. شاهدنا هذا الفيديو في الفصل:

لكني في الواقع مغرم أكثر بهذا الفيديو:


هذا الوصف (وكلا هذين الفيديوين) يصور حياة البروتين المقدر أن يوجد داخل مصفوفة الميتوكوندريا. ولكن هناك ثلاثة أماكن أخرى قد يحتاج إليها البروتين: مضمن في الغشاء الداخلي ، أو عائمًا في الفضاء بين الغشاء ، أو مضمنًا في الغشاء الخارجي. (على سبيل المثال ، يحتاج Toms أنفسهم إلى اتباع مسار للاندماج في الغشاء الخارجي).

لتضمين الغشاء الداخلي ، هناك ثلاثة مسارات متاحة.

المسار أ: تحتوي بعض البروتينات على تسلسل استهداف مصفوفة و تسلسل إيقاف نقل داخلي & # 8211 تسلسل كاره للماء معترف به بواسطة قناة Tim23 / 17 & # 8211 والذي يتسبب في تحريك Tim23 / 17 لهذا التسلسل جانبيًا في الغشاء (آلية غير معروفة) ، حيث يصبح بروتينًا غشائيًا مستقرًا في الغشاء الداخلي.

المسار B: تحتوي البروتينات الأخرى على تسلسل استهداف مصفوفة بالإضافة إلى مجال مسعور مختلف يتعرف عليه Oxa1. هذه البروتينات تجعلها تصل إلى المصفوفة لكنها تجد طريقها بعد ذلك الى الخلف في الغشاء الداخلي لتصبح بروتينات عبر الغشاء.

المسار C: لا تزال البروتينات الأخرى لا تحتوي على تسلسل استهداف مصفوفة ، ومع ذلك يتم التعرف عليها بطريقة ما من قبل مجموعة من Tims الأخرى ، وينتهي بها الأمر عبر الغشاء. (tldr: في الأساس لا نعرف شيئًا عن المسار C).

هناك أيضًا مساران مختلفان إلى الفضاء بين الغشاء.

يتطلب المسار A تسلسل استهداف مصفوفة وتسلسل استهداف مساحة بين الغشاء ، يتم التعرف على الأخير بواسطة Tim23 / 17 والذي ينقله بشكل جانبي إلى الغشاء تمامًا كما هو الحال في المسار A عبر الغشاء الداخلي ، ولكن بعد ذلك ينقسم البروتين ، تاركًا فقط الجزء العلوي من تسلسل استهداف الفضاء بين الغشاء يطفو في الفضاء بين الغشاء.

المسار B & # 8217 بسيط & # 8211 بعض البروتينات لها تسلسل يتعرف عليه Toms وليس Tims.

نحن لا نعرف الكثير عن المسار إلى أن يصبح بروتين الغشاء الخارجي الغشائي مثل Tom40 نفسه ، وبروتيناته المتفاعلة. نحن نعلم أن البروتينات المرتبطة بالغشاء الخارجي تتفاعل مع Tom40 الذي ينقلها إلى مجمع SAM (آلات الفرز والتجميع) المكون من 3 بروتينات (بواسطة آلية غير معروفة) تدخلها في الغشاء. عادة ما تكون بروتينات الغشاء الخارجي كارهة للماء تمامًا ، مما يدفع على الأرجح للانتقال من Tom40 إلى الغشاء ، لكن الآلية الدقيقة غير معروفة.

تدهور مجمع المسام النووي

ناقشنا في القسم D & # 8217Angelo 2009. أظهرت هذه الورقة أن بروتينات السقالة & # 8211 جزءًا مهمًا من مجمع المسام النووي الذي تمت مناقشته أعلاه & # 8211 يتم إنتاجه فقط عندما تنقسم الخلايا ومن ثم يجب أن تستمر طوال عمر الخلية بالكامل & # 8211 بالفعل ، العمر الكامل للكائن الحي ، في خلايا ما بعد الانقسام الفتيلي. لذلك في الخلايا العصبية الخاصة بك ، لا يتم استبدال أو تحديث هذه المكونات الأساسية لمركب المسام النووي أبدًا ما دمت تعيش. إنها متينة للغاية ، لكنها تتعرض لأضرار مؤكسدة بمرور الوقت ، وهذا يؤدي في النهاية إلى تدهور مجمع المسام بالكامل ، لدرجة أن المسام تفقد انتقائها ويمكن أن تنتشر جميع أنواع الجزيئات الكبيرة في العصارة الخلوية إلى النواة.

قد يكون لهذا بعض الآثار السيئة للغاية. قد تساهم بروتينات العصارة الخلوية التي تدخل النواة من خلال المسام التالفة في مزيد من الضرر التأكسدي ، مما يخلق نوعًا من حلقة مفرغة من الشيخوخة. يتكهن المؤلفون بأن التطور ببساطة لم يكتشف أبدًا طريقة لتفكيك واستبدال مجمعات المسام & # 8211 أو مجرد استبدال مكونات السقالة & # 8211 دون فتح الغلاف النووي.

لقد حصلت أخيرًا على تمييز واحد للطرق في علم الأحياء الجزيئي. عندما يضع الناس GFP تحت مُروِّج للجين محل الاهتمام ، فإن هذا & # 8217s وكيل لما إذا كان الجين محل الاهتمام سيحصل نسخت. عندما يضع الناس الجين الأصلي + GFP (بروتين اندماج GFP) تحت هذا المروج ، فإنهم & # 8217 إعادة التحقق مما إذا كان الجين محل الاهتمام يحصل مترجم.

هناك بعض الأساليب المجنونة في هذه الورقة أيضًا & # 8211 جديدة بالنسبة لي على الأقل. يستخدمون RNAi ضد RNAi. لقد وضعوا GFP تحت مروج الجينات التي تهمهم ثم استخدموا RNAi ضد GFP حتى ذهب GFP للقضاء على GFP الحالي. ثم لمعرفة ما إذا كان GFP لا يزال يتم التعبير عنه بنشاط ، كان عليهم إيقاف RNAi ، وهو ما فعلوه باستخدام RNAi ضد Dicer ، وهو بروتين مطلوب لـ RNAi.

لا يمتلك Huntingtin & # 8217t إشارة توطين نووي ، لكن لديه إشارة تصدير نووية محفوظة تطوريًا [Xia 2003 (ft)]. هذا نوع من الغرابة ، أليس كذلك؟ & # 8217s تُترجم في العصارة الخلوية ، فلماذا تحتاج إلى إشارة تصدير إذا لم يكن لديها طريقة للوصول إلى النواة في المقام الأول؟ آه ، ولكن بطريقة ما بروتينات polyQ فعل لديك طريقة للوصول إلى النواة ، خاصةً عندما تكون مسالك polyQ طويلة جدًا [انظر على سبيل المثال Wheeler 2000 (ft)]. نحن لا نفهمه جيدًا ، وهو موضوع بحث كبير لأن شظايا هنتنغتين المتحولة غالبًا ما توجد في النواة ويعتقد بعض الناس أن هذا التوطين النووي قد يكون مطلوبًا لمرض هنتنغتون للتسبب في سميته.

يمر PRP عبر المسار الإفرازي لذا يجب أن تكون محاضرة الأسبوع المقبل & # 8217s أكثر صلة به. عندما بحثت على Google & # 8216PrP التعريب النووي & # 8217 و & # 8216PrP تعريب الميتوكوندريا & # 8217 وجدت تقريرين عن قدرة PrP Sc على الوصول إلى النواة وربما وجود & # 8216cryptic & # 8217 NLS [Gu 2003، Jaegly 1998] أو الارتباط بطوافات دهون غشاء الميتوكوندريا [Sorice 2012] لكني لست متأكدًا من مدى قبول أي من هذه الأفكار جيدًا.

حول إريك فالاب مينيكيل

Eric Vallabh Minikel في مهمة مستمرة مدى الحياة للوقاية من مرض البريون. وهو عالم في معهد برود في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وجامعة هارفارد.


خلفية

مكّن الحصول على نواة الخلية من الفصل المكاني للنسخ والترجمة ، ومن المحتمل أن يسمح بتطوير آليات أكثر تعقيدًا لتنظيم التعبير الجيني [1]. نظرًا لأن البروتينات تُترجم في السيتوبلازم ، فإن ظهور آلية استيراد نووي موثوقة وفعالة كان الحدث الأساسي الذي أدى إلى أصل الخلية حقيقية النواة. يحدث النقل Nucleocytoplasmic عبر الغلاف النووي في الغالب من خلال مجمعات المسام النووية (NPCs). على الرغم من أن البروتينات الصغيرة يمكن أن تنتشر بحرية من خلال NPCs ، فإن الجزيئات الكروية أكبر من

يتم نقل 40 كيلو دالتون بشكل انتقائي عبر آلية تعتمد على الطاقة والتي تتطلب عوامل نقل إضافية ، تسمى karyopherins ، والتي تتعرف على إشارات التوطين النووي (NLS) في بروتينات الشحن [2]. كشفت الدراسات السابقة عن بعض الأحداث المهمة في تطور الغلاف النووي والأسلاف المحتملة للعناصر الرئيسية لآلات الاستيراد: NPCs و karyopherins [3،4،5،6،7]. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح كيف تم اختيار البروتينات لاستيرادها إلى النواة المكونة ، أي كيف تطور البروتين النووي.


المحاضرة 19: الاتجار بالخلايا وتوطين البروتين

يتحدث البروفيسور إمبريالي عن الاتجار ، أو كيف تصل الأشياء إلى حيث يجب أن تكون داخل الزنزانة. وستناقش الآليات التي يتم من خلالها ترميز البروتينات في وقت مبكر جدًا في تكوينها الحيوي ، من أجل الانتقال إلى أماكن معينة داخل الخلية أو خارجها.

معلم: باربرا إمبريالي

المحاضرة 1: أهلاً بك أنترودو.

المحاضرة 2: الترابط الكيميائي.

المحاضرة 3: هياكل صباحا.

المحاضرة 4: الانزيمات والميتا.

المحاضرة 5: الكربوهيدرات و.

المحاضرة 9: إعادة تشكيل الكروماتين.

المحاضرة 11: الخلايا ، البسيط.

المحاضرة 16: الحمض النووي المؤتلف.

المحاضرة 17: الجينوم والحمض النووي.

المحاضرة 18: SNPs والإنسان.

المحاضرة 19: Cell Traffickin.

المحاضرة 20: إشارات الخلايا.

المحاضرة 21: إشارات الخلايا.

المحاضرة 22: الخلايا العصبية ، العمل.

المحاضرة 23: Cell Cycle and.

المحاضرة 24: الخلايا الجذعية Apo.

المحاضرة 27: تصور الحياة.

المحاضرة 28: تصور الحياة.

المحاضرة 29: التصوير الخلوي.

المحاضرة 32: Dise Dise.

المحاضرة 33: Bacteria and An.

المحاضرة 34: الفيروسات والنمل.

المحاضرة 35: الإنجاب سل.

باربرا إمبريالي: أود دائمًا أن أذكرك فقط أن السادس - إنه نوع من المهمة ، لكن الأرقام - سنقوم بهذا المشروع الموجز الإخباري ، حيث يكون مشروع عمل جماعي إذا اخترت ذلك. إذا ألقيت نظرة على القطعة التي بين يديك الآن ، فإنها تطلب منك القليل من المعلومات حول ذلك ، من ستعمل معه ، إذا اخترت العمل مع شخص ما. أو يمكنك العمل بمفردك. هذا جيد.

ونحن نتطلع للحصول على موجز إخباري له أهمية للبحث الجاري في علوم الحياة. وقد أعطيتك - هناك زوجان من الروابط في الشريط الجانبي للموقع ، لذا فهي أماكن جيدة حيث يمكنك العثور على مواد مثيرة للاهتمام. إن ما أهتم به للغاية بالنسبة لك ، كمجموعة حيث يعمل الكثير منكم في المجالات الهندسية ، هو العثور على شيء رائع حقًا في التفاعل بين علوم الحياة والهندسة ، حيث يكون للهندسة تأثير كبير على علوم الحياة.

لديك بدائل. يمكنك تنزيل إحداثيات البروتين وطباعته على طابعة ثلاثية الأبعاد وإعطائنا ملخصًا لما هو البروتين ، وماذا يفعل ، وإرسال الطباعة ثلاثية الأبعاد الخاصة بك. سأعيدها إليك بعد ذلك ، بمجرد إلقاء نظرة عليها. لكن في الواقع أرسل الطباعة ثلاثية الأبعاد.

ثم الفرصة الأخرى - أعتقد أنك ستتذكر مرة أخرى عندما كنا نتحدث عن البيولوجيا الجزيئية للخلية. لقد قمت بعمل عرض توضيحي بسيط في مقدمة الفصل ، لا شيء مثل عروض البروفيسور مارتن التجريبية على الإطلاق. كان هذا أنا مع كبلات الإيثرنت التي تظهر لك ما فعله توبويزوميراز. لكن في العرض التوضيحي الخاص بي ، لم أريكم كيف يقطع توبو أيضًا خيطًا من الحمض النووي ، ويحتفظ به بينما يفك الالتواء الفائق ، ثم يخيطه معًا. لذلك اعتقدت أن بعض المهندسين قد يكونون قادرين على ابتكار شيء أفضل حقًا من ذلك بالنسبة لي لاستخدامه ، بالنسبة لنا ، في العام المقبل في الفصل. لذا فأنا أضع التحدي هناك حقًا.

لذلك أنا دائما أحب الأشياء في الأخبار. اعتقدت أن هذا مثير للاهتمام أن الفقاريات الأولى تطورت في المياه الضحلة. اعتقدت أن تلك كانت الفقاريات الأولى الرائعة حقًا. أحب أن أحضر واحدًا منهم في حوض للأسماك وأحتفظ به. لكن على أي حال ، هذا كل شيء.

إنه لأمر مدهش حقًا ما يمكنك رؤيته في التقارير العلمية وموجزات الأخبار. أنظر إليهم كلما جاءوا. أحصل على المنشورات كل يومين أو ثلاثة أيام. ويسعدني أن أرى أن هناك الكثير من الأشياء الموجودة في تلك الملخصات الإخبارية التي أشعر أننا نتيح لك قراءتها ببعض التقدير بسبب ما نغطيه في الفصل.

إذن ما نقوم به الآن هو أننا نقفز حقًا إلى الأمام هنا في الخلايا والكائنات الحية ، فيما يتعلق بفهم كيفية بنية ووظيفة الجزيئات الكبيرة الفردية ، والبروتينات ، والأحماض النووية ، والسكريات ، وتحديد الحياة ، وتحديد ديناميات الحياة التي ضرورية للكائن الحي لكي يمر فعليًا بدورة حياة ، وينقسم ، وينقسم الخلايا ، ويمضي قدمًا ، وتحرك الخلايا. إذن ما سنتحدث عنه في المحاضرات القادمة ، وهو القسم 6 ، هو الإتجار الخلوي والإشارات. ولذا بالنسبة للمحاضرة الأولى ، وهي 19 عامًا ونحن الآن - لذا تجاوزنا علامة منتصف الطريق - سأتحدث عن الاتجار. وبهذه الطريقة ، داخل الخلية ، تصل الأشياء إلى حيث يجب أن تكون ، أو يتم تصديرها من خلية.

لأن كل تصرفات الخلية - أحب التفكير في الخلية كلوحة دائرة كهربائية ، حيث يوجد جهاز استقبال يحصل على المعلومات. ثم تحدد الدوائر المعقدة النتيجة التي تحصل عليها في نهاية اليوم. يجب أن تكون العديد من البروتينات التي تحدثنا عنها في أماكن محددة حتى تعمل الخلية.

يجب أن يكون لدينا بوليميريز DNA في النواة. لن يكون مفيدًا في السيتوبلازم. يجب أن يكون لدينا عامل نسخ يساعد النسخ على الانتقال إلى النواة في الوقت المناسب لحدوث النسخ. لكننا لا نريدها هناك طوال الوقت ، وإلا فسيكون لديك مفتاح الإضاءة طوال الوقت. لن يكون ذلك مفيدًا. لذلك نحن بحاجة إلى تنظيم مكان وجود جزيئات معينة. نحتاج إلى وجود أجهزة استقبال على سطح الخلية لاستقبال الإشارات من الخارج.

هذا لا ينطبق فقط على الكائنات متعددة الخلايا. من المناسب للكائنات وحيدة الخلية أن تشعر ببيئتها وتعرف ما يدور حولها. هل يتغير تركيز الملح؟ هل الجو حار جدا؟ هل الجو بارد؟ هل يوجد أكسجين كافٍ؟ حتى الكائنات أحادية الخلية تحتاج إلى استقبال الإشارات والاستجابة لها.

الكائنات متعددة الخلايا أكثر تعقيدًا. لأنك تحتاج إلى إنشاء أعضاء وأجزاء مختلفة من كائن متعدد الخلايا لها وظيفة متخصصة. لذا فإن الاتجار هو في الحقيقة ما يحدث بعد أن تكون قد صنعت DNA مكررًا في النواة ، ونسخه ، وصنع رسولًا ناضجًا يخرج إلى السيتوبلازم في معظم الحالات. سنتحدث عن الاستثناءات لهذه الحالة.

ثم في السيتوبلازم ، عندما يتم التعبير عن البروتينات ، كل الأشياء المختلفة التي تحدث والتي تضمن وصول البروتين إلى الوجهة الصحيحة للوظيفة. وبعضها معقد للغاية. لأنني تذكر ، إذا كنت سأوقف جهاز استقبال في الغشاء الخلوي مع التقاط الإشارات من الخارج ، يجب أن أخرج من السيتوبلازم هناك بطريقة موثوقة.

في المحاضرتين 20 و 21 ، سأتحدث إليكم عن الإشارات الخلوية مع التركيز على خلايا الثدييات وأنواع عمليات الإشارات التي قد تنحرف في الخلايا ، على سبيل المثال ، تكاثر الخلايا. وبعد ذلك سيركز البروفيسور مارتن حقًا على الخلايا العصبية ، علم البصريات الوراثي في ​​المحاضرة 22. لذا فإن هذه الحزمة تسمح لك حقًا باستدعاء الأشياء التي تعلمتها حتى الآن وتطبيقها في مواقف أكثر إثارة للاهتمام وتعقيدًا.

إذن هذا رسم رائع ، نوع من السخيفة لخلية مثلثة. هناك دائمًا نكتة في علماء الأحياء الخلوية ، عندما يحاولون التحدث إلى علماء الرياضيات وعلماء الرياضيات يريدون تبسيط كل شيء. وهكذا يحصل كل شيء - تخيل خلية ، ويظهر هذا المربع على الشاشة. حسنًا ، نعلم جميعًا أن الخلايا ليست مثلثة الشكل أو مربعة الشكل. لكن مع ذلك ، اعتقدت أن هذا كان رائعًا بشكل خاص.

وبالتالي فإن الإتجار ، عملية الإتجار ، هي في الحقيقة كل شيء ، أين هي المعلومات المشفرة في البروتين الذي يضمن أن يكون البروتين في المكان الذي يجب أن يكون فيه للديناميكيات التي نلاحظها في النظام الحي؟ لقد تحدثنا كثيرًا عن الأشياء الثابتة. نصنع البروتين. ها هو البروتين. طيات البروتين.

لقد تحدثنا كثيرًا عن الأشياء الثابتة نوعًا ما في الزمان والمكان. لكن ما نريد فعله هو فهم ما الذي يجعل الخلية مبرمجة للخضوع لوظيفة جديدة. على سبيل المثال ، شيئًا بسيطًا مثل انقسام الخلايا ، يتعين علينا تنظيم مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأنشطة من أجل بدء حدوث عملية انقسام الخلية. شيء بسيط حقًا هو حركة الخلية ، فكر في كيف تتحرك الخلايا؟ إنهم لا يتحركون طوال الوقت ، لكن في بعض الأحيان يتجهون نحو إشارة. ما الذي يثير هذا النوع من التفاعلات؟

لذا عند النظر إلى الخلية ، هذه بعض الصور القديمة ، حيث تكون بعض العضيات ، على سبيل المثال ، ملطخة بحيث يمكنك رؤيتها. لذا فإن البيروكسيسومات هي المكان الذي يحدث فيه التدهور. يعد كل من golgi و ER جزءًا مما يُعرف باسم نظام الغشاء الداخلي. سترى الكثير عن هذا في الجزء الأخير من الفصل ، حيث نتحدث عن كيفية خروج الأشياء من الخلية من خلال نظام الغشاء الداخلي.

هناك غشاء البلازما السطحي. السيتوبلازم ليس مائيًا حقًا - إنه مساحة مفتوحة. لكنها في الحقيقة ليست مفتوحة. إنه مزدحم للغاية بجميع أنواع الجزيئات وجميع أنواع البروتينات الهيكلية وما إلى ذلك. لذلك لا تفكر في السيتوبلازم كحل ، ولكن فكر في الأمر على أنه هيكل يشبه الهلام مع حدوث الكثير من الأشياء فيه.

النواة نفسها محاطة أيضًا بغشاء ، وكذلك نظام الغشاء الداخلي. لذلك سيكون هذا هو الغلاف النووي. داخل النواة ، لديك بنية تسمى النواة ، حيث يتم صنع جوانب الأحماض النووية اللازمة للتخليق الحيوي للبروتين. ثم هناك بروتينات هيكلية مثل الأنابيب الدقيقة والأكتين.

لكن الآن ، في هذا اليوم وهذا العصر ، ليس علينا التعامل مع صور الفانيليا هذه. يمكننا في الواقع استخدام الأساليب التي تعلمتها في القسم الأخير ، علم الأحياء المؤتلف ، لإنشاء إصدارات جديدة من البروتينات التي تحتوي مع تسلسلها على علامة تمنحها علامة ذات لون مضيء.لذلك ، في وقت لاحق من الفصل الدراسي ، سنقضي ثلاث محاضرات حول التألق والتصوير الخلوي ، حيث ستتعلم المزيد عن هذه البروتينات الرائعة إلى جانب القول بأننا حصلنا على بروتين أخضر وآخر أحمر. سنقدم لكم جميع المعلومات الأساسية حول هندسة البروتين التي مكنت هؤلاء من أن يصبحوا أدوات للبيولوجيا.

لكن في الوقت الحالي ، سأريكم فقط كم هي أكثر إثارة للاهتمام من صور الهياكل تحت الخلوية عندما تقوم بتسمية ، على سبيل المثال ، بروتين معين يذهب حصريًا إلى النواة ببروتين فلوري أزرق ، أو إلى الميتوكوندريا. تذكر ، أخبرك البروفيسور مارتن أننا دائمًا ما نفكر في هذه الأشياء - ولن أقوم بتمرين الضغط. سأقولها فقط ، قوة الخلية. أنا لا أفعل-- [يضحك] أنا لست رائعًا مع تمارين الضغط ، لأكون صادقًا.

لكنك ترى هذا النوع من الهياكل الممتدة والمتشابكة. يعتبر الفيمنتين أكثر من بروتين هيكلي. ها هي الجولجي ، الشبكة الإندوبلازمية ، والنواة.

لذا فإن بروتينات الفلوروفور الملونة ، أو البروتينات الفلورية الفلورية ، تسمح لنا في الواقع ، في الوقت الحقيقي ، بمراقبة الديناميكيات. بمجرد صنع البروتين ، إلى أين يذهب؟ إذا أضفنا محفزًا إلى الخلية لإحداث تفاعل ، فهل يمكننا ملاحظة ذلك البروتين ، على سبيل المثال ، ينتقل إلى غشاء البلازما. هل يمكننا مشاهدة البروتينات التي تتكون من خلال ER؟ مجموعة متنوعة من الأشياء المختلفة التي تسمح لنا في علم الأحياء الحديث أن ننظر حقًا إلى الديناميكيات ، وليس فقط المعلومات الثابتة.

ولذا فإن ما سأتحدث إليكم عنه هو الطرق التي يتم بها ترميز البروتينات في وقت مبكر جدًا من تكوينها ، في تكوينها الحيوي ، من أجل الانتقال إلى أماكن معينة داخل الخلية. لذا اسمحوا لي أن أقدم لكم هنا القليل من خريطة الطريق مع البروتين. وحيث قد تبدأ الأشياء - فلدينا بعض الخيارات. هل نريد إرسال البروتين إلى خارج الخلية أم إبقائه داخل الخلية؟

من الواضح أن هناك اختلافين افتراضيين كبيرين ، إذا كنت ستذهب إلى مكان معين داخل الزنزانة. هل سنبقى فقط في العصارة الخلوية؟ هذا نوع من البساطة - في الواقع ، هذا هو الوضع الافتراضي. لأنك تريد أن تتذكر أن معظم البروتينات تصنع على الريبوسومات في العصارة الخلوية للخلية.

لكن الإحصائيات تشير إلى أن حوالي 50٪ من البروتينات تنتهي في مكان آخر غير السيتوبلازم. قد ينتهي بهم الأمر في عضية ، أو يعودون إلى النواة على السطح ، أو يفرزون. إذاً هناك الكثير - لذا فهو جيد ، وصلب 50٪ لا ينتهي به الأمر بالبقاء في العصارة الخلوية ، حيث صنعت في الأصل.

بديلهم هو الذهاب إلى العضيات. وإذا كنت ذاهبًا إلى عضية ، فتذكر أن الريبوسوم ليس غشاء. ليس لديها محيط غشاء. لكن العديد من العضيات لها محيط غشاء.

لذلك نحن نتحدث هنا عن الميتوكوندريا. هذه كلمة طويلة جدًا. النواة - لذلك سأختصر أشياء مثل البيروكسيسومات ، أو العديد من العضيات ذات الحدود الغشائية ، حيث يتعين علينا معرفة ، إذا تم صنع شيء ما في السيتوبلازم ، كيف يصل إلى تلك العضيات؟

الآن تحدثنا قليلاً عن حقيقة أن بعض البروتينات مصنوعة في الميتوكوندريا. سأعود إلى ذلك بعد قليل. لكن جميع البروتينات الموجودة في الميتوكوندريا لا تُصنع في الميتوكوندريا. يتم شحن بعضها في.

تذكر شيئًا في نظرية التعايش الداخلي ، حيث قلنا أن الميتوكوندريا ربما تكون قد نشأت من البكتيريا وانغمرت في الخلايا. من الواضح أن تلك البكتيريا كانت في الأصل مكتفية ذاتيا. ولكن تم الاستغناء عن الكثير من البروتينات التي تم التعبير عنها في الميتوكوندريا ، وتستخدم الميتوكوندريا الآن بروتينات مشفرة بواسطة الحمض النووي النووي بدلاً من الميتوكوندريا. ولكن حتى يومنا هذا ، تظل بعض البروتينات مشفرة داخل الميتوكوندريا.

لذا فهذه فرص لأين يمكن أن يكون ذلك. وسأتحدث على وجه التحديد عن الإشارات التي يمكن أن تنقل البروتينات إلى الميتوكوندريا وفي النواة. واتضح أن الحواجز حول تلك العضيات مختلفة تمامًا. سأعود إلى ذلك في ثانية عندما نصل إلى الشريحة التالية.

فيما يتعلق بالخروج من الزنزانة ، هناك خياران. يتمثل أحد الخيارات في بقاء البروتين في غشاء البلازما ولكن مع وجود جزء من بنيته خارج الخلية. لذا فإن الخيار الآخر هو أن يتم بصق البروتين بالفعل خارج الخلية ككيان قابل للذوبان يمكنه السفر حول كائن حي ، على سبيل المثال ، في مجرى الدم والذهاب إلى موقع بعيد. ويصبح ذلك مهمًا جدًا في إرسال الإشارات. لذلك نسمي تلك البروتينات التي تفرز وقابلة للذوبان.

لذلك ستكون هذه غشاء. هذه ستصبح بروتينات قابلة للذوبان. دعنا نلقي نظرة على هيكل الخلية وننظر إلى مكان وجود هذه المكونات المختلفة.

لذلك إذا رأيت هذه النقاط ، فهذه هي ريبوسومات حرة في السيتوبلازم. سيبدأون في التعبير عن بروتينات مختلفة. يتم التعبير عن الكثير من البروتينات في الريبوسوم. ولكن في بعض الحالات ، يتم التعبير عن البروتينات على الريبوسومات المرتبطة بالشبكة الإندوبلازمية. وبالتالي ، تبدأ عملية يتم بموجبها شحن البروتينات إلى خارج الخلية.

حيث ترى البقع هنا ، الريبوسوم الحر ، ثم الريبوسومات المرتبطة بالشبكة الإندوبلازمية الخشنة ، هنا ، أقداركم على الجانب الأيمن من تلك الصورة. وهنا ، ينتهي مصير هذه البروتينات على الجانب الأيسر من هذا النوع من شجرة العائلة التي أريكم إياها. من الواضح أن هناك مكانًا آخر تصنع فيه البروتينات ، وهو الميتوكوندريا.

وإذا كنت تتذكر السؤال الأول في امتحانك ، فقد وصف الحمض النووي الموجود في الميتوكوندريا. بالعودة إلى نظرية التعايش الداخلي ، هذه قطعة دائرية من الحمض النووي. وهو يميزها عن بعضها البعض. وتبدو الريبوسومات في الميتوكوندريا أشبه بالريبوزومات البكتيرية أكثر من الريبوسومات حقيقية النواة. لذا تذكر ، طوال الوقت ، سنحاول في النصف الثاني من الدورة إعادة المعرفة التي علمناك إياها ، ولكن نوعا ما ، نوعا ما ، نذكرك إلى ما لا نهاية أن تضع الصورة الكبيرة في الاعتبار. لأننا تحدثنا إليك بالفعل حول هذا الموضوع.

إذن هذه الآن رؤية مصورة جميلة لما وصفته لك للتو. وسأتحدث أولاً وقبل كل شيء عن البروتينات التي يتم تصنيعها في السيتوبلازم والتي يمكن شحنها إلى العديد من العضيات ، وكيف يتم تحقيق ذلك. ثم في الجزء الثاني من الفصل ، سأتحدث عن كيفية شحن البروتينات إلى سطح الخلية ، أو من خلال طردها من الخلية.

لذا فإن الآليات الرئيسية التي يتم من خلالها نقل البروتينات إلى مواقع جديدة هي أولاً وقبل كل شيء استخدام تسلسلات الاستهداف التي تشكل جزءًا من تسلسل البروتين. وهذه طريقة شائعة جدًا يتم من خلالها الاتجار بالبروتينات. هم جزء من التسلسل. قد يكونون في المحطة الأمينية أو الكربوكسي. لكنها منسوجة في هيكل البروتين الخاص بك.

لذا يأتي البروتين الخاص بك مع رمز شريطي يقول أين سينتهي الأمر بالضرورة. وبالنسبة لنواة الميتوكوندريا والبيروكسيسومات ، على سبيل المثال ، قام الناس بعمل مكثف باستخدام المعلوماتية الحيوية للبحث بشكل أساسي عن تسلسل البروتين والعثور على موضوعات مشتركة لتسلسلات معينة قد تكون مشتركة حيث قد تنتهي مجموعة من البروتينات. في بعض الأحيان ، قد لا يكون من السهل رؤية هذه التسلسلات للوهلة الأولى فقط. ولكن الآن هناك مواقع على شبكة الإنترنت يمكنك بسهولة جدًا وضع تسلسل البروتين الخاص بك في موقع الويب ، وسيقول ، إنه يحتوي على تسلسل توطين نووي ، أو تسلسل لاستهداف الميتوكوندريا. لذلك يمكننا القيام بذلك إما بالعين أو باستخدام التحليل المعلوماتي.

تحليل المعلوماتية ذو قيمة كبيرة لأنه في بعض الأحيان قد تكون المعلومات أكثر تشفيرًا. وقد يكون من الصعب الخوض في الكثير من التسلسلات. لذلك يمكنك حقًا معرفة تسلسل الاستهداف من خلال المعلوماتية الحيوية. لأنه في الوقت الحاضر ، جينومات العشرات والآلاف من الكائنات الحية متاحة بسهولة على الإنترنت. ويمكنك حرفيا تحليل المعلومات من المعلومات الجينومية التي تمنحك المعلومات البروتينية.

هذه طريقة واحدة ، لذلك مع التسلسلات المستهدفة. في بعض الحالات ، تظل تلك التسلسلات المستهدفة جزءًا من البروتين. ولكن في حالات أخرى ، من أجل ضمان بقاء البروتين في مكانه ، تتم إزالة تسلسل الاستهداف. هذه نقطة مهمة أخرى. قد تحتفظ بتسلسل الاستهداف ، أو قد تفقده من خلال عمل إنزيم آخر يقطع تسلسل الاستهداف عند الوصول إلى الوجهة.

الآن ، هناك طريقة ثانية يمكننا من خلالها برمجة أين يمكن للبروتين أن يذهب. وهذه تحولات مفيدة إلى حد ما تجعل الأشياء أكثر ديناميكية. لذا دعني أطلعك على مفهوم.

إذا كنت تفكر في بروتين مصنوع على الريبوسوم ، فإنه يحتوي على تسلسل استهداف. من أجل إيصال هذا البروتين إلى الوجهة المقصودة ، يجب أن تصنع دفعة جديدة من البروتين ستذهب إلى وجهتها. سينتهي به الأمر في الميتوكوندريا. عليك أن تجعل البروتين دي نوفو.

في بعض الأحيان عندما نحتاج إلى عمل الخلية ، لا يمكننا الانتظار كل هذا الوقت. يمكننا أن نفعل الأشياء بسرعة ونتوقع أن تغير الخلية فجأة ما تفعله. لأننا نجلس في انتظار الريبوسوم ليصنع نسخًا جديدة من البروتين. لذا فإن الطريقة الثانية التي يتم من خلالها استهداف البروتينات لوجهات جديدة هي من خلال ما يعرف بتعديلات ما بعد الترجمة.

هذا غير عادل يا آدم. رأيتك تستخدم الألواح الوسطى ، لكنها بدت أسهل بكثير.

لذا فإن الطريقة الثانية لاستهداف بروتين إلى وجهة هي استخدام التعديل اللاحق للترجمة. ماذا يعني هذا؟ ما يعنيه هو أن البروتين مصنوع. إنه جاهز. إنها تنتظر. لكننا لم نفكر في مصيرها النهائي. لم نقم بتشغيله ليذهب إلى حيث يجب أن يكون. لكننا ننتظر إنزيمًا لإجراء تعديل بسيط على ما يبدو لذلك البروتين. وبعد ذلك سيذهب البروتين إلى مصيره.

وقد عرضت عليكم هنا أمثلة لثلاثة أنواع من التعديلات. واحد سنتحدث عنه اليوم ، لأنه من السهل جدًا فهمه ، وهو ترطيب الدهون. وبعد ذلك ، سنتحدث عن الاثنين الآخرين ، في المرة القادمة ، الفسفرة والتواجد في كل مكان.

وهذه كلها ما يُعرف باسم PTMs ، تعديلات ما بعد الترجمة. وهي تغييرات تحدث في سلسلة جانبية من الأحماض الأمينية داخل بروتين مصنوع بالفعل لتغيير مصيره. وأود أن أتحدث عن الدهون أولاً ، لأنني سأذكرك بالأغشية الخلوية. لذا تذكر ، لقد تحدثنا عن هذه الحواجز شبه النفاذة الموجودة حول العضيات وحول الخلايا.

ودعونا نقول أن هذا غشاء - يجب أن أضعه - الموجود بين السيتوبلازم وخارج الخلية. ولنفترض أن لدي بروتينًا كامنًا في السيتوبلازم ، لكنني أحتاجه في الغشاء. أحتاجه للمشاركة في عملية إرسال الإشارات. وأنا أحتاجه الآن لأكون هناك.

إذا كان لدي بروتين قابل للذوبان ، فهو غير مرتبط بالغشاء. لكن يمكنني استخدام إنزيم آخر لربط ذيل دهني كاره للماء بهذا البروتين. لذا ما تريد فعله حقًا هو الوصول إلى الغشاء الطارد للماء. الدهن مثل هذا التعديل.

إنه مجرد تعديل بحمض دهني طويل السلسلة ، غالبًا C16 ، C18 ، الذي يجعل البروتين محبًا للدهون ويجعله يرغب في الحركة ، وإدخال هذا الذيل المحب للدهون في الغشاء ، وجزءًا من بروتين غشاء البلازما. ومع ذلك ، فإن المعلومات لا تزال مشفرة داخل البروتين.

كيف يمكن أن يحدث ذلك؟ كيف يمكنني جعل هذه المعلومات موجودة في البروتين؟ ماذا يمكن أن تكون الإستراتيجية هناك؟ لا يزال مشفرًا ، لكنه سري. إنه غامض. أيه أفكار؟

لذلك لن أقوم بتجميع هذه المجموعة على بروتين. سأضعها في مكان محدد. وهكذا في كثير من الأحيان ، تحدث تفاعلات الدهون في الموقع - على وجه التحديد في مواقع معينة ضمن تسلسل ، ويتعرف الإنزيم على هذا الموقع وينقل الجزيء الدهني إليه.

لذلك قد تحدث عملية الدهن بالفعل ، على سبيل المثال ، النهاية الأمينية للبروتين. ولكن إذا كانت هناك سمات معينة داخل هذا البروتين ، فيمكنك حينئذٍ إرفاق المجموعة الدهنية. مرة أخرى ، باستخدام المعلوماتية الحيوية ، يمكنك إلقاء نظرة على البروتين المستهدف الذي يهمك والتنبؤ بأنه هدف تفاعل تعديل ما بعد الترجمة.

مرة أخرى ، المعلومات مبرمجة في التسلسل ، لكنها غامضة تمامًا. يمكن أن يكون في منتصف التسلسل. يمكن أن يكون هناك بعض القرائن فقط. لكن القرائن موجودة مع ذلك يمكن تحليلها باستخدام تعلم الكمبيوتر وفحص التسلسلات للقول إن هذا هدف للشفرة أو الفسفرة أو ما شابه.

هل هذا واضح للناس؟ هل هذا منطقي؟ المعلومات مشفرة ، لكن لا يمكنك أن ترى أنها هناك. لكن ميزة التعديلات اللاحقة للترجمة هي أنها تحدث عند الطلب ، بدلاً من صنع بروتين جديد de novo ، ثم نقله إلى موقع خلوي معين.

في وقت لاحق ، عندما نتحدث عن الفسفرة ، سترى أن الفسفرة هي الخبز والزبدة للإشارات الخلوية. إنه مفتاح الضوء في كل غرفة في الخلية الذي يتم تشغيله وإيقافه من أجل جعل الوظائف تحدث داخل الخلية. وهذا حقًا تعديل رئيسي وديناميكي لما بعد الترجمة وله معنى كبير.

لذا السبب في هذه الصورة الصغيرة - أردت فقط أن أريكم الغشاء وأذكركم فقط أن الغشاء عبارة عن بنية فوق جزيئية مجمعة بنواة كارهة للماء ومجموعات رأس قطبية على كلا الوجهين ، كما أشرت إلى حد ما في هذا الكارتون. فلنبدأ بتسلسلات قد تأخذنا إلى النواة.

الآن ، الغشاء النووي كيان غريب نوعًا ما. لأن الغشاء النووي ليس غشاء بسيط مثل غشاء البلازما. إنه في الواقع غشاء مزدوج الطبقات. لذا إذا نظرتم إلى غشاء نووي - وسأقوم بعمل مجرد إظهار جزء من الغشاء النووي.

داخل الغشاء النووي ، هناك مسام ، وفتحات إطلاق تمامًا. والغشاء هو في الواقع غشاء مزدوج ، حيث كل هذه الطبقات الدهنية الثنائية. لذلك فهو ليس غشاء واحد. إنه غشاء مزدوج بفتحات كبيرة.

وقد تقول ، حسنًا ، لا فائدة من ذلك. هناك فقط هذه الثقوب الكبيرة والفجوة في النواة. أي شيء يمكن أن يأتي ويذهب إذا أراد. لكن المسام النووية هي نوع من الهيكل الخاص. لأن لديهم بروتينًا مضطربًا نوعًا ما ، فإن ذلك يخلق شبكة متشابكة. هذا يعني أن هذا المسام ليس مفتوحًا تمامًا ، ولكن هناك بعض الأشياء التي يجب أن يمر بها شيء ما من جانب إلى آخر.

وزميلي توماس شوارتز في علم الأحياء يعمل على التركيب الجزيئي للمسام النووية لفهم هذه الهياكل. لأنها مصنوعة أيضًا من خلال رعاية وجود الكثير من البروتينات التي تساعد في إنشاء هذا الهيكل. وإلا فلن يبقى هذا الغشاء في شكله الصحيح.

لذا لكي يدخل البروتين إلى النواة ، إذا احتاج إلى ذلك ، أو ترك النواة ، يجب أن يكون لديه نوع من الآلية للمرور عبر هذا الهيكل الذي يسد المسام النووي. إذن هذا سيكون داخل النواة. وسيكون هذا هو السيتوبلازم.

لذا كما هو موضح في هذه الشريحة ، النواة ، هناك تسلسل بروتين معين ملحق بالبروتين. يُعرف هذا باسم تسلسل التوطين النووي ، أو NLS. وما هو تسلسل NLS ، إنه تسلسل قصير من الأحماض الأمينية التي تمكن البروتين من الوصول إلى وجهته الصحيحة.

وهذه التسلسلات معروفة جيدًا. قد ينتهي بهم الأمر إلى أن يكونوا متواليات أساسية للغاية. إذن مثال على NLS سيكون Lys - إنه ليس مثيرًا للغاية ، لكنه يستمر ، Lys ، Lys ، Lys ، arginine ، lysine. ويمكن أن تحدها مخلفات كارهة للماء أو أنواع أخرى. لذلك سيكون هذا تسلسل NLS نموذجي في بروتين.

وأريد أن أذكرك أن ليسين وأرجينين لهما سلاسل جانبية مشحونة إيجابياً في درجة الحموضة الفسيولوجية. لذا فإن تسلسل التوطين النووي هو شيء يمكن التعرف عليه بسهولة بسبب هذا النوع من التسلسل القصير الذي قد يكون عند الطرف N أو C. أعتقد أن هناك أي احتمال. لكنه تسلسل واضح للغاية. يمكنك إلقاء نظرة على تسلسل البروتين الخاص بك والقول ، هناك NLS في هذا التسلسل.

وتسلسل NLS وحده هو المسؤول عن إدخال البروتينات وإخراجها من المسام النووي. دعونا نركز في الغالب على الدخول في النواة. في الأساس ، لديك بنية بروتينية لها تسلسل NLS في محطة واحدة. وهذا التسلسل NLS يرتبط ببروتين آخر.

بشكل إبداعي ، كان لديك فرصة صغيرة لإعطاء أسماء البروتينات في الامتحان. إنه يسمى الاستيراد. لذلك فهو بروتين مستورد يرتبط بـ NLS ، ونتيجة لذلك ، سوف ينقل البضائع. سترافق الشحنات إلى نواة الخلية. وترسله عبر شبكة البروتينات هذه.

هذا عمل شبكي فضفاض للغاية للبروتينات. وهي ليست بروتينات مرتبة. إنها بروتينات شديدة الاضطراب. لذا فهم يصنعون مرشحًا أكثر من كونه قابسًا. لكنها بالتأكيد شيء لا يسمح لأي بروتين قديم بالمرور عبر تلك المسام النووية.

من السهل جدًا التعرف على علامات NLS ، مرة أخرى ، من خلال تحليل المعلوماتية الحيوية. والشيء الرائع حقًا هو أنه يمكنك إعادة برمجة البروتين ليكون في المكان الذي تريده من خلال معالجة NLS. لذا فهذه مجموعة جيدة من التجارب.

لنفترض أن لدينا بروتينًا سنحقنه في سيتوبلازم الخلية. ونريد برمجته إما للذهاب إلى النواة أو البقاء خارج النواة. يمكن القيام بذلك بسهولة عن طريق إرفاق تسلسل توطين نووي بالبروتين مع صبغة الفلوروفور أو البروتين الفلوري الذي يسمح لك بمراقبة تلك التجربة. إذا قمت بحقن دقيق في السيتوبلازم ، فإن هذا البروتين الذي يحتوي على NLS سوف يصطدم بالنواة من خلال ارتباط NLS مع الاستيراد. ولكن إذا قمت بقطع NLS ، وهو البروتين العالق ، فسيظل خارجًا في السيتوبلازم.

لنفترض أنك تريد دراسة بروتين جديد. أريد فقط أن أوضح لكم أن تسلسل NLS هذا مستقل تمامًا عن البضائع التي يحملونها. يمكنك فقط لصق NLS على بروتينك المفضل الذي تريد استجوابه.

لنأخذ بيروفات كيناز. ليس له أي علاقة بنقل محدد إلى النواة. لكن مع ذلك ، إذا وضعت - إذا لم يكن يحتوي على NLS ، فسيتم تمييزه بشكل فلوري ، ويبقى في الخارج في السيتوبلازم. لكن إذا أجريت تحليلًا عليه ، فإنك تركز على تلك المنطقة من الخلية.

لذا توضح لك هذه التجارب أن ما نعرفه عن تسلسل الاستهداف يمكن التلاعب به واستخدامه لتمكينك من تحريك الأشياء في الخلية. هذا نوع معين من الآليات. الآلية التالية التي أريد أن أصفها لكم هي الآلية المستخدمة لنقل الميتوكوندريا. وهي مختلفة قليلاً في استراتيجيتها.

إذن للوصول إلى الميتوكوندريا ، هناك ، مرة أخرى ، تسلسل التعرف ، في هذه الحالة ، تسلسل توطين الميتوكوندريا الذي له خصائص معينة.في هذه الحالة ، تسلسل توطين الميتوكوندريا ، دعنا نقول أنه عند الطرف N من البروتين الخاص بك. وسيكون شيئًا قد يكون مزيجًا من الشحنات. بعض Arg و Glu و Arg و Glu. إذن هذا هو تسلسل MLS نموذجي.

وفي هذه الحالة ، تختلف الشحنة عند درجة الحموضة الفسيولوجية عن تسلسل التوطين النووي ، لأنها شحنة متبادلة موجبة وسالبة. إذن هذا مختلف تمامًا عن هذا. لا تقول المعلوماتية الحيوية لمعرفة ذلك. لذا يمكنك بعد ذلك انتقاء تسلسلات توطين الميتوكوندريا.

وفي هذه الحالة ، تذكر أن الميتوكوندريا تصنع بعض البروتينات الخاصة بها على حمضها النووي الدائري. لكنهم تخلوا عن التعبير عن كل البروتينات المطلوبة في الميتوكوندريا. ويتم نقل بعض البروتينات إلى الميتوكوندريا باستخدام هذه الأنواع من التسلسلات. لكن النهج والاستراتيجية يختلفان عن الدخول في النواة.

في هذه الحالة ، يرتبط تسلسل MLS بقناة بروتين في حالة مغلقة. إذن هذا غشاء. ها هي مزايا القناة. لكنها في حالة مغلقة.

ولكن بمجرد أن يرتبط البروتين مع تسلسل NLS بذلك ، تفتح تلك القناة. يتم تشغيله من خلال ارتباط هذا التسلسل بجزء من البروتين خارج هذا الغشاء. وهذا يسمح بعد ذلك للبروتين أن يتكشف وينتقل إلى الميتوكوندريا ، حيث يمكن إزالة هذا التسلسل. ومن ثم ينعكس البروتين في الميتوكوندريا.

لذا فهي استراتيجية مختلفة جدًا لذلك وتسلسل التوطين النووي. لذلك ستجد ، بالنسبة للعديد من العضيات المختلفة في الخلية ، قد تكون هناك تسلسلات توطين محددة جدًا يمكنك البحث عنها والتعرف عليها. لكن هناك أمر واحد أود أن أذكره لك وهو أن تفاصيل الأقلمة هذه مهمة جدًا. والعديد من الأمراض في الخلايا هي نتيجة عدم توطين البروتينات في المكان الصحيح.

إذا لم تكن في المكان المناسب في الوقت المناسب ، فستبدأ الأمور في الخطأ فيما يتعلق بالإشارة أو عمليات الخلية. لذلك كثيرا ما ترتبط الأمراض بالتوطين الخاطئ. إذن ما سنفعله الآن هو في الأساس أن نقول ، لقد اهتممنا بفهم الأشياء المصنوعة في الخلية. إنهم إما يبقون في العصارة الخلوية أو سيذهبون إلى العضيات بناءً على أنواع معينة من الاستراتيجيات التي تعتمد إلى حد كبير على تسلسلات العلامات القصيرة ، ولكن في حالات أخرى ، قد تعتمد على التعديل بعد الترجمة.

حسنا. إذن هذا رسم كاريكاتوري. لكن في الواقع ، أريد أن أفعل شيئًا مختلفًا قليلاً إذا لم يستغرق وقتًا طويلاً.

الآن ، عندما تحدثنا لأول مرة عن الترجمة على الريبوسوم ، ما تراه هناك باللونين الأخضر والأصفر هو الريبوسوم. الفرقة المظلمة هي رسول RNA. الأزرق الداكن عبارة عن جزيئات RNAs يتم نقلها والتي يتم مساعدتها مع عوامل الاستطالة للوصول إلى الريبوسوم. لكن ما أريد أن أشير إليه هنا هو التسلسل الناشئ لعديد ببتيد يخرج عبر نفق على الريبوسوم.

الآن ، إذا كان البروتين سيتجه خارج الخلية ، فسيتم التعبير عنه بما يعرف بتسلسل الإشارة. إنه عبارة عن تسلسل 20 بقايا حمض أميني يتعرف عليه جسيم التعرف على الإشارة. ثم تبطئ الترجمة وتثبت الريبوسوم على غشاء الشبكة الإندوبلازمية بحيث يبدأ الببتيد الجديد بالتسلل إلى الشبكة الإندوبلازمية من خلال ما يُعرف باسم الترانكونون. لذلك أنت الآن لا ترسل البروتين إلى السيتوبلازم ، لكنك ترسل البروتين إلى الشبكة الإندوبلازمية. وأنت ترسله أيضًا إلى هذا الفرع من مسار التخليق الحيوي للبروتين.

ترى هذه القطعة من البروتين في الظهور. هذا الجزء الفقس هو السيتوبلازم. الجزء الرمادي هو الشبكة الإندوبلازمية. لذلك هناك آلية معقدة تعمل على تمكين البروتينات من صنعها في السيتوبلازم ولكنها الآن تستهدف موقعًا جديدًا تمامًا. وهذه هي البروتينات التي ستبقى إما في غشاء البلازما أو يتم إفرازها من الخلية.

وهذا المنظر هنا يمنحك أكثر قليلاً من الرسوم المتحركة. إذاً الريبوسوم - إشارة ببتيد مكون من سلسلة ببتيد أخضر يبلغ طولها حوالي 20 حمضًا أمينيًا. هذا يسمى في الواقع إشارة الببتيد. إنها تشير للتوليف من خلال شبكة الغشاء الداخلي.

يؤدي ذلك إلى ترسيم الريبوسومات على غشاء العصارة الخلوية ER والاستمرار في تصنيعها بحيث يتم تصنيع البروتينات في نظام الغشاء الداخلي هذا. ويمكنك التفكير في نظام الغشاء الداخلي الكهفي هذا على أنه أنفاقك خارج الخلية إما للعرض على سطح الخلية أو للإفراز بالكامل في الحويصلات. لذلك دعونا نلقي نظرة على كيفية حدوث ذلك.

عندما تصنع بروتينًا بهذه الطريقة ، ترى النقاط المظلمة ، ER الخام؟ هذه ريبوسومات متصلة بالغشاء. تصنع البروتينات في الغشاء. ومن ثم فإن نظام الغشاء الداخلي ليس مجرد نفق أو متاهة. لكن في الواقع ، تنفث كل طبقة من هذه الطبقات حويصلات تندمج مع الطبقات التالية لتشق طريقها تدريجيًا خارج الخلايا.

لذلك هنا ترى هناك حويصلات. أنت دائمًا تحتفظ بالبروتينات المرتبطة بالغشاء بينما تمر عبر نظام الغشاء الداخلي. وهنا حويصلة بها بروتين. قد يطلقه إما إلى خارج الخلية ، أو قد يرتبط البروتين بغشاء الحويصلة ويبقى متوقفًا في غشاء البلازما.

ولذا أريد فقط أن أعطيكم شريحة أخيرة حيث أتحدث عن التكوّن الحيوي لبروتينات الغشاء. الآن ، هذه أشياء معقدة جدًا. لأنه عليك أن تتذكر ما في الداخل والخارج. لذلك قضيت وقتًا أطول مما يجب أن أقضيه في هذا الكارتون لأوضح لكم أي طرف من البروتين ينتهي به الأمر خارج الخلية وأي طرف داخل الخلية ، وكيف تصنع بروتينات متعددة الأغشية.

لذلك دعونا نلقي نظرة على هذا بالتفصيل الآن ، بالنظر - ها هو الريبوسوم. ها هو البروتين الناشئ. إذا كان هناك تسلسل إشارة هناك ، فإن هذا الريبوسوم يرسو على الغشاء ويبدأ في ترجمة البروتين ، المحطة الأمينية أولاً ، إلى الشبكة الإندوبلازمية. كلنا موافق على ذلك.

مع استمرار التوليف ، قد نصل إلى كود الإيقاف على الرنا المرسال. وما قد يحدث هو أن البروتين قد يظل مرتبطًا بالغشاء. ستكون المحطة الأمينية في ER. وستبقى المحطة C على الجانب الآخر. هناك عدد من التكوينات المختلفة.

ولكن إذا أردنا البدء في نقل هذا البروتين إلى سطح الخلية ، فسيظل ذلك مرتبطًا بالغشاء ولكن ليس في شكل الغشاء المسطح الذي تم نقله إليه. لكن هذا الغشاء قد يقرص في حويصلة كروية. ولكن لا يزال لديك الطرف C بالخارج والطرف N بالداخل. سيعمل ذلك بعد ذلك في طريقه عبر نظام الغشاء الداخلي ، وفي النهاية يندمج مع العصارة الخلوية. هذا هو الجزء الممتع حقا.

وبعد ذلك ، بمجرد اندماجها مع العصارة الخلوية ، يكون لديها خيار عرضها على السطح الخارجي للخلية. لماذا ا؟ لديك بروتين. المحطة N في الخارج. المحطة C في الداخل.

هذا يوضح لك التكوّن الحيوي لبروتين سطح الخلية العالق في الغشاء من خلال المجال المرتبط بالغشاء. إذا كنت لن تبقى مع الغشاء ، يمكنك في الواقع أيضًا إطلاقه ببساطة في الحويصلة لإطلاق بروتين قابل للذوبان. لن أخوض في هذا. ولكن هناك خطوات معجزة تنتهي بالتكوين الحيوي للبروتينات متعددة الأغشية.

لأن كل مجال من مجالات الغشاء هذه يتم صنعه في الترانكونون ويتم نقله بشكل جانبي. وتبدأ في تجميع مجالات الغشاء التي تمتد عبر الغشاء. وفي الفصل التالي ، سنرى مدى فائدة هذه البروتينات في الإشارات الخلوية. لذا فهذه بروتينات مهمة جدًا يجب التفكير فيها.

شيء أخير - لذلك دعونا نفكر في هذا. لأي من التكوينين ، إما التعديل اللاحق للترجمة أو باستخدام تسلسل الاستهداف ، متى نحدد أين سينتهي البروتين؟ أين هي المعلومات التي تم تعريفها لأول مرة؟ أي شخص يريد أن يجيبني ويشرح لي لماذا؟ نعم؟

الجمهور: هل سيكون B ، تسلسل mRNA ، لأن ذلك سيحتوي على جزء كبير من التضفير؟

باربرا إمبريالي: إنها محاولة جيدة. لكنك تريد أن تتذكر ، نعم ، الربط مهم. ولكن متى كان التسلسل فعليًا في كامل ما قبل الرنا المرسال؟ متى سيتم تعريف ذلك؟ نعم؟ آسف. كارمن؟

الجمهور: هل هو موجود في تسلسل الحمض النووي الجيني؟

باربرا إمبريالي: نعم. لأنك لا تملك أبدًا معلومات في الحمض النووي الريبي لم تكن موجودة في الحمض النووي. لذا فقد حصل الحمض النووي على المعلومات هناك. نعم ، قد تحتاج إلى القليل من الربط لوضع الأشياء في المكان المناسب. لكن المعلومات موجودة في الحمض النووي.

لذلك تريد أن تتذكر ، مع كل معلومات الاستهداف هذه ، فهي موجودة في المعلومات الجينومية الأكثر شيوعًا. إنها المعلومات الجينومية التي لها أنماط التسلسل لتعديل ما بعد الترجمة. إنها المعلومات الجينومية التي تحتوي على أشياء مثل NLSes و MLSes. إنهم هناك بالفعل.

لكنها غالبًا ما تكون مشفرة. ومع ذلك ، كانت هناك نقطة لطيفة للغاية. إذا كنت ترغب في إرسال جزء واحد من الجينوم الذي يشفر إما بروتينًا سيتم تصديره من خلال المسار الإفرازي أو البقاء في العصارة الخلوية ، فيمكنك لصق تسلسل إشارة داخل أو خارج. هذه طريقة جيدة حقًا ، باستخدام نفس تسلسل الحمض النووي الأصلي ، للوصول فعليًا إلى البروتينات التي تحقق مصائر نهائية مختلفة داخل الخلية. لذا في المرة القادمة ، سوف نتحدث عن الإشارات. سيكون انفجارًا.


الانتماءات

المركز متعدد التخصصات لعلم الجينوم النباتي وقسم البيولوجيا الجزيئية النباتية ، جامعة دلهي ، الحرم الجنوبي ، نيودلهي ، الهند

بريانكا ديفيشوار ، شيفام شارما ، أنكيتا بروستي ، نيها سينها ، سجاد مجيد زارغار وأمب أخيليش كومار تياجي

معمل البروتينات ، قسم التكنولوجيا الحيوية النباتية ، جامعة شير كشمير للعلوم الزراعية وتكنولوجيا الأمبير في كشمير ، شاليمار ، سريناغار ، جامو وكشمير ، الهند

معهد المعلوماتية والاتصالات ، جامعة دلهي ، الحرم الجنوبي ، نيودلهي ، الهند


البيانات الموسعة الشكل. 1 الاسترجاع والخصائص الهيكلية للمصنع الذي يحتوي على IDR GBPLs.

أ، خط أنابيب الفرز في السيليكو المستندة إلى النازحين من أرابيدوبسيس بروتين. ب، شجرة النشوء والتطور التي استنتجها تحليل بايزي. قيمة الدعم: الاحتمالات اليسرى والعقدية الخلفية اليمنى ، وقيم التمهيد القصوى للاحتمالية. شريط مقياس ، بدائل لكل موقع. عدد الأحماض الأمينية (#aa) التي لم يتم رسمها على نطاق واسع. ج3D هيكل التنبؤ أرابيدوبسيس تم تنفيذ GBPLs على خادم الويب I-TASSER وعرضها باستخدام برنامج PyMOL. GD ، مجال GTPase. HD ، المجال الحلزوني. IDR ، منطقة مضطربة جوهريًا. hGBP1 ، 1F5N.PDB. د، تكوين المجال وحجم أرابيدوبسيس عائلة GBPL مقابل GBP1 الإنسان. ه، تم تنفيذ مخططات اضطراب GBPL والكاره للماء باستخدام خوادم ProtScale و PONDR ، على التوالي. يتم عرض الأحماض الأمينية المشحونة (أحمر ، جلوتامات / أسبارتاتي أزرق ، أرجينين / ليسين) كخطوط عمودية فوق الألواح. IDRs مظللة.

البيانات الموسعة الشكل. 2 توليد وتوصيف Arabidopsis gbpl المسوخ.

أ، لطخة مناعية لمستوى بروتين GBPL3 باستخدام جسم مضاد متعدد الأضلاع للأرنب α-GBPL3 في النوع البري (WT) (Col-0) وأربعة محولات T1 مستقلة تم إنشاؤها عبر CRISPR / Cas9 التي تستهدف GBPL3 (الوزن الجزيئي المتوقع 122 كيلو دالتون). يعمل تلطيخ Ponceau S على نطاق غير محدد (nsb) كعنصر تحكم في التحميل. البروتينات المستخرجة من نباتات عمرها خمسة أسابيع. أجريت التجربة مرة واحدة فقط بسبب محدودية مواد الأنسجة من النباتات المعقمة. ب، متواليات PAM من gRNAs وعواقب انقسامات CRISPR-Cas في الجيل T1. السطر 15 ثنائي الزيجوت والخط 16 متغاير الزيجوت. ج، كروماتوجرامس للتسلسل الخطر لمواقع الطفرات في خطوط كريسبر في ب. د، الوزن الطازج للنباتات (متوسط ​​± SD) الموضح أعلاه (الرسم البياني أعلى اليمين هو نفسه الشكل 1 ب للمقارنة مع اليسار). هالتعبير الجيني GBPL1 و GBPL2 في طفرات T-DNA. F، Immunoblot (α-GBPL3) لمستويات GBPL3 و EGFP-GBPL3 في النباتات المكملة. يعمل تلطيخ Ponceau S لـ RbcL كعنصر تحكم في التحميل. ز، نمو المزمور ES4326 (المزمور) في اليوم الثالث من الإصابة. اللقاح ، أسفل اليسار. ح, هبا الأبواغ Noco2 في 2

نباتات عمرها 3 أسابيع في اليوم 7. لقاح ، أسفل اليسار. أنا، بروتينات GBPL ليست مطلوبة من أجل PST DC3000 Avr التحدي باستخدام gbpl خطوط متحولة. نمو PST-Avr في اليوم الثالث من الإصابة. اللقاح ، أسفل اليسار. زأنا، المربع = أشرطة النسب المئوية 25 و 75 = الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم. التحليل الإحصائي ، مقارنة المتوسط ​​عن طريق اختبار ANOVA أحادي الاتجاه (Bonferroni post hoc correction). ns ، غير مهم. تمثل نقاط البيانات الفردية عينات مستقلة بيولوجيًا (د, زأنا).

البيانات الموسعة الشكل. 3 تحليل التعبير الجيني RNA-seq والتحليل الجيني الدفاعي في النباتات المعدلة وراثيًا.

أ، خريطة حرارة مقارنة لأعلى 1000 جينة معبر عنها تفاضليًا (RNA-seq base log2) عبر أرابيدوبسيس الأنماط الجينية من مكررين مستقلين بيولوجيًا. ب، GO تخصيب الجينات المنتظمة في Col-0 /pGBPL3 :: GBPL3 (GBPL3 ثور ) (يسار) و gbpl1-1 (يمين) نباتات مقابل وزن. يتم عرض أفضل 25 مصطلح GO مخصبًا بشكل كبير. تم العثور على مصطلحات GO الغنية باللون الأحمر في كليهما GBPL3 ثور و gbpl1-1 النباتات. ج, د، التعبير الجيني الدفاعي (يعني ± SD) في ظل الظروف القاعدية والمستحثة. استخراج الحمض النووي الريبي بعد 4 ساعات وهمية (MgCl2) أو المزمور ES4326 (OD600 = 0.1) عدوى. تطبيع التعبير ل أكتين 7. ه, F، التعبير الجيني الدفاعي (يعني ± SD) في ظل الظروف القاعدية والمستحثة الموضحة كسجل2 التحولات للمقارنة. ز, حالتعبير النسبي (يعني ± SD ، تطبيع إلى أكتين 7) في قسمين مختلفين gbpl3 المسوخ. استخراج الحمض النووي الريبي بعد 24 ساعة وهمية (MgCl2) أو المزمور ES4326 (OD600 = 0.001) إصابة من نباتات عمرها 4 أسابيع. التحليل الإحصائي للطالب ثنائي الذيل ر-اختبار (ج, ه) ، ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Holm – Sidak اللاحق (ز) و ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار Holm – Sidak اللاحق (د, F, ح). تمثل نقاط البيانات الفردية عينات مستقلة بيولوجيًا مع تجارب أجريت مرتين مع نتائج مماثلة (جح).

البيانات الموسعة الشكل. 4 التحليل النووي GBPL1 – GBPL3 في أرابيدوبسيس و بنثاميانا.

أ، التصوير الحي لـ EGFP – GBPL3 في نواة Col-0 المعدلة وراثيًا عمرها أسبوعين أو gbpl1-1 النباتات تحت الظروف القاعدية. بار ، 5 ميكرومتر. ب، استراتيجية التجزئة المتسلسلة لفحص خصائص ربط الكروماتين لـ GBPL1 و GBPL3 في الشكل 2. باستخدام Col-0/ pGBPL1: GBPL1-3 × علم النباتات لضمان التعبير الفسيولوجي. ج، الترسيب المناعي النووي المشترك لـ GBPL3 مع FLAG-M2 agarose (أسفل) و GBPL1 مع الجسم المضاد α-GBPL3 (أعلى). خدم Streptavidin agarose والأرنب العادي IgG كعناصر تحكم سلبية. د، انقسام المقايسة التكميلية لوسيفيراز في بنثاميانا. (أعلى) صورة التلألؤ بنثاميانا الأوراق متسللة بشكل مشترك مع سلالات جرثومية تحتوي على البلازميدات الموضحة أدناه. (أسفل) القياس الكمي لنشاط LUC (يعني ± SD ، ن = 4 أقراص أوراق مستقلة بيولوجيًا). ه، الدورة الزمنية لمستويات GBPL3 الإجمالية بواسطة طعنة مناعية بعد المعالجة بحمض الساليسيليك (0.5 مم). يعمل Ponceau S الملون RbcL كعنصر تحكم في التحميل. F، طعنة مناعية لإجمالي مستويات البروتين GBPL3 بعد 24 ساعة المزمور ES4326 (OD600 = 0.01) إصابة من نباتات عمرها 4 أسابيع. ز، أعلى ، استبعاد mRFP-GBPL1 إلى محيط المكثفات النووية EGFP-GBPL3 عند التعبير المشترك في بنثاميانا أوراق. شريط النطاق ، 2 ميكرومتر. يستخدم الشريط الداخلي لمخطط تشكيل الخط المتوسط. أسفل ، ملف تعريف الخط المتوسط ​​(2 ميكرومتر) لشدة التألق التي تغطي مكثفات GBPL3. شريط = يعني ± sd (ن = 5 مكثفات مستقلة بيولوجيا). منطقة مظللة بالسهام ، قلب مكثف GBPL3.

البيانات الموسعة الشكل. 5 قطيرات GBPL عبارة عن هياكل LLPS فريدة يتم حفظها عبر أنواع النباتات وأنواع الخلايا وأثناء التطور.

أ، تلطيخ كوماسي من بروتين rEGFP المنقى. ب، منحنى قياسي من rEGFP عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. ج، القياس الكمي (متوسط ​​± SD) لتركيز EGFP-GBPL3 لمدة 24 ساعة بعد حمض الساليسيليك (0.5 مم) ، المزمور (OD600 = 0.001) و PST (OD600 = 0.001) من نوى نباتية متعددة عمرها 4 أسابيع. مقارنة المتوسط ​​عبر اختبار ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Holm – Sidak اللاحق. تمثل نقاط البيانات الفردية عينات مستقلة بيولوجيا. د, ه، تحليل Colocalization من EGFP-GBPL3 في بنثاميانا (د، خلية حية) وخلايا هيلا (ه، خلية ثابتة). هذا الأخير مكّن من اكتشاف الأجسام المضادة الموازية للهياكل دون النووية. DSB ، كسر حبلا مزدوج. دنا ملطخ بصبغة Hoechst 33342. بار ، 5 ميكرومتر (د, ملحوظة.) و 2 ميكرومتر (ه، هيلا). F، التألق المناعي لـ GBPL3 الأصلي في Col-0 و Col-0 /GBPL3 ثور النباتات. تم عزل النوى من نباتات عمرها 3 أسابيع مزروعة في التربة و DNA ملطخة بـ Hoechst 33342. chr ، chromocentre (أسهم بيضاء). بار ، 2 ميكرومتر. كرر التجربة مرة واحدة مع نتائج مماثلة. زاليسار مكثفات GBPL3 بتنسيق أرابيدوبسيس النبتات معبرة بثبات 35S :: EGFP-GBPL3. المعروضة هي أقصى صور الإسقاط. دائرة متقطعة ، حدود نووية. بار ، 5 ميكرومتر. صحيح ، مكثفات GBPL3 التي يسببها حمض الساليسيليك (تعني ± SD ، للطالب اختبار tذيلان) في زنازين الحراسة من عمر 10 أيام أرابيدوبسيس الفلقات (ن = 4 نباتات مستقلة بيولوجياً مع 100 خلية حراسة لكل منها). معالجة المياه وهمية. ح، توطين الطماطم الموسومة بـ EGFP والذرة الجنيه الاسترليني في خلايا هيلا. دنا ملطخ بصبغة Hoechst 33342. بار ، 5 ميكرومتر (SlGBP2 و ZmGBP1) و 2 ميكرومتر (SlGBP1 و ZmGBP2). أنا، يتم التعبير عن صور الإسقاط القصوى لشدة EGFP-GBPL3 بشكل عابر بـ بنثاميانا (ملحوظة.) وخلايا هيلا البشرية وخلايا HEK 293T. بار ، 2 ميكرومتر. ي، المجهر الإلكتروني للإرسال بالذهب المناعي لـ GDACs الكروية (الدوائر المتقطعة) المعبر عنها في خلايا HEK 293T. NE ، مغلف نووي. NPC ، مجمع المسام النووي. شريط ، 500 نانومتر. ك، كانت مكثفات GBPL3 حساسة لـ 1،6-hexanediol (5٪) ولكن ليس 1،2،6-hexanetriol (5٪). تم استخدام Digitonin (10 ميكروغرام / مل) لتسهيل توصيل المواد الكيميائية.

البيانات الموسعة الشكل 6 سلوك LLPS المقارن لـ GBPLs في الخلايا والأنظمة الخالية من الخلايا.

أ، عرض حجم ثلاثي الأبعاد لقطرات rEGFP-GBPL3 (10٪ Ficoll) موضحة في (الشكل ثلاثي الأبعاد). بار ، 2 ميكرومتر. ب، مخطط فصل الطور (PS) لـ rEGFP-GBPL3 عبر تركيزات كلوريد الصوديوم بعد 30 دقيقة من إعادة التكوين. ج، صور متحد البؤر تظهر سلوك اندماج مكثفات GBPL3 كل 100 ثانية في المختبر.تم جمع الصور بعد 30 دقيقة من إعادة التكوين في المخزن المؤقت للقطرات (20 مم HEPES [درجة الحموضة 7.5] ، 200 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 مم TCEP ، 10 ٪ Ficoll). بار ، 5 ميكرومتر. د، RFP-GBPL1 لا يولد LLPS المكثفات النووية في الموقع في بنثاميانا. ه، فصل الطور في المختبر لـ rRFP – GBPL1 (375 نانومتر) في محلول القطيرات (20 ملي مولار HEPES [درجة الحموضة 7.5] ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار TCEP). يظهر اللون الأزرق اللامع Coomassie (CBB) الخاص بـ rRFP – GBPL1 على اليسار. شريط ، 10 ميكرومتر. F، اختبار التكثيف المشترك لـ rEGFP-GBPL3 و rRFP-GBPL1 في المختبر. أدناه ، القياس الكمي لحجم قطرات EGFP – GBPL3. القيم المتوسطة (الخط الصلب) والربيعية (الخط المتقطع). مقارنة المتوسط ​​عبر ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Holm – Sidak اللاحق (****ص & lt 1.0 × 10 −15 ، ن = عدد القطرات المستقلة بيولوجيًا). ز، تؤدي الصفحة الأصلية لـ rEGFP − GBPL3 في وجود تركيزات متزايدة من rRFP GBPL1 إلى إزاحة GBPL3. ضوابط التحميل نفسها الموجودة أسفل الهلام الأصلي (المضاد لـ GFP) والمعاد فحصه (المضاد لـ RFP) مفصولة بـ SDS – PAGE. ح، استبعاد rRFP − GBPL1 من قطرات rEGFP − GBPL3 الأكبر في فحوصات التكثيف المشترك. أنا، صور EM وصمة عار سلبية الممثل لقطرات rGBPL3 في 24 ساعة. بار ، 2 ميكرومتر. أقحم على اليمين. شريط ، 100 نانومتر. ي، تحليل FRAP لقطرات rEGFP − GBPL3 القديمة لمدة ساعتين في المختبر. بار ، 5 ميكرومتر. يظهر الاسترداد الفلوري لـ 5 قطرات فردية. إدراج ، صور تمثيلية لقطيرة مبيضة أكثر من 10 دقيقة الانتعاش.

البيانات الموسعة الشكل 7 تحليل في الموقع cryo-ET لـ GDACs بما في ذلك دعم CLEM.

أ، مخطط التدفق لتحليل cryo-ET في الموقع. ب, ج، صور CLEM لشبكات EM المصنفة بخلايا HEK 293T المنقولة بواسطة CMV-EGFP-GBPL3. عرض خلية واحدة لـ (ب) ظاهر أدناه (ج). تتشكل هياكل GDAC النووية هذه بطريقة مستقلة عن الأنواع والمملكة مع هياكل مماثلة تم إنشاؤها بواسطة أخصائي تقويم العظام في مصنع GBPL3 ومن ثم يبدو أنها تشترك في الميزات المحفوظة مع تلك التي تم إنشاؤها مباشرة في النبات. د، مخطط الصفيحة FIB-Milled. ه، صور CLEM للصفيحة المطحونة بـ FIB وتراكب مع صور مونتاج Cryo-ET. F، يسار ، مناطق مختارة لجمع التصوير المقطعي. الحق ، شريحة التصوير المقطعي من GDACs وتداخل CLEM المقابلة مضان من GDACs. ز, ح، عرض موسع وعالي الدقة (عامل binning 1) لـ GDAC في تراكبات التصوير المقطعي مع CLEM للمنطقة 1 من صورة مونتاج cryo-ET.

البيانات الموسعة الشكل 8 تحليل في الموقع cryo-ET لـ GDACs في شرائح تصوير مقطعي أكبر.

أ، أوجه التشابه المشتركة بين GDACs التي تم التحقق منها بواسطة CLEM (من البيانات الموسعة الشكل 7 ح) مع GDACs المحددة في الصور المقطعية التي تؤوي الغلاف النووي القريب للتحقق من موقعه داخل النواة (يمين ، من الشكل 3 هـ للمقارنة). تم تصوير حدود الكروماتين المحتملة أيضًا في كل من هياكل GDAC المحددة بشكل مستقل. ب، صور CLEM لشبكات EM المصنفة بخلايا HEK 293T المنقولة بواسطة CMV-EGFP-GBPL3 تستخدم لتوليد الرسم المقطعي في (أ، أعلى اليمين. عرض خلية واحدة للنواة المستخدمة للكشف عن GDACs في اللوحة اليمنى القصوى. بار ، 20 ميكرومتر. ج، صفيحة مطحونة بالألياف الزجاجية للنواة المختارة من CLEM أعلاه. د، أسفرت شريحة التصوير المقطعي للمنطقة المستطيلة المحددة 62 عن GDAC واحد محدد الحدود بالقرب من حدود الغلاف النووي الموضحة في (أ، يمين) وأنتجت صورًا مجزأة ثلاثية الأبعاد في الشكل 3 هـ.


شاهد الفيديو: هل هي موجات ذو الذنب - إشارات رادية غامضة لجسم فضائي غير معروف تصل الأرض من مركز المجرة!!!! (كانون الثاني 2022).